CN111840274A - 巴伐洛霉素a1在制备增强7-脱氧水仙环素的抗肝癌活性药物中的应用 - Google Patents

巴伐洛霉素a1在制备增强7-脱氧水仙环素的抗肝癌活性药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了巴伐洛霉素A1在制备增强7‑脱氧水仙环素的抗肝癌活性药物中的应用。该抗肝癌活性药物含有巴伐洛霉素A1和7‑脱氧水仙环素。巴伐洛霉素A1和7‑脱氧水仙环素联合用药的肝癌细胞凋亡率比巴伐洛霉素A1单独用药的肝癌细胞凋亡率与7‑脱氧水仙环素单独用药的肝癌细胞凋亡率之和还要高，巴伐洛霉素A1和7‑脱氧水仙环素在抗肝癌方面产生了协同作用，巴伐洛霉素A1增强了7‑脱氧水仙环素的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性，7‑脱氧水仙环素增强了巴伐洛霉素A1的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性。本发明的治疗或/和预防肝癌的药物对肝癌细胞具有显著的抑制活性巴伐洛霉素A1和7‑脱氧水仙环素在抗肝癌方面产生了协同作用。

Description

巴伐洛霉素A1在制备增强7-脱氧水仙环素的抗肝癌活性药物 中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域中巴伐洛霉素A1在制备增强7-脱氧水仙环素的抗肝癌活性药物中的应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是全球最常见的侵袭性肿瘤之一。肝癌是一种高度致命的肿瘤，其中位生存率在诊断后仍保持在1年以下。迄今为止，针对肝癌的治疗策略主要包括切除术，移植术，局部消融术和化疗。由于肝癌的早期症状不明显，一旦出现典型的临床症状，大多数肝癌患者被诊断为晚期阶段，失去手术机会，及时接受过手术的患者多数仍会发生复发和转移。在化学治疗剂中，索拉非尼是一种小分子多激酶抑制剂，被认为是一种积极的治疗方法，是延长晚期肝癌患者生存期延长的唯一批准的全身药物。然而，索拉非尼治疗晚期肝癌患者的预期寿命仅为8-11个月。在过去几十年中，尽管肝癌患者常规治疗方案取得了显着进展，但由于治疗有限，预后差，复发率高，仍然是全球最致命的恶性肿瘤之一。新的有效和有希望的治疗策略仍然需要在全球范围内进行深入的探索。
巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1)是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素,分子式C35H58O9,是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂,具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。7-脱氧水仙环素属于异喹诺酮类生物碱，据相关研究结果显示其具有较强的抗肿瘤作用,可以有效抑制人类多种肿瘤细胞的增殖，而且具有高效低毒的特点。7-脱氧水仙环素对肝癌细胞株HepG2具有很强的细胞增殖抑制作用(付卡利.中国水仙化学成分与生物活性研究.第二军医大学硕士学位论文.2013)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何增强7-脱氧水仙环素或巴伐洛霉素A1的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性。
为了解决以上技术问题，本发明提供了巴伐洛霉素A1在制备增强7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性的药物中的应用。
上述应用中，所述药物可含有巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
上述应用中，所述药物的活性成分可为巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
为了解决以上技术问题，本发明提供了7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐在制备增强巴伐洛霉素A1的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性的药物中的应用。
上述应用中，所述药物可含有巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
上述应用中，所述药物的活性成分可为巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了一种治疗或/和预防肝癌的药物。
本发明所提供的治疗或/和预防肝癌的药物含有C和B，所述C为巴伐洛霉素A1，所述B为7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
上述治疗或/和预防肝癌的药物中，所述药物的活性成分可为所述C和所述B。
本发明还提供了C和B在制备治疗或/和预防肝癌的药物中的应用，所述C为巴伐洛霉素A1，所述B为7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
上述应用中，所述药物可含有所述C和所述B。
上述应用中，所述药物的活性成分可为所述C和所述B。
下述U1、U2、和U3也属于本发明的保护范围：
U1、巴伐洛霉素A1在制备促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞凋亡药物中的应用，或巴伐洛霉素A1在促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞凋亡药物中的应用。
U2、巴伐洛霉素A1在制备抑制肝癌细胞的上皮-间质转换药物中的应用，巴伐洛霉素A1在抑制肝癌细胞的上皮-间质转换中的应用。
U3、巴伐洛霉素A1在制备促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞的上皮-间质转换药物中的应用，或巴伐洛霉素A1在促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞的上皮-间质转换中的应用。
上述各种药物中，巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐可分别独立包装，也可混合在一起。
上述各种药物中，巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐二者之间的配比，本领域技术人员可以根据抗肝癌或抗肝癌细胞的效果确定，如巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐的配比可为11nmol:9989nmol。
上述各种药物可含有药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为冻干保护剂糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如甘油、甘露糖醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；磷脂，如卵磷脂，大豆磷脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，硬脂酰胺；胆固醇；大分子高聚物，如聚乙烯亚胺，壳聚糖，透明质酸；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等；生理盐水、甘油和磷酸盐缓冲盐水。
上文中，所述7-脱氧水仙环素的结构式为式1：
Figure BDA0002039962220000031
本申请中，抗肝癌、抗肝癌细胞、抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性具体可为促进肝癌细胞凋亡和/或促进肝癌细胞自噬和/或降低肝癌细胞活力。
实验证明，巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素联合用药的肝癌细胞凋亡率比巴伐洛霉素A1单独用药的肝癌细胞凋亡率与7-脱氧水仙环素单独用药的肝癌细胞凋亡率之和还要高，巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素在抗肝癌方面产生了协同作用，巴伐洛霉素A1增强了7-脱氧水仙环素的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性，7-脱氧水仙环素增强了巴伐洛霉素A1的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性。本发明的治疗或/和预防肝癌的药物(简称为7-脱氧水仙环素+BA1)对肝癌细胞具有显著的抑制活性巴伐洛霉素A1和7-脱氧水仙环素在抗肝癌方面产生了协同作用。
附图说明
图1为7-脱氧水仙环素的氢谱。
图2为7-脱氧水仙环素的碳谱。
图3为7-脱氧水仙环素和BA1单独处理和联合处理的HepG2,Huh-7细胞凋亡测定图。
图4为分别在给予7-脱氧水仙环素10μM处理0、12、24、48、72h，通过MTT测定的HepG2,Huh-7细胞存活率。
图5为HepG2,Huh-7给予7-脱氧水仙环素10μM处理48h的单克隆形成实验检测结果。
图6为对HepG2,Huh-7分别给予7-脱氧水仙环素10μM处理0、12、24、48、72h的细胞凋亡测定图。
图7为蛋白质印迹分析凋亡标记降解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase-3)、PARP、促凋亡相关因子Bax和抑凋亡相关因子Bcl-2表达量。
图8为蛋白质印迹分析HepG2和HuH-7中p62、LC-3B和Actin(作为内参)表达量。
图9为透射电子显微镜分析。
图10为免疫荧光染色分析肝细胞肝癌中LC-3B的表达量。
图11为蛋白质印迹分析HepG2和HuH-7中E-cad，N-cad和VIM表达量。
图12为免疫荧光染色分析HepG2和HuH-7中E-cad，N-cad和VIM的表达量。
图13为免疫荧光染色分析HepG2和HuH-7中E-cad和VIM的表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的材料和方法如下：
细胞培养和细胞处理：人类HCC细胞系HepG2，HuH-7为ATCC产品。细胞在1个月内复苏。通过PCR扩增的短串联重复分析鉴定细胞系。在含有5％CO2的加湿氛围中，将HepG2培养在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基(在MEM中加入FBS、青霉素和链霉素，至FBS的提交含量为10％，青霉素和链霉素的含量均为1％得到的液体培养基)中、将HuH-7培养在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基(在DMEM中加入FBS、青霉素和链霉素，至FBS的提交含量为10％，青霉素和链霉素的含量均为1％得到的液体培养基)中，并维持温度在37℃。
下述实施例中的7-脱氧水仙环素的结构式为式1：
Figure BDA0002039962220000041
7-脱氧水仙环素按照如下方法制备：石蒜药材(石蒜(Lycoris radiata)的干燥鳞茎)8.5kg，8倍质量量的95％乙醇水溶液回流提取两次，每次提取1小时，收集提取液，用旋转蒸发仪旋转蒸发除去提取液中的乙醇，得总提取物。总提取物用2L水分散，用盐酸将溶液pH值调节至2，用等体积的氯仿萃取两次，收集水相用NaOH溶液调节pH值调节至12，再用等体积的氯仿萃取两次，收集氯仿相用旋转蒸发仪旋转蒸发除去氯仿相中的氯仿，即得到总生物碱。将总生物碱部位(50g)进行正向硅胶柱层析分离(开放色谱柱规格6.5cm×20cm)，正向硅胶柱层析中所用的硅胶是硅胶H，采用二氯甲烷/甲醇系统进行如下3个梯度的分步洗脱：a1、用700mL二氯甲烷进行洗脱；a2、用1100mL的由二氯甲烷和甲醇按照90:10的体积比组成的流动相进行洗脱，a3、用600mL的由二氯甲烷和甲醇按照85:15的体积比组成的流动相进行洗脱。从洗脱程序开始不间断收集洗脱出的液体，每管收集100ml(100ml/流份)，连续收集24个流份，记为：Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、……、Fr.24，TLC检测指导合并相同流份，最后得到6个合并组分：Fr.1-3，Fr.4-7，Fr.8-10，Fr.11-13，Fr.14-19，Fr.20-24。
将Fr.20-24进行制备型高效液相色谱分离(RP-C18液相制备分离)。该制备型高效液相色谱分离所用的填料是十八烷基硅烷键合硅胶填料，填料的粒径为5μm，该制备型高效液相色谱分离所用的层析柱直径为8mm，高为250mm。流动相为由甲醇、水和氨水按照25:75:0.1的体积比组成的混合液体；流速为4.5mL/min。收集tR(保留时间)为9.2分钟的洗脱峰，用旋转蒸发仪(温度：40℃，转数：70转)旋转蒸发除去甲醇和水和氨水，得到7-脱氧水仙环素5.6mg。
该7-脱氧水仙环素为白色无定形粉末，碘化铋钾试剂显红色。1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ:6.11(1H，overlap，H-1)，4.03(1H，m，H-2)，3.80(1H，m，H-3)，4.18(1H，m，H-4)，3.71(1H，H-5)，7.26(1H，s，H-8)，7.32(1H，s，H-11)，6.11(2H，overlap,OCH2O)；13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)δ:121.9(C-1)，69.1(C-2)，72.5(C-3)，69.1(C-4)，52.7(C-5)，163.0(C-7)，123.6(C-7a)，103.2(C-8)，147.6(C-9)，150.9(C-10)，106.1(C-11)，131.6(C-11a)，129.9(C-11b)，101.8(OCH2O)(图1和图2)。ESI-MS:m/z:314.1[M+Na]+，290.3[M-H]-。7-脱氧水仙环素的分子量为291，分子式为C14H13NO6。
7-脱氧水仙环素用二甲基亚砜(DMSO)溶解制备为10mM储备溶液，并以等分试样储存在-20℃，处理细胞时，培养基稀释后即用；给小鼠注射时，用生理盐水稀释至相应的浓度。巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1，下文简称BA1)为Selleck(London，ON，Canada)产品。BA1用二甲基亚砜(DMSO)溶解制备为20mM储备溶液，处理细胞时，培养基稀释后即用。
通过MTT法测定细胞活力(细胞的存活率)：给予药物或空白处理后，向待测细胞中加入MTT溶液并在37℃下孵育4小时。然后取出培养皿。加入100ul DMSO，用酶标仪测定样品在490nm处的吸光度。以空白处理的细胞存活率为100％，计算其它处理的相对存活率。其中，MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四唑溴化物)试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。
细胞凋亡测定：通过使用Annexin V/PI(BD Biosciences)染色细胞来测量细胞凋亡，并用流式细胞分析仪并根据制造商的说明书进行细胞计数、细胞周期及细胞凋亡分析。
单克隆形成实验(集落形成测定)：将肿瘤细胞接种到6孔板中并培养到合适密度，然后用指定浓度的药剂处理细胞48小时。用新鲜培养基冲洗后，形成集落，用4％多聚甲醛固定，用0.1％结晶紫染色，然后在指定时间内计数统计处理。
免疫荧光测定：将给予一定处理后的细胞用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，然后再与0.5％Triton X-100在PBS中孵育，之后用5％BSA封闭30分钟。将载玻片在4℃下用抗LC-3B抗体染色过夜，随后在室温下用Alexa-Fluor 488缀合的山羊抗兔IgG抗体染色1小时。用2.5μg/mL DAPI(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)对核进行染色，并通过倒置荧光显微镜(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)显色。
下述实施例中使用的抗体如下：用于检测自噬标记物P62(Sequestosome 1，泛素结合蛋白)的抗体为SQSTM1/p62(D5E2)抗体为CST公司(Danvers，MA，USA)产品，用于检测自噬标记物LC3B(Microtubule associated protein 1light chain 3，微管相关蛋白泛素结合蛋白)的抗体兔抗LC3B抗体、用于检测多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的抗体兔抗PARP抗体、用于检测波形蛋白(VIM)的抗体兔抗Vimentin抗体、用于检测β-肌动蛋白的抗体兔抗β-actin抗体、用于检测抑凋亡相关因子Bcl-2(B-Cell CLL/Lymphoma 2)的抗体兔抗Bcl-2抗体、用于检测E-cad(E-Cadherin，上皮型钙黏附蛋白)的抗体兔抗E-cadherin抗体和用于检测N-cad(N-Cadherin，神经型钙黏附蛋白)的抗体兔抗N-cadherin抗体均为英国Abcam公司产品，用于检测降解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase 3)的抗体兔抗Cleaved-casepase3抗体和用于检测促凋亡相关因子Bax(BCL2Associated X Protein)的抗体兔抗Bax抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品。
下述实施例中的实验如无特别说明，均设三次重复，数据采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。
实施例1、BA1增强了7-脱氧水仙环素的抗肝癌细胞活性
1、制备名称为7-脱氧水仙环素+BA1的治疗或/和预防肝癌的药物
本实施例提供了一种治疗或/和预防肝癌的药物(简称为7-脱氧水仙环素+BA1)，其活性成分为BA1和7-脱氧水仙环素，该治疗或/和预防肝癌的药物中，BA1和7-脱氧水仙环素的配比为11nmol:9989nmol。该治疗或/和预防肝癌的药物的制备方法如下：
1.1 7-脱氧水仙环素溶液的制备
7-脱氧水仙环素用二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到7-脱氧水仙环素浓度为10mmol/L的7-脱氧水仙环素溶液。
1.2 BA1溶液的制备
BA1用二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到BA1浓度为15μmol/L的BA1溶液。
1.3治疗或/和预防肝癌的药物(简称为7-脱氧水仙环素+BA1)的制备
将1.1的7-脱氧水仙环素溶液与1.2的BA1溶液混合，得到的液体即为治疗或/和预防肝癌的药物(简称为7-脱氧水仙环素+BA1)。7-脱氧水仙环素+BA1中，BA1和7-脱氧水仙环素的配比为11nmol:9989nmol。
2、BA1增强了7-脱氧水仙环素的抗肝癌细胞活性
实验设如下处理：对照处理、7-脱氧水仙环素单独处理、BA1单独处理、7-脱氧水仙环素和BA1联合处理。
具体实验方法如下：
HepG2的对照处理：将HepG2细胞用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基在37℃培养24小时，更换培养基，再用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基在37℃培养48小时，收集细胞，得到HepG2的对照处理细胞(简称CK组)。
Huh-7的对照处理：将Huh-7细胞用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃培养24小时，更换培养基，再用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃培养48小时，收集细胞，得到Huh-7的对照处理细胞(简称CK组)。
HepG2的7-脱氧水仙环素单独处理：将HepG2细胞用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基在37℃培养24小时，更换培养基，再用含7-脱氧水仙环素培养基在37℃培养48小时，收集细胞，得到HepG2的7-脱氧水仙环素单独处理细胞(简称7-DONCS组)。其中，含7-脱氧水仙环素培养基是向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基中加入1.1的7-脱氧水仙环素溶液至7-脱氧水仙环素的浓度为9989nmol/L，得到的液体。
Huh-7的7-脱氧水仙环素单独处理：将Huh-7细胞用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃培养24小时，更换培养基，再用含7-脱氧水仙环素培养基在37℃培养48小时，收集细胞，得到Huh-7的7-脱氧水仙环素单独处理细胞(简称7-DONCS组)。其中，含7-脱氧水仙环素培养基是向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入1.1的7-脱氧水仙环素溶液至7-脱氧水仙环素的浓度为9989nmol/L，得到的液体。
HepG2的BA1单独处理：将HepG2细胞用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基在37℃培养24小时，更换培养基，再用含BA1培养基在37℃继续培养48小时，收集细胞，得到HepG2的BA1单独处理细胞(简称BA1组)。其中，含BA1培养基是向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基中加入1.2的BA1溶液至BA1的浓度为11nmol/L，得到的液体。
Huh-7的BA1单独处理：将Huh-7细胞用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃培养24小时，更换培养基，再用含BA1培养基在37℃继续培养48小时，收集细胞，得到Huh-7的BA1单独处理细胞(简称BA1组)。其中，含BA1培养基是向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入1.2的BA1溶液至BA1的浓度为11nmol/L，得到的液体。
HepG2的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理：将HepG2细胞用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基在37℃培养24小时，更换培养基，再用含7-脱氧水仙环素和BA1培养基在37℃继续培养48小时，收集细胞，得到HepG2的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理细胞(简称7-DONCS+BA1组)。其中，含7-脱氧水仙环素和BA1培养基是向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的MEM培养基中加入1.3的治疗或/和预防肝癌的药物至BA1的浓度为11nmol/L、7-脱氧水仙环素的浓度为9989nmol/L，得到的液体。
Huh-7的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理：将Huh-7细胞用含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃培养24小时，更换培养基，再用含7-脱氧水仙环素和BA1培养基在37℃继续培养48小时，收集细胞，得到Huh-7的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理细胞(简称7-DONCS+BA1组)。其中，含7-脱氧水仙环素和BA1培养基是向含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中加入1.3的治疗或/和预防肝癌的药物至BA1的浓度为11nmol/L、7-脱氧水仙环素的浓度为9989nmol/L，得到的液体。
将HepG2的对照处理细胞、HepG2的7-脱氧水仙环素单独处理细胞、HepG2的BA1单独处理细胞、HepG2的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理细胞、Huh-7的对照处理细胞、Huh-7的7-脱氧水仙环素单独处理细胞、Huh-7的BA1单独处理细胞以及Huh-7的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理细胞这8种细胞分别通过MTT法测定细胞活力，通过使用Annexin V/PI(BDBiosciences)凋亡检测试剂盒来测量细胞凋亡。MTT法测定细胞活力中，分别以HepG2的对照处理细胞和Huh-7的对照处理细胞的存活率为100％，统计其它处理的相对存活率。细胞凋亡测定中，以左下角象限的细胞为存活细胞，其它三个象限的细胞为凋亡细胞，统计存活率和凋亡率，按照如下公式计算凋亡提高率：凋亡提高率(％)＝(药剂处理细胞的凋亡率-对照处理细胞的凋亡率)/对照处理细胞的凋亡率×100。
表1.MTT法测定的各处理细胞的存活率
Figure BDA0002039962220000091
表2.凋亡检测试剂盒测定的各处理细胞的存活率和凋亡率
Figure BDA0002039962220000092
结果如表1、表2和图3所示，表明HepG2细胞的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理细胞的凋亡提高率(730.25％)显著高于HepG2的7-脱氧水仙环素单独处理细胞的凋亡提高率(487.37％)和HepG2的BA1单独处理细胞的凋亡提高率(9.07％)之和(487.37％±9.07％＝496.44％)；Huh-7细胞的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理细胞的凋亡提高率(1444.82％)显著高于Huh-7的7-脱氧水仙环素单独处理细胞的凋亡提高率(782.35％)和Huh-7的BA1单独处理细胞的凋亡提高率(44.26％)之和(782.35％±44.26％＝826.61％)。说明本发明的治疗或/和预防肝癌的药物(简称为7-脱氧水仙环素+BA1)对肝癌细胞具有显著的抑制活性，BA1显著增强了7-脱氧水仙环素的抗肝癌活性，7-脱氧水仙环素显著增强了BA1的抗肝癌活性，BA1和7-脱氧水仙环素在抗肝癌方面产生了协同作用。
实施例2、7-脱氧水仙环素抗肝癌活性
1、7-脱氧水仙环素抑制了肝细胞肝癌的生长和促进了肝细胞肝癌的凋亡
通过MTT法测定细胞活力，分析7-脱氧水仙环素对两种典型的人类肝癌细胞系(HepG2,Huh-7)的生长抑制作用。将HepG2,Huh-7细胞在对数生长期时分别种板，然后分别在给予7-脱氧水仙环素10μM处理，在0、12、24、48、72h后，分别用MTT法测定细胞活力，结果表明10μM的7-脱氧水仙环素处理0、12、24、48、72小时，肝癌细胞存活能力有时间依赖的下降趋势(图4)。取其中的7-脱氧水仙环素处理48小时的HepG2,Huh-7进行单克隆形成实验检测，结果表明7-脱氧水仙环素处理HepG2,Huh-748小时，可以显著抑制HepG2,Huh-7的细胞增殖(图5，空白组为10μM的7-脱氧水仙环素处理0小时，7-脱氧水仙环素为7-脱氧水仙环素处理48小时)。用含有10μM 7-脱氧水仙环素的培养基分别培养HepG2,Huh-70、24、48、72小时,流式细胞仪分析和蛋白免疫印迹分析促进了细胞凋亡(图6和图7)。
2、7-脱氧水仙环素促进了肝癌细胞肝癌的自噬
除了细胞凋亡外，自噬是细胞应激反应的程序性细胞死亡的另一种模式。首先通过评价LC-3B和p62(两种经典的自噬标记物)来研究7-脱氧水仙环素对自噬体形成的影响，将HepG2,Huh-7细胞在对数生长期时分别种板，然后分别在给予7-脱氧水仙环素(10μM)处理，在0、12、24、48、72h后，取细胞分别用SQSTM1/p62(D5E2)抗体、兔抗LC3B抗体和兔抗β-actin抗体进行蛋白质印迹分析p62、LC-3B和Actin(作为内参)表达量，结果表明7-脱氧水仙环素可以上调LC-3B的表达并呈一定的时间依赖型，而p62的表达显著降低(图8)。为了进一步验证7-脱氧水仙环素诱导的自噬，通过透射电子显微镜研究了肝癌细胞内形态学变化。方法如下：用分别含有0和10μM的7-脱氧水仙环素的培养基分别培养HepG2,Huh-7 48小时，用4％戊二醛固定细胞。在超薄切片机中切割超薄(50nm)切片，并用1％乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。最后，通过电子显微镜Hitachi H-7650(Hitachi，Tokyo，Japan)测定切片。结果表明与正常组细胞(0μM 7-脱氧水仙环素处理的细胞，图9中用Control表示的细胞)相比，10μM 7-脱氧水仙环素处理的细胞(图9中用7-DONCS表示的细胞)双膜囊泡有着显著的积累(含有亚细胞物质)。
为了确定自噬通量，根据制造商(上海吉凯基因化学技术)的说明书用自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染细胞HepG2,Huh-7。然后将转染的细胞分别用含有0和10μM的7-脱氧水仙环素的培养基分别培养48小时。随后，将这些细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，并用PBS洗涤。最后，用激光扫描共焦显微镜(Olympus FV1000，Tokyo，Japan)对GFP/mRFP图像进行显像。其中，mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，红绿荧光Merge后出现的黄色斑点即是自噬体，红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。另外，用分别含有0和10μM的7-脱氧水仙环素的培养基分别培养HepG2,Huh-7 48小时，用DAPI对细胞进行细胞核染色，10分钟后，用抗LC-3B(D11)抗体对细胞进行免疫荧光检测。结果表明使用串联mRFP-GFP标记的LC-3，7-脱氧水仙环素处理后，导致LC-3-II转化增加，促进LC-3脂化和斑点，以及积累的黄色点状自噬体(图10)。
总之，这些结果表明，7-脱氧水仙环素促进了肝癌细胞肝癌的自噬。
3、7-脱氧水仙环素抑制了肝癌细胞肝癌的上皮间质转化
近年来，许多的研究数据表明上皮-间质转换(epithelial–mesenchymaltransitions，EMT)在肿瘤组织细胞的发生发展(cellular plasticity)过程中也起到了重要作用，比如和肿瘤转移或致死率等有关。首先通过评价VIM,E-cad和N-cad(三种经典的EMT标记物)来研究7-脱氧水仙环素对EMT过程形成的影响，将HepG2,Huh-7细胞在对数生长期时分别种板，然后分别在给予7-脱氧水仙环素(10μM)处理，在0、12、24、48、72h后，取细胞分别用兔抗Vimentin抗体,兔抗E-cadherin抗体，兔抗N-cadherin抗体和兔抗β-actin抗体进行蛋白质印迹分析VIM,E-cad，N-cad和Actin(作为内参)表达量，结果表明7-脱氧水仙环素可以上调E-cad的表达并呈一定的时间依赖型，而VIM，N-cad的表达显着降低(图11)。为了进一步验证7-脱氧水仙环素在EMT中所起的作用，用分别含有0和10μM的7-脱氧水仙环素的培养基分别培养HepG2,Huh-7 48小时，用DAPI对细胞进行细胞核染色，10分钟后，用兔抗Vimentin抗体,兔抗E-cadherin抗体，兔抗N-cadherin抗体对细胞进行免疫荧光检测。结果表明与蛋白质印迹测定结果一致(图12，Control表示0μM 7-脱氧水仙环素处理的细胞，7-DONCS表示10μM 7-脱氧水仙环素处理的细胞)。
总之，这些结果表明，7-脱氧水仙环素抑制了肝癌细胞肝癌的EMT过程。
实施例3、抑制自噬可以进一步促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞肝癌的凋亡和抑制肝癌细胞肝癌的EMT。
研究凋亡，自噬和EMT三者之间的关系，在此研究中发现，自噬抑制剂BA1可以进一步促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞肝癌的凋亡和抑制肝癌细胞肝癌的EMT(图13)。具体方法如下：取实施例1的HepG2的对照处理细胞、HepG2的7-脱氧水仙环素单独处理细胞、HepG2的BA1单独处理细胞、HepG2的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理细胞、Huh-7的对照处理细胞、Huh-7的7-脱氧水仙环素单独处理细胞、Huh-7的BA1单独处理细胞以及Huh-7的7-脱氧水仙环素和BA1联合处理细胞这8种细胞用DAPI对细胞进行细胞核染色，10分钟后，用抗VIM,E-cad抗体对细胞进行免疫荧光检测。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.C在制备增强B的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性的药物中的应用，所述C为巴伐洛霉素A1，所述B为7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
2.B在制备增强C的抗肝癌活性或抗肝癌细胞活性的药物中的应用，所述C为巴伐洛霉素A1，所述B为7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
3.治疗或/和预防肝癌的药物，其特征在于：所述药物含有C和B，所述C为巴伐洛霉素A1，所述B为7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：所述药物的活性成分为所述C和所述B。
5.C和B在制备治疗或/和预防肝癌的药物中的应用，所述C为巴伐洛霉素A1，所述B为7-脱氧水仙环素或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物含有所述C和所述B。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物的活性成分为所述C和所述B。
8.巴伐洛霉素A1在制备促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞凋亡药物中的应用，或巴伐洛霉素A1在促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞凋亡药物中的应用。
9.巴伐洛霉素A1在制备抑制肝癌细胞的上皮-间质转换药物中的应用，巴伐洛霉素A1在抑制肝癌细胞的上皮-间质转换中的应用。
10.巴伐洛霉素A1在制备促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞的上皮-间质转换药物中的应用，或巴伐洛霉素A1在促进7-脱氧水仙环素诱导的肝癌细胞的上皮-间质转换中的应用。
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