CN111840355A - 雷公藤多苷片在制备用于治疗car-t诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了雷公藤多苷片在制备用于治疗CAR‑T诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途。本发明研究发现以雷公藤多苷为主要成分的雷公藤多苷片对IL‑6、IL‑8、IL‑2、IL‑10、IL‑1β、IFNα、IFNγ等均能够快速遏制，起效快，口服低剂量雷公藤多苷片可以选择性清除外周血活化的单核细胞，快速遏制CAR‑T治疗后发生的CRS，对体内CAR‑T细胞不影响，可能为CRS提供一种起效快速、有效、安全、方便的治疗方法，同时也具有良好的成本效益比，能够大大降低患者的临床治疗费用。此外，对新型冠状病毒（COVID‑19）感染后的重症患者发生的CRS，也有望起到积极的治疗作用。

Description

雷公藤多苷片在制备用于治疗CAR-T诱发的细胞因子释放综 合征的药物上的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及雷公藤多苷片的医用新用途，更具体地，涉及雷公藤内酯醇在制备用于治疗CAR-T诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途。

背景技术

雷公藤多苷片的主要成分是雷公藤多苷(tripterygium glycosides)，其是从卫矛科植物雷公藤(Tripterygiumwilfordii Hook F，TwHF，LeiGongTeng，Thunder GodVine)根经氯仿/甲醇提取精制而成的一种稳定的糖苷，其生理活性由多种成分(二萜内酯、生物碱、三萜等)协同产生，既保留了雷公藤生药的免疫抑制等作用又去除了许多毒性成分。作为一种中成药，雷公藤多苷片已被证明是一种有效的抗炎和免疫调节药物，被中国国家食品药品监督管理局批准(Z32021007)用于治疗自身免疫性和炎症性疾病，自1982年起作为处方药在中国广泛应用，被用于治疗类风湿性关节炎、原发性肾小球肾病、肾病综合征、紫瘢性及狼疮性肾炎、红斑狼疮、亚急性及慢性重症肝炎、慢性活动性肝炎；亦可用于过敏性皮肤脉管炎、皮炎和湿疹，以及银屑病性关节炎、麻风反应、白塞氏病、复发性口疮、强直性脊柱炎等，近年来随着临床研究的深入，其应用范围不断扩大，如治疗儿童过敏性紫癜性肾炎、慢性荨麻疹、干燥综合征、Graves眼病等，都取得了一定疗效。

表达嵌合抗原受体的转基因T细胞开辟了癌症免疫治疗的新领域，但常并发细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome，CRS)，发生率高，表现为大量细胞因子短暂的、显著的升高以及一系列的临床症状，严重的可危及患者生命，是限制CAR-T细胞治疗广泛应用的主要不良事件。

CRS的治疗通常首先使用类固醇，对于以高热、低血压和低氧为特征的CRS，可以联合妥珠单抗输注治疗。近年来提出一系列的改良策略，包括对CAR-T改构以减少CRS的发生，中和去除体内GM-CSF，使用达沙替尼抑制CAR-T细胞等，但目前这些策略都仍难以较好地控制CRS。目前治疗CRS的方法主要是使用妥珠单抗(tocilizumab)和激素。应用妥珠单抗治疗CRS的效果并不理想，可能与其只能单一清除IL-6有关；激素可以比较有效地遏制CRS，但使用激素治疗CRS的同时也会导致大部分CAR-T细胞发生凋亡，影响CAR-T的长期疗效，同时易并发或加重感染。

近期的两个独立的模型系统证实小鼠体内单核细胞/巨噬细胞是CRS细胞因子的主要来源，应用氯膦酸脂质体清除小鼠体内的巨噬细胞和单核细胞可以阻止CRS的发生和致死，但氯膦酸脂质体因为毒副作用大不能用于人体；依托泊苷被认为较其它化疗药物更能够去除活化的单核细胞，但是效果也不甚理想，而且有加重造血抑制的潜在危害。因此目前仍缺乏能够选择性清除人体内单核细胞的有效药物。

以往的研究显示雷公藤多苷及雷公藤内酯醇具有免疫抑制作用，主要集中在对T细胞及B细胞的免疫调控作用方面，而对髓系细胞研究较少。2011年Titov等证实雷公藤内酯醇作用靶点为XPB，通过抑制RNA酶转录实现实现其生物学效应；2013年Lu等报道TAB1是雷公藤内酯醇的作用靶点，30nM雷公藤内酯醇体外处理12h可以抑制小鼠巨噬细胞TAK1激酶活性，提示TAB1可能是炎症性疾病的潜在治疗靶点。但目前尚不清楚雷公藤多苷能否清除人体内单核细胞而遏制CRS。

发明内容

发明目的：本发明意外发现了雷公藤多苷片在制备用于治疗CAR-T诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途。

具体地，本发明发现通过给予安全有效量的雷公藤多苷片可以有效治疗CAR-T诱发的细胞因子释放综合征。

雷公藤多苷片的主要成分为雷公藤多苷。

本发明所指的雷公藤多苷片为由雷公藤多苷作为主要成分制备而成的片剂，包括但不限于市售的雷公藤多苷片成品。

研究表明，雷公藤多苷片使用剂量每天0.25-2mg/kg体重，优选地，每天0.5-1mg/kg体重。

本发明的研究证实了雷公藤多苷片选择性清除CRS患者外周血中的单核细胞。

更进一步地，本发明研究发现雷公藤多苷片改善CAR-T治疗后发生的CRS引起的高烧、低氧、低血压和细胞因子风暴，并遏制IL-6、IL-8、IL-2、IL-10、IL-1β、IFNα、IFNγ，从而缓解CRS，降低死亡率。

有益效果：

本发明研究发现雷公藤多苷片对IL-6、IL-8、IL-2、IL-10、IL-1β、IFNα、IFNγ等均能够快速遏制，起效快，口服低剂量雷公藤多苷片可以选择性清除外周血活化的单核细胞，快速遏制CAR-T治疗后发生的CRS，对体内CAR-T细胞不影响，可能为CRS提供一种起效快速、有效、安全、方便的治疗方法，同时也具有良好的成本效益比，能够大大降低患者的临床治疗费用。

值得进一步注意的是，新型冠状病毒(COVID-19)感染患者与CAR-T治疗后发生的CRS具有相似的临床表现，伴有高烧、低氧和低血压，并伴有细胞因子风暴，我们的发现对COVID-19感染的治疗具有启发性。

附图说明

图1为雷公藤多苷片对患者血液中单核细胞和CAR-T细胞的影响的结果图；

图2为回输CAR-T细胞后接受雷公藤多苷片治疗患者骨髓MRD检测的结果图；

图3为雷公藤多甙片治疗快速缓解CRS的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中使用的雷公藤多苷片为浙江得恩德制药有限公司生产，中药准字Z33020422，10mg/片。

实施例1雷公藤多苷片体内选择性清除患者外周血单核细胞，而不影响CAR-T细胞。

1)CAR-T细胞输注后诊断CRS的2例患者，给予口服低剂量雷公藤多苷片治疗，每天三次，每次10毫克口服(每日总剂量0.5mg/kg)，在36小时内服用5片雷公藤多苷片(50毫克)后停药。

2)服药前后不同时间点抽取抗凝外周血血常规检测，此外各取抗凝外周血200μl，加入5ml流式细胞管，加入荧光标记抗体HLA-DR-PE、CD14-FITC，冰上孵育30min，裂解红细胞后，流式细胞仪检测。

3)qPCR测定CAR-T细胞拷贝数：服药前后不同时间点采集EDTA抗凝全血标本，从PBMC中提取基因组DNA。为了量化单位DNA的拷贝数，将10²到10⁶拷贝的CTL019慢病毒质粒插入100ng未经转化的对照基因组DNA中，形成5点标准曲线。qPCR分析采用SYBR-Green法，每个时间点用100ng基因组DNA检测CD19-CAR基因的整合序列。CDKN1A基因和WPRE上游非转录基因组区特异性引物，如下所述。

CDKN1A:Forward:gaaagctgactgcccctatttg，Reverse:gagaggaagtgctgggaacaat；

WPRE:Forward:ccttttacgctatgtggatacg，Reverse:ccaggatttatacaaggaggaga。

4)MRD分析：多参数流式细胞仪监测MRD，Kaluza软件分析。用于检测微小残留疾病的抗体组为患者1的c-kappa、c-lambda、CD38、CD45、CD19、CD27、CD138、CD56，以及患者2的HLA-DR、CD13、CD33、CD19、CD10、CD34、CD20、CD45。

5)结果：

CAR-T细胞输注后诊断CRS的2例患者接受口服低剂量雷公藤多苷片治疗，流式细胞仪分析表明雷公藤多甙片可以选择性地去除患者体内的单核细胞(图1A，图1B)，而不影响CAR-T细胞细胞的数量(图1C，图1D)。同时在CAR-T输注3周后两名患者骨髓中的白血病微小残留(MRD)检测结果均为阴性(图2)，表明雷公藤多甙片治疗不影响CAR-T细胞的抗肿瘤功能。

实施例2雷公藤多苷片快速遏制CRS。

患者1于2017年被诊断为多发性骨髓瘤(IgD,lambda型)，年龄53岁。他的基线核型是46，XY，+add(1)(p11)，-3，del(3)(q13)，add(9)(q34)，del(11)(p12)，add(14)(q32)，-17，18，add(20)(q11)，add(22)(q11)，+2mar，inc[20]。患者最初对来那度胺、硼替佐米和地塞米松治疗有部分反应，但6个月后病情恶化。然后接受3个周期的VCLD方案化疗(硼替佐米、环磷酰胺、来那度胺和地塞米松)。随后的治疗方案包括来那度胺、博马度胺、美法仑、长春花碱、表阿霉素和亚砷酸。患者骨质破坏和贫血加重，骨髓活检显示多发性骨髓瘤细胞52％。2019年11月，患者参加了抗CD19/BCMA-CAR-T细胞治疗的临床试验。患者自体T细胞经慢病毒转染分别表达CD19特异性嵌合抗原受体和BCMA特异性嵌合抗原受体，并用抗CD3和抗CD28抗体扩增。在细胞输注前2天，患者接受了化疗预处理(氟达拉滨剂量为30mg/m²体表面积，环磷酰胺剂量为600mg/m²)，其后患者输注7.75×10⁷CD3+细胞(每公斤0.52×10⁶CD19-CART细胞)，随后输注7.75×10⁷CD3+细胞(每公斤0.52×10⁶BCMA-CART细胞)。

患者在CAR-T细胞输注后第4天出现CRS症状，症状包括发烧伴寒颤，疲劳，肌痛，全身乏力，持续性心动过速(每分钟141次搏动的脉冲峰值)，呼吸急促，间歇性缺氧但对吸氧反应(3L/min)。自第6天起持续高热，最高温度为39.9℃，口服对乙酰氨基酚不能退热，并出现持续低血压(收缩压降至78mmHg)及细胞因子风暴，即IL-6上升至70×ULN，并出现肝肾功能损伤，患者诊断为四级CRS。持续高热(>38.5℃)48小时后，即第8天给予患者口服低剂量雷公藤多苷片(浙江得恩德制药有限公司，中药准字Z33020422，10mg)治疗，每天三次，每次10毫克口服(每日总剂量0.5mg/kg)，在36小时内服用5片雷公藤多苷片(50毫克)后停药。

结果：

患者在第一次口服雷公藤多苷片后仅8小时体温就第一次降到正常水平(图3A)，在最后一次服用雷公藤多苷片后72小时，IL-6和IFN-γ水平恢复正常，IL-8和IL-10水平也接近正常(图3B)，但患者的肝和肾功能损害继续进展，患者接受了甲泼尼龙和连续性肾脏替代治疗，12小时后体温和血清细胞因子水平恢复正常，PCT、LDH、CRP等炎症指标快速下降并恢复正常(图3C)，肝肾功能逐渐恢复正常(图3D)。

实施例3雷公藤多苷片治疗快速遏制CRS。

本实施例患者2为55岁女性，2017年诊断为B-ALL。患者开始接受治疗后获得完全缓解，但在最初诊断为B-ALL后15个月复发。她对再次化疗和进一步强化化疗没有反应，包括长春地辛、表阿霉素和环磷酰胺。患者参加了抗CD19-CAR-T细胞治疗的临床试验。患者自体T细胞经慢病毒转染分别表达CD19特异性嵌合抗原受体。在细胞输注前2天，患者接受了化疗预处理(氟达拉滨剂量为30mg/m²体表面积，环磷酰胺剂量为600mg/m²),其后患者输注1.31×10⁶CD3+细胞(每公斤0.52×10⁶CD19-CART细胞)。

患者在回输CAR-T细胞后第7天患者出现高热，口服对乙酰氨基酚不能退热，患者诊断为二级CRS。回输CAR-T细胞后第9天，给予患者口服雷公藤多苷片治疗。每天三次，每次10毫克口服(每日总剂量0.5mg/kg)，在36小时内服用5片雷公藤多苷片(50毫克)后停药。

结果：

患者在首次服用雷公藤多苷片后36小时，她的心动过速消失，体温降至正常(图3A)，细胞因子风暴迅速缓解，IL-2和IFN-α恢复正常，IL-10和IL-1β在第一次口服雷公藤多苷片后60小时恢复了正常(图3B)，PCT、LDH、CRP等炎症指标快速下降并恢复正常(图3C)，治疗期间没有出现肝肾功能损伤(图3D)。

综上所述，雷公藤多苷片可以在体内选择性地清除激活的单核细胞，从而迅速缓解CRS，而不影响功能正常的CAR-T细胞的数量和活性。值得进一步注意的是，新型冠状病毒(COVID-19)感染患者与CAR-T治疗后发生的CRS具有相似的临床表现，伴有高烧、低氧和低血压，并伴有细胞因子风暴，我们的发现对COVID-19感染的治疗具有启发性。

Claims (3)

1.雷公藤多苷片在制备用于治疗CAR-T诱发的细胞因子释放综合征的药物上的用途。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述雷公藤多苷片选择性清除细胞因子释放综合征患者外周血中的单核细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述雷公藤多苷片改善CAR-T治疗后发生的细胞因子释放综合征引起的高烧、低氧、低血压和细胞因子风暴，并遏制IL-6、IL-8、IL-2、IL-10、IL-1β、IFNα、IFNγ。

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