CN111830118B - 一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法，属于植物呼吸测定方法领域。本发明能够模拟自然状态来准确测定和量化豆科植物根系质子分泌能力的大小。首先把不同豆科植物品种或同种豆科植物的不同品种在石英砂中培养，通过碱液收集根际产生的CO₂气体，碱液吸收的CO₂气体包括根系呼吸产生的CO₂、根系释放的质子与碳酸盐反应产生的CO₂两部分，然后测定碱液中稳定碳同位素δ¹³C值，根据CaCO₃的稳定碳同位素δ¹³C值与C3植物的δ¹³C值之间差异很大，通过计算可得出根系质子的释放量。

Description

一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法

技术领域

本发明涉及植物呼吸测定方法技术领域，尤其涉及一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法。

背景技术

根际pH的变化主要由于植物根系养分吸收相耦联的质子和有机酸的分泌作用引起的，植物根系分泌质子(H⁺)是降低根际pH的直接因素，不同植物种类和品种根系分泌质子强弱不同，如何监测和准确判断不同植物根系释放质子能力的大小，一直是研究人员试图解决的问题。目前，检测植物根际pH值的方法主要有三种：一是通过酸度计间接测定植物根际介质的pH值，它仅能定性反映植物根际酸化的强弱问题，其结果的准确性较差；二是利用微电极离子流测定技术测定水培条件下植物根部不同区域H⁺流速的变化，该方法准确，具有非损伤测量的优势，但测定条件有局限性，需要用到微电极离子流技术；三是琼脂-指示剂原位显色方法，能定性观察到根际区域pH的酸碱变化，但不能进行短期原位检测。可见，上述方法均有一定的局限性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法。本发明利用稳定碳同位素(δ¹³C)方法量化豆科植物根系质子(H⁺)分泌能力大小的方法，可操作性强，无破坏性，可实现短期原位检测，在植物生长过程中动态收集根际CO₂气体，通过测定碱液中稳定碳同位素，可分析比较不同植物根系释放质子的多少，且检测结果准确。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法，包括以下步骤：

将豆科植物在石英砂中进行第一培养，通过第一碱液收集根际呼吸产生的第一CO₂气体，得到根系的CO₂释放量，记为C_根系，检测第一碱液收集第一CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_根系；

将豆科植物在石英砂-碳酸盐的混合物中进行第二培养，所述第一培养和第二培养在相同的环境条件下进行，通过第二碱液收集根际产生的第二CO₂气体，得到总的CO₂释放量，记为C_总，检测第二碱液收集第二CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_总；

豆科植物根系释放质子量由式I计算得到：

H⁺＝(C_总×δ¹³C_总-C_根系×δ¹³C_根系)/2 式I，

其中H⁺为豆科植物根系释放质子量，单位为μg·h^-1·株^-1；

C_根系和C_总的单位为μg·h^-1·株^-1。

优选地，所述石英砂-碳酸盐的混合物中碳酸盐的质量分数不超过16％。

优选地，所述石英砂-碳酸盐的混合物中碳酸盐的质量分数为8％～16％。

优选地，所述石英砂-碳酸盐的混合物中碳酸盐为CaCO₃。

优选地，所述δ¹³C_总和δ¹³C_根系的测定仪器为气体稳定同位素质谱仪。

优选地，所述δ¹³C_根系的检测方法包括：将第一碱液收集第一CO₂气体的反应液与SrCl₂溶液混合进行沉淀反应，得到第一沉淀；将所述第一沉淀进行气体稳定同位素质谱仪测定，得到δ¹³C_根系；

所述δ¹³C_总的检测方法包括：将第二碱液收集第二CO₂气体后的反应液与SrCl₂溶液混合进行沉淀反应，得到第二沉淀；将所述第二沉淀进行气体稳定同位素质谱仪测定，得到所述δ¹³C_总。

优选地，所述豆科植物为蚕豆、鹰嘴豆或大豆。

优选地，所述豆科植物为由萌发种子经过12～54天培养得到。

优选地，所述豆科植物为由萌发种子经过14～40天培养得到。

优选地，收集所述第一CO₂气体和第二CO₂气体均为每隔6小时收集1次，每天收集4次，所述收集的过程中持续向所述豆科植物的根系提供氧气或无CO₂的空气。

本发明提供了一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法，包括以下步骤：将豆科植物在石英砂中进行第一培养，通过第一碱液收集根际呼吸产生的第一CO₂气体，得到根系的CO₂释放量，记为C_根系，检测第一碱液收集第一CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_根系；将豆科植物在石英砂-碳酸盐的混合物中进行第二培养，所述第一培养和第二培养在相同环境条件下进行，通过第二碱液收集根际产生的第二CO₂气体，得到总的CO₂释放量，记为C_总，检测第二碱液收集第二CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_总；豆科植物根系释放质子量由式I计算得到：

H⁺＝(C_总×δ¹³C_总-C_根系×δ¹³C_根系)/2 式I，

其中H⁺为豆科植物根系释放质子量，单位为μg·h^-1·株^-1；C_根系和C_总的单位为μg·h^-1·株^-1。

本发明能够准确测定和量化豆科植物根系质子分泌能力的大小。首先把不同豆科植物品种或同种豆科植物的不同品种在石英砂-碳酸盐混合物中培养，通过碱液收集根际产生的CO₂气体，碱液吸收的CO₂气体包括根系呼吸产生的CO₂、根系释放的质子(H⁺)与碳酸盐反应产生的CO₂两部分，然后测定碱液中稳定碳同位素δ¹³C值，根据碳酸盐的稳定碳同位素δ¹³C值与C3植物的δ¹³C值之间差异很大，通过计算可得出根系质子的释放量。本发明解决了现有技术中测定方法不敏感、准确性差、受条件限制等因素，克服了不能原位监测和动态测定根系质子释放的缺点。本方法以碳酸盐为反应添加物，豆科植物根系释放质子导致根际酸化，与根系周围的碳酸盐反应生成碳酸氢根，碳酸氢根再与氢离子反应生成二氧化碳和水，再用碱液收集根际的CO₂气体，通过测定碱液中稳定碳同位素(δ¹³C)的值，计算出豆科植物根系释放质子的数量，在本发明中，碳酸盐的稳定碳同位素组成为0.8～1‰，C3植物的稳定碳同位素组成平均值为-27‰±6‰，碳酸盐的稳定碳同位素的值在千分位上(‰)，两者之间的δ¹³C值相差悬殊，豆科植物根系释放质子的数量越多，则测定的碳酸盐的稳定碳同位素值越大，因此获得的pH量化值更加精确，从而能够提高检测结果的准确性。

而且，本方法能够通过不同的培养条件，模拟植物根系的生长环境，可避免根际pH变化受人为和环境因素的干扰，兼有原位动态检测的优点。

附图说明

图1为CO₂动态密闭循环吸收法的装置结构示意图，其中①为PVC管；②为硅胶；③为玻璃管；④为发泡石；⑤-1为第一广口试剂瓶；⑤-2为第二广口试剂瓶；⑥为碱液吸收瓶；⑦为微型真空泵；⑧为调速器；⑨为气球；⑩为硅胶管。

具体实施方式

本发明提供了一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子(H⁺)的方法，包括以下步骤：

将豆科植物在石英砂中进行第一培养，通过第一碱液收集根际呼吸产生的第一CO₂气体，得到根系的CO₂释放量，记为C_根系，检测第一碱液收集第一CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_根系；

将豆科植物在石英砂-碳酸盐的混合物中进行第二培养，所述第一培养和第二培养在相同的外界条件下进行，通过第二碱液收集根际产生的第二CO₂气体，得到总的CO₂释放量，记为C_总，检测第二碱液收集第二CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_总；

豆科植物根系释放质子量由式I计算得到：

H⁺＝(C_总×δ¹³C_总-C_根系×δ¹³C_根系)/2 式I，

其中H⁺为豆科植物根系释放质子量，单位为μg·h^-1·株^-1；

C_根系和C_总的单位为μg·h^-1·株^-1。

本发明将豆科植物在石英砂中进行第一培养，通过第一碱液收集根际呼吸产生的第一CO₂气体，得到根系的CO₂释放量，记为C_根系，检测第一碱液收集第一CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_根系。

在本发明中，所述石英砂优选依次经清洗、120℃灭菌30min后再使用。

在本发明中，所述豆科植物优选为蚕豆、鹰嘴豆或大豆。

在本发明中，所述豆科植物优选由萌发种子经过12～54天培养得到，更优选经过15～40天培养得到的。在本发明中，由所述萌发种子培养至豆科植物的培养过程中优选先用1/4Hoagland营养液培养，10天后改用1/2的Hoagland营养液培养，所述Hoagland营养液的pH值优选为7.0～7.1。在本发明的实施例中，所述培养可在培养间或人工气候箱培养室进行，采用本领技术人员熟知的豆科植物适合的培养环境即可。

在本发明中，优选将豆科植物种子依次进行消毒和萌发，得到萌发种子。本发明对所述消毒的具体操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。

在本发明中，所述通过第一碱液收集根际呼吸产生的第一CO₂气体优选通过使用CO₂动态密闭循环装置实现。在本发明的具体实施例中，所述CO₂动态密闭循环装置优选为使用CN104165889A中公开的装置。本发明对所述通过第一碱液收集根际呼吸产生的第一CO₂气体的具体操作没有特殊的限定，在本发明的具体实施例中，采用CN104165889A中公开的CO₂动态密闭循环吸收法即可。在本发明的具体实施例中，所述CO₂动态密闭循环吸收法的装置的结构示意图如图1所示，其中①为PVC管；②为硅胶，在收集CO₂之前用硅胶密封PVC管顶端；③为玻璃管；④为发泡石；⑤-1为第一广口试剂瓶作为缓冲安全瓶，用橡胶塞密封；⑤-2为第一广口试剂瓶；⑥为碱液吸收瓶；⑦为微型真空泵；⑧为调速器；⑨为气球；⑩为硅胶管，所述⑨气球中充满氧气或无CO₂的空气，所述①PVC管，⑤-1为第一广口试剂瓶、⑤-2第二广口试剂瓶和⑥碱液吸收瓶中均设有长、短连通管，所有长连通管延伸至其所处装置的底部，而所有的短连通管远离其所处装置的底部，①PVC管中的长连通管的另一端通过软管和⑤-1第一广口试剂瓶中的长连通管密封连通，⑤-1第一广口试剂瓶的短连通管通过软管和⑥碱液吸收瓶中的长连通管密封连通，⑥碱液吸收瓶中的短连通管通过软管和⑤-2第二广口试剂瓶中的长连通管密封连通，⑤-2第二广口试剂瓶中的短连通管通过软管和⑦微型真空泵密封连通，⑦为微型真空泵的另一端通过软管密封连通⑨气球，⑨气球的另一端通过⑩硅胶管密封连通①PVC管中的短连通管；同时⑦微型真空泵和⑧调速器连接，③玻璃管和④为发泡石放置于①PVC管中，所述①PVC管用②硅胶密封。

在本发明的具体实施例中，对所述萌发种子的培养优选在内径为5cm、高为20cm的PVC管中进行，管口处留出2～2.5mm高度的空间。在本发明的实施例中，所述PVC管优选作为CO₂动态密闭循环吸收法的密封植物根系的密闭装置，所述PVC管放有连接发泡石的玻璃管，所述发泡石位于植物根部以下，用于植物根部通氧和气体收集，将萌发种子移植到PVC管中，每个PVC管种植4～5株，然后放入培养间或人工气候箱培养室培养，待长出一叶小苗后间苗，保留2株或3株长势健壮的幼苗。

本发明将豆科植物在石英砂-碳酸盐的混合物中进行第二培养，所述第一培养和第二培养在相同的外界条件下进行，通过第二碱液收集根际产生的第二CO₂气体，得到总的CO₂释放量，记为C_总，检测第二碱液收集第二CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_总。

在本发明中，所述豆科植物优选为按照上述技术方案培养得到，在此不再赘述。

在本发明中，所述石英砂-碳酸盐的混合物中碳酸盐的质量分数优选不超过16％，更优选为8％～16％。在本发明中，所述碳酸盐优选为CaCO₃，所述碳酸盐优选为优级纯。

在本发明中，所述石英砂-碳酸盐的混合物中，所述石英砂和碳酸盐是分层放置的，所述碳酸盐优选放置在所述石英砂的上方，这样的放置形式更有利于豆科植物根系释放的质子与碳酸盐发生反应。

在本发明的具体实施例中，所述CaCO₃优选放置在距离PVC管底部5cm以上部位。

在本发明中，所述通过第二碱液收集根际产生的第二CO₂气体优选通过使用CO₂动态密闭循环装置实现。在本发明的具体实施例中，所述CO₂动态密闭循环装置优选为使用CN104165889A中公开的装置。本发明对所述通过第二碱液收集根际呼吸产生的第二CO₂气体的具体操作没有特殊的限定，在本发明的具体实施例中，采用CN104165889A中公开的CO₂动态密闭循环吸收法即可。

在本发明中，收集所述第一CO₂气体和第二CO₂气体均优选为每隔6小时收集1次，每天收集4次，所述收集的过程中优选持续向所述豆科植物的根系提供氧气或无CO₂的空气。

在本发明中，收集所述第一CO₂气体和第二CO₂气体时，优选控制⑧调速器的转速为2400～2450r/min。

在本发明的具体实施例中，所述第一碱液吸收第一CO₂气体后的反应液以及第二碱液吸收第二CO₂气体后的反应液均用于两部分处理，一部分用酸碱滴定法测定碱液吸收CO₂的量，分别得到总的CO₂释放量和根系呼吸产生的CO₂(无碳酸盐添加)；另一部分用于δ¹³C测定。本发明对所述两部分的具体量没有特殊的限定，能够实现测定碱液吸收CO₂的量以及δ¹³C即可。

在本发明中，所述δ¹³C_总和δ¹³C_根系的检测优选通过气体稳定同位素质谱仪进行测定。

在本发明中，所述δ¹³C_根系的检测方法优选包括：将第一碱液收集第一CO₂气体的反应液与SrCl₂溶液混合进行沉淀反应，得到第一沉淀；将所述第一沉淀进行气体稳定同位素质谱仪测定，得到δ¹³C_根系；

所述δ¹³C_总的检测方法优选包括：将第二碱液收集第二CO₂气体后的反应液与SrCl₂溶液混合进行沉淀反应，得到第二沉淀；将所述第二沉淀进行气体稳定同位素质谱仪测定，得到所述δ¹³C_总。

在本发明中，所述SrCl₂溶液优选为过量，能够使沉淀反应完全。

在本发明中，将所得沉淀反应物优选经离心后在60℃下烘干为固态，得到第一沉淀或第二沉淀。

本发明对所述沉淀反应、气体稳定同位素质谱仪测定的具体操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。在本发明中，所述气体稳定同位素质谱仪优选为美国赛默飞世尔公司生产的ThermoFisherDeltaV。

得到C_总、δ¹³C_总、C_根系和δ¹³C_根系后，本发明根据式I计算得到豆科植物根系释放质子量：

H⁺＝(C_总×δ¹³C_总-C_根系×δ¹³C_根系)/2 式I，

其中H⁺为豆科植物根系释放质子量，单位为μg·h^-1·株^-1；

C_根系和C_总的单位为μg·h^-1·株^-1。

为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1～3

1.前期准备和培养过程：

(1)选取大小均一的豆科植物种子(大豆、蚕豆或鹰嘴豆)进行消毒和萌发；

(2)将提前洗干净的石英砂在120℃条件下灭菌30min后备用；

(3)将备用石英砂，或石英砂-优级纯CaCO₃(优级纯CaCO₃占石英砂的质量分数为8％)混合培养基质分别装入直径为5cm、高为20cm的PVC管中，管口处留出2mm高度的空间，CaCO₃放置在距离PVC管底部5cm以上部位。PVC管放有连接发泡石的两根玻璃管，将萌发种子移植到PVC管中，每个PVC管种植4株，然后放入培养间培养，待长出一叶小苗后间苗，保留2株长势健壮的幼苗。植物培养0～10天用1/4Hoagland营养液培养，10天后改用1/2的Hoagland营养液培养，营养液pH值维持在7.0～7.1。

2.待植物培养至目标天数后(12、35和54天)，再收集CO₂气体，先将PVC管口顶部用硅胶密封，然后把PVC管链接气体收集装置形成一个密闭循环系统(参见图1)，再检验整个密闭循环装置是否漏气。

3.在CO₂气体收集前除去整个循环系统中残留的空气中的CO₂气体。具体步骤为将⑥碱液吸收瓶中装有碱石灰，然后开启⑧调速器带动⑦微型真空泵启动，运行循环系统10～15min，除完CO₂后将⑥碱液吸收瓶换为装有100mL、0.2mol·L^-1的NaOH试剂瓶，再次检查装置是否密封，再次检查装置是否密封的过程中，循环装置系统停止15min。

4.收集PVC管中CO₂气体，控制O₂和CO₂的流速，使调速器的转速保持在2400r/min。每隔6小时收集1次，每天收集4次，整个气体收集过程中持续向植物根系提供氧气。

5.收集CO₂气体的NaOH溶液用于两部分，一部分用酸碱滴定法测定碱液吸收CO₂的量，分别得到总的CO₂释放量和根系呼吸产生的CO₂(无CaCO₃添加)；另一部分用于δ¹³C测定：所得碱液反应液与过量的SrCl₂溶液充分反应形成沉淀物质，离心后在60℃下烘干为固态，用稳定同位素质谱仪测定δ¹³C含量。

植物在不同生长时段根系质子释放(H⁺)量的计算根据式I：

H⁺＝(C_总×δ¹³C_总-C_根系×δ¹³C_根系)/2 式I，

其中H⁺为豆科植物根系释放质子，单位为μg·h^-1·株^-1；

C_根系和C_总的单位为μg·h^-1·株^-1；

δ¹³C_总为第二CO₂气体的δ¹³C值；

δ¹³C_根系为第一CO₂气体的δ¹³C值。

不同培养时间植物根系质子(H⁺)释放量如表1、2所示，其中表1为原始数据的计算过程，表2为经过计算后不同培养时间植物根系质子(H⁺)释放量。

实施例4

与实施例1相同，区别仅在于CaCO₃占石英砂的质量分数为16％，得到的不同培养时间植物根系质子(H⁺)释放量如表1、2所示，其中表1为原始数据的计算过程，表2为经过计算后，不同培养时间植物根系质子(H⁺)释放量。

表1原始数据的计算过程

表2不同培养时间植物根系质子(H⁺)释放量(单位μg·h^-1·株^-1)

表1中正值表示相同培养条件下植物根系质子的释放量相对较多，而负值则表示释放量相对较少。

从表1可见，在8％CaCO₃添加量下，随着培养天数的增加，蚕豆和大豆根际质子释放量呈明显下降趋势，而鹰嘴豆则呈逐渐上升趋势；不同培养时段内三种豆科植物根际质子释放能力强弱均表现为：蚕豆>鹰嘴豆>大豆，在第54天，蚕豆和鹰嘴豆根际质子释放量差异不明显。在16％CaCO₃添加量下，随着培养天数的增加蚕豆根际质子释放量呈明显下降趋势，而大豆和鹰嘴豆则呈现先上升后下降趋势；不同培养时段内三种豆科植物根际质子释放能力强弱均表现为：大豆>鹰嘴豆>蚕豆，表明蚕豆根际质子释放量在16％CaCO₃添加时受抑制作用较明显。

可知，结合植物的生长规律和特点，在目标培养天数内、CaCO₃添加量占土壤的比例最好不超过16％，否则对有些植物的生长和根际质子的释放有影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用稳定碳同位素测定豆科植物根系释放质子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将豆科植物在石英砂中进行第一培养，通过第一碱液收集根际呼吸产生的第一CO₂气体，得到根系的CO₂释放量，记为C_根系，检测第一碱液收集第一CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_根系；

将豆科植物在石英砂-碳酸盐的混合物中进行第二培养，所述第一培养和第二培养在相同的环境条件下进行，通过第二碱液收集根际产生的第二CO₂气体，得到总的CO₂释放量，记为C_总，检测第二碱液收集第二CO₂气体的产物的δ¹³C，得到δ¹³C_总；

豆科植物根系释放质子量由式I计算得到：

H⁺＝(C_总×δ¹³C_总-C_根系×δ¹³C_根系)/2 式I，

其中H⁺为豆科植物根系释放质子量，单位为μg·h^-1·株^-1；

C_根系和C_总的单位为μg·h^-1·株^-1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述石英砂-碳酸盐的混合物中碳酸盐的质量分数不超过16％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述石英砂-碳酸盐的混合物中碳酸盐的质量分数为8％～16％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述石英砂-碳酸盐的混合物中碳酸盐为CaCO₃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述δ¹³C_总和δ¹³C_根系的测定仪器为气体稳定同位素质谱仪。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述δ¹³C_根系的检测方法包括：将第一碱液收集第一CO₂气体的反应液与SrCl₂溶液混合进行沉淀反应，得到第一沉淀；将所述第一沉淀进行气体稳定同位素质谱仪测定，得到δ¹³C_根系；

所述δ¹³C_总的检测方法包括：将第二碱液收集第二CO₂气体后的反应液与SrCl₂溶液混合进行沉淀反应，得到第二沉淀；将所述第二沉淀进行气体稳定同位素质谱仪测定，得到所述δ¹³C_总。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述豆科植物为蚕豆、鹰嘴豆或大豆。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述豆科植物由萌发种子经过12～54天培养得到。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述豆科植物由萌发种子经过15～40天培养得到。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，收集所述第一CO₂气体和第二CO₂气体均为每隔6小时收集1次，每天收集4次，所述收集的过程中持续向所述豆科植物的根系提供氧气或无CO₂的空气。

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