CN111826453A - 艰难梭菌检测引物或双重检测引物组及其试剂盒和快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供准确快速检出艰难梭菌毒素B的RPA引物及包含所述引物的试剂盒和艰难梭菌毒素B的检测方法，进而通过检测艰难梭菌毒素B筛查艰难梭菌致病菌，以及用于艰难梭菌双重检测的RPA引物组及其试剂盒和同时检测艰难梭菌及艰难梭菌毒素B的检测方法，通过构建艰难梭菌双重RPA检测试剂盒一步鉴定被艰难梭菌致病菌株污染的样品，以便用于基层和野外疑似样品的现场诊断。本发明通过检测艰难梭菌毒素B而快速检出艰难梭菌致病菌的RPA引物包括CDB上游引物SEQ ID No.1和CDB下游引物SEQ ID No.2，艰难梭菌双重RPA检测引物组还包括CD上游引物SEQ ID No.3和CD下游引物SEQ ID No.4。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于艰难梭菌毒素B检测的RPA引物及包含所述引物的试剂盒和艰难梭菌毒素B的快速检测方法，进而通过检测艰难梭菌毒素B筛查艰难梭菌致病菌，以及包含所述用于艰难梭菌毒素B检测的RPA引物的用于艰难梭菌双重检测的RPA引物组及其试剂盒和同时检测艰难梭菌及艰难梭菌毒素B的快速检测方法。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile)又称难辨梭菌、困难梭菌，因严格厌氧且难以分离培养而得名。一般认为艰难梭菌是环境和人类肠道中的正常菌群，但是在长期应用抗生素或免疫抑制剂等情况下，临床耐药艰难梭菌产毒株可过度繁殖并释放毒素从而导致艰难梭菌相关性腹泻，严重者可引发伪膜性肠并常伴有中毒性巨结肠和肠穿孔等并发症，甚至最终导致死亡。艰难梭菌感染不仅是欧美国家最常见的医疗保健机构相关性感染，而且正威胁着全球的公共卫生安全，调查研究表明，常见的肉类、蔬菜和牛奶等食品均可能被艰难梭菌污染，因而可通过饮食途径感染人类。目前已鉴定的艰难梭菌毒素有毒素A、毒素B、毒素C、毒素R、毒素E和二元毒素等。临床上大量检测结果表明，国内外引起临床症状的产毒艰难梭菌毒素种类主要为毒素A和毒素B，且分离鉴定的致病菌株基本均为毒素B阳性(A-B+，A+B+)菌株，国内临床鲜见毒素B阴性(A+B-，A-B-)产毒株报道，大部分艰难梭菌致病菌都为毒素B阳性菌株。因此，临床筛查以分离鉴定或基因检测毒素B为主，若临床鉴别筛查出具有艰难梭菌毒素B，则证明该菌株为艰难梭菌致病菌株。
艰难梭菌感染的临床检测“金标准”仍然为细胞毒性试验和产毒素培养，但是由于艰难梭菌培养条件极其苛刻、实验过程耗时较长等原因，这两种方法难以适应临床快速诊断和大规模流行病学调查需求，因此，随后发展出了酶联免疫法，该方法的特异性高，能区分产毒株和不产毒株，并且检测周期短，数小时即可出结果，目前已有多种商品化试剂盒投入使用。但是该方法灵敏度不够的缺点，与前两种方法一样，不适用于大规模筛查食品中微量感染艰难梭菌的情况，因此，目前越来越多的采用核酸扩增方法来辅助诊断或开展流行病学调查，具有用时短、结果易判断等特点。
重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是近年发展起来的一种基于核酸扩增的分子检测技术，相比于常见的普通PCR和定量PCR方法，RPA不仅同样具有快速、特异和灵敏度高的特点，而且扩增时间更短、扩增温度低和操作简便，摆脱了对实验室条件、设备以及专业技术的依赖，特别适用于基层医院的快速诊断和食品污染等现场快速筛查。
发明内容
本发明针对上述缺陷，提供准确快速检出艰难梭菌毒素B的RPA引物及包含所述引物的试剂盒和艰难梭菌毒素B的检测方法，进而通过检测艰难梭菌毒素B筛查艰难梭菌致病菌，以及包含所述用于艰难梭菌毒素B检测的RPA引物的用于艰难梭菌双重检测的RPA引物组及其试剂盒和同时检测艰难梭菌及艰难梭菌毒素B的检测方法，通过构建艰难梭菌双重RPA检测试剂盒一步鉴定被艰难梭菌致病菌株污染的样品，以便用于基层和野外疑似样品的现场诊断。
本发明提供如下技术方案：用于检测艰难梭菌毒素B的RPA引物，其特征在于，所述的RPA引物是基于艰难梭菌毒素B基因设计的，包括：
CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'。
本发明还提供用于检测艰难梭菌毒素B的RPA试剂盒，包括如下RPA反应扩增体系组成：
2.4μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
2.4μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
25μL反应缓冲液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液；2.5μL醋酸镁溶液；1μL待测DNA模板。
进一步地，所述CDB上游引物的浓度为10μM，所述CDB下游引物的浓度为10μM，所述dNTPs的浓度为2.5mM，所述醋酸镁溶液的浓度为280mM。
进一步地，所述RPA反应扩增片段为225bp。
本发明还提供一种检测艰难梭菌毒素B的RPA方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品总DNA；
2)采用1μL所述步骤1)提取的所述待测样品总DNA；
2.4μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
2.4μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
25μL反应缓冲液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液；2.5μL醋酸镁溶液构成共50μL的反应扩增体系，于39℃恒温下进行RPA扩增反应20min；
3)根据扩增反应结果确定所述待测样品中是否含有艰难梭菌毒素B。
本发明还提供上述用于检测艰难梭菌毒素B RPA引物的用于艰难梭菌双重检测的RPA引物组，所述RPA引物组还包括针对艰难梭菌tpi基因设计的RPA引物，引物序列如下：
CD上游引物SEQ ID No.3：
5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；
CD下游引物SEQ ID No.4：
5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'。
本发明还提供用于艰难梭菌双重检测的RPA试剂盒，所述试剂盒可以同时检测艰难梭菌和艰难梭菌毒素B，
包括如下RPA反应扩增体系组成：
1.35μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
1.35μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
1.05μL CD上游引物SEQ ID No.3：
5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；
1.05μL CD下游引物SEQ ID No.4：
5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'、；
25μL反应缓冲液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液；2.5μL醋酸镁溶液；1μL待测DNA模板。
进一步地，所述CDB上游引物的浓度为10μM，所述CDB下游引物的浓度为10μM，所述CD上游引物的浓度为10μM，所述CD下游引物的浓度为10μM，所述dNTPs的浓度为2.5mM，醋酸镁溶液的浓度为280mM。
进一步地，所述RPA反应扩增片段为120bp和225bp。
本发明还提供一种双重检测艰难梭菌和艰难梭菌毒素B的RPA方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品总DNA；
2)采用所述步骤1)提取的所述待测样品总DNA 1μL；
1.35μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
1.35μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
1.05μL CD上游引物SEQ ID No.3：
5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；
1.05μL CD下游引物SEQ ID No.4：
5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'；
25μL反应缓冲液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液；2.5μL醋酸镁溶液构成共50μL的反应扩增体系，于39℃恒温下进行RPA扩增反应20min；
3)根据扩增反应结果确定所述待测样品中是否含有艰难梭菌和艰难梭菌毒素B。
本发明的有益效果为：
(1)本发明是针对艰难梭菌毒素B基因设计的CDB上下游引物、能够单独灵敏检测艰难梭菌毒素B，并提供了基于RPA恒温快速检测方法建立的艰难梭菌毒素B RPA恒温快速检测试剂盒，进而鉴定筛查出艰难梭菌致病菌，本发明还提供了包括了基于艰难梭菌tpi基因设计的CD上下游引物的、同时检测艰难梭菌毒素B和艰难梭菌的特异性引物组，并提供了包含这个特异性引物组的双重检测艰难梭菌的RPA恒温快速检测试剂盒，不仅具有快速、恒温、扩增温度低、灵敏度高、特异性强和操作简便等特点，而且将保守而高度灵敏的艰难梭菌RPA检测方法与致病菌株的毒素鉴定方法相结合，通过本发明提供的引物和引物组既可分别开展单独筛查，也可开展双重诊断。
(2)尽管目前的绝大部分艰难梭菌致病菌株均含有毒素B，因此可通过检测毒素B进而对艰难梭菌的致病菌株进行筛查，但是由于艰难梭菌的毒素类型较多，而且毒素B基因容易变异和发生碱基缺失，因此，应用包括CD上下游引物和CDB上下游引物的引物组，具有高度灵敏而保守的tpi基因(CD引物靶标)配合筛查，既能大幅提高被艰难梭菌微量污染样品的检出率，也为后续从艰难梭菌阳性而毒素B阴性样品(如A+B-)中进一步筛查其它毒素类型的致病菌株打下了基础。
(3)本发明构建的艰难梭菌双重RPA检测试剂盒能够一步鉴别出被艰难梭菌致病菌株污染的样品，尤其适用于基层医院和野外疑似样品的现场诊断。
附图说明
在下文中将基于实施例并参考附图来对本发明进行更详细的描述。其中：
图1为本发明实施例1中艰难梭菌毒素B RPA检测方法在不同温度下的扩增结果；
图2为本发明实施例2艰难梭菌RPA检测方法对不同浓度DNA模板(A+B+)的扩增；
图3为本发明实施例2艰难梭菌毒素B RPA检测方法对不同浓度DNA模板(A+B+)的扩增；
图4为本发明实施例3中艰难梭菌毒素B的RPA检测方法对食源性细菌的检测；
图5为本发明实施例4中双重RPA检测时采用的CD上下游引物和CDB上下游引物按不同比例添加后的扩增结果；
图6为本发明实施例5中双重检测艰难梭菌RPA试剂盒对样品的检测电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
检测艰难梭菌毒素B的RPA方法，包括以下步骤：
1)采用实施例1提取的三种待测样品总DNA；
2)采用步骤1)提取的三种待测样品总DNA模板各1μL，再将每个1μL DNA模板加入RPA反应扩增体系，RPA反应扩增体系除1μL DNA，模板外，还包括以下成分；
2.4μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
2.4μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
25μL反应缓冲液(2×Reaction Buffer)；5μL基本酶混合液(10×Basic E-mix)；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液(20×Core Reaction Mix)；2.5μL醋酸镁溶液构成共50μL的反应扩增体系，于39℃恒温下进行RPA扩增反应20min；CDB上游引物的浓度为10μM，CDB下游引物的浓度为10μM，dNTPs的浓度为2.5mM，醋酸镁溶液的浓度为280mM。
3)根据扩增反应结果确定所述待测样品中是否含有艰难梭菌毒素B。
如图1所示，为艰难梭菌及其毒素B RPA检测方法在不同温度下的扩增结果，图中表明于39℃下扩增20min的效果最好。图中，M代表DL2000 Marker，B1代表于38℃下扩增DNA模板(A+B+)的产物的电泳泳道，B2代表于39℃下扩增DNA模板(A+B+)的产物的电泳泳道，B3代表于40℃下扩增DNA模板(A+B+)的产物的电泳泳道。
实施例2、RPA检测方法灵敏度和双重RPA检测方法
对艰难梭菌阳性DNA模板(A+B+，83.5ng/μL)进行10倍稀释，取10-3-10-8稀释度的模板，分别用艰难梭菌RPA检测方法(CD引物)和艰难梭菌毒素B RPA检测方法(CDB引物)按照实施例2中的RPA反应扩增体系进行扩增，如图2所示，发现仅采用CD上下游引物鉴别艰难梭菌的RPA检测方法在模板稀释度为10-7时仍可见少量扩增产物，所以，其检测限为83.5ng/μL×10-7＝8.35fg/μL；图2中，M代表DL2000 Marker，1～6分别代表仅采用CD上下游引物的浓度稀释度为10-3～10-8浓度时RPA扩增反应的电泳泳道。
而如图3所示，仅采用CDB上下游引物鉴别艰难梭菌毒素B的RPA检测方法的可见扩增产物稀释度为10-6，因此，其检测限为83.5ng/μL×10-6＝83.5fg/μL。可见，本发明方法具有良好的检测灵敏度，尤其是还可以仅利用CD上下游引物进行艰难梭菌RPA检测方法，其灵敏度高达8.35fg/μL，可以最大限度地从样品中筛查出被艰难梭菌微量污染的阳性样品。图3中，M代表DL2000 Marker的电泳泳道，1～6分别代表仅采用CDB上下游引物的浓度稀释度为10-3～10-8浓度时RPA扩增反应的产物的电泳泳道。
因此，利用CD上下游引物和CDB上下游引物同时对艰难梭菌阳性DNA模板(A+B+)，其中，采用1μLDNA模板；
1.35μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
1.35μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
1.05μL CD上游引物SEQ ID No.3：
5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；
1.05μL CD下游引物SEQ ID No.4：
5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'；
25μL反应缓冲液(2×Reaction Buffer)；5μL基本酶混合液(10×Basic E-mix)、4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液(20×Core Reaction Mix)；2.5μL醋酸镁溶液构成共50μL的反应扩增体系，于39℃恒温下进行RPA扩增反应20min；CDB上游引物的浓度为10μM，CDB下游引物的浓度为10μM，CD上游引物的浓度为10μM，CD下游引物的浓度为10μM，dNTPs的浓度为2.5mM，醋酸镁溶液的浓度为280mM。
根据扩增反应结果确定所述待测样品中是否含有艰难梭菌和艰难梭菌毒素B。
实施例3、RPA检测方法特异性
采用实施例1提取的不同毒素类型艰难梭菌(A+B+、A-B+、A-B-)和其它常见食品污染菌(粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、彭氏变形杆菌、铜绿假单胞菌和蜡样芽孢杆菌)的DNA，并运用实施例1艰难梭菌毒素B RPA检测方法对上述DNA进行扩增，结果如图4所示，按照实施例2的RPA检测方法步骤进行RPA扩增反应，进行艰难梭菌毒素B的RPA检测方法对不同毒素类型的艰难梭菌毒素B阳性DNA均产生扩增，而对其它食品菌没有产生扩增。可见，仅采用CDB上下游引物进行艰难梭菌的RPA检测方法具有很好的病原特异性。
图4中的各泳道，M代表DL2000 Marker，1代表艰难梭菌(A+B+)，2代表艰难梭菌(A-B+)，3代表艰难梭菌(A-B-)，4代表粪肠球菌，5代表肺炎克雷伯菌，6代表彭氏变形杆菌，7代表铜绿假单胞菌，8代表蜡样芽孢杆菌，9代表ddH2O。
实施例4、双重RPA检测方法中两种上下游引物添加量
利用实施例3中的CD上下游引物和CDB上下游引物同时对艰难梭菌阳性DNA模板(A+B+)，其中，采用1μLDNA模板；
分别采用不同的CD上下游引物添加量和CDB上下游引物添加量构建50μL的RPA反应扩增体系，所述不同的CD上下游引物添加量和CDB上下游引物添加量组合见表1所示。
表1
分别按照表1的添加量添加CD上下游引物和CDB上下游引物，然后分别进行RPA反应扩增，扩增结果如图5所示，当CDB上下游引物(10μM)和CD上下游引物(10μM)添加量分别为1.35μL和1.05μL时，两种目标基因片段均能得到良好扩增，针对艰难梭菌的CD上下游引物的RPA反应扩增片段为120bp，针对艰难梭菌毒素B的CDB上下游引物的RPA反应扩增片段为225bp，因此，确定CDB上下游引物(10μM)和CD上下游引物(10μM)添加量分别为1.35μL和1.05μL是两对引物的最佳添加量。图5中，M代表DL2000 Marker的RPA扩增反应产物电泳泳道。
实施例5、双重RPA检测试剂盒特异性
购买3份食品样品(猪肉、白菜、胡萝卜)和4份牛奶(牛奶1、牛奶2、牛奶3和牛奶4)，并在牛奶4中混入艰难梭菌(A+B+)作为阳性对照。对以上样品分别提取总DNA，并运用实施例3中的双重RPA试剂盒及检测方法进行扩增，结果如图6所示，只有牛奶4获得了与目标产物大小一致的特异性条带—图6中的第8泳道；而对其它样品的DNA均没有产生扩增产物，如图6中的第1-6泳道。检测结果表明，实施例3的艰难梭菌双重RPA检测试剂盒具有良好的病原特异性，适于从复杂样品中筛选出被艰难梭菌污染的样品，并能同时显示污染菌株的致病性。
图6中的各泳道，M代表DL2000 Marker；1代表猪肉；2代表白菜；3代表胡萝卜；4代表牛奶1；5代表牛奶2；6代表牛奶3；7代表ddH2O；8代表牛奶4。
虽然已经参考优选实施例对本发明进行了描述，但在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的成分。上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (10)
1.用于检测艰难梭菌毒素B的RPA引物，其特征在于，所述的RPA引物是基于艰难梭菌毒素B基因设计的，包括：
CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'。
2.用于检测艰难梭菌毒素B的RPA试剂盒，其特征在于，包括如下RPA反应扩增体系组成：
2.4μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
2.4μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
25μL反应缓冲液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液；2.5μL醋酸镁溶液；1μL待测DNA模板。
3.根据权利要求2所述的用于检测艰难梭菌毒素B的RPA试剂盒，其特征在于，所述CDB上游引物的浓度为10μM，所述CDB下游引物的浓度为10μM，所述dNTPs的浓度为2.5mM，所述醋酸镁溶液的浓度为280mM。
4.根据权利要求2或3所述的用于检测艰难梭菌毒素B的RPA试剂盒，其特征在于，所述RPA反应扩增片段为225bp。
5.一种检测艰难梭菌毒素B的RPA方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品总DNA；
2)采用1μL所述步骤1)提取的所述待测样品总DNA；
2.4μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
2.4μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
25μL反应缓冲液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液；2.5μL醋酸镁溶液构成共50μL的反应扩增体系，于39℃恒温下进行RPA扩增反应20min；
3)根据扩增反应结果确定所述待测样品中是否含有艰难梭菌毒素B。
6.包括权利要求1所述的用于检测艰难梭菌毒素B RPA引物的用于艰难梭菌双重检测的RPA引物组，其特征在于，所述RPA引物组还包括针对艰难梭菌tpi基因设计的RPA引物，引物序列如下：
CD上游引物SEQ ID No.3：
5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；
CD下游引物SEQ ID No.4：
5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'。
7.用于艰难梭菌双重检测的RPA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可以同时检测艰难梭菌和艰难梭菌毒素B，
包括如下RPA反应扩增体系组成：
1.35μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
1.35μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
1.05μL CD上游引物SEQ ID No.3：
5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；
1.05μL CD下游引物SEQ ID No.4：
5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'；
25μL反应缓冲液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液；2.5μL醋酸镁溶液；1μL待测DNA模板。
8.根据权利要求7所述的用于检测艰难梭菌毒素B的RPA试剂盒，其特征在于，所述CDB上游引物的浓度为10μM，所述CDB下游引物的浓度为10μM，所述CD上游引物的浓度为10μM，所述CD下游引物的浓度为10μM，所述dNTPs的浓度为2.5mM，所述醋酸镁溶液的浓度为280mM。
9.根据权利要求7或8所述的用于检测艰难梭菌毒素B的RPA试剂盒，其特征在于，所述RPA反应扩增片段为120bp和225bp。
10.一种双重检测艰难梭菌和艰难梭菌毒素B的RPA方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品总DNA；
2)采用所述步骤1)提取的所述待测样品总DNA 1μL；
1.35μL CDB上游引物SEQ ID No.1：
5'-CTTATAAGTAAGGTTTATATGGATGATAGTAAGCC-3'；
1.35μL CDB下游引物SEQ ID No.2：
5'-CTTCAAAATCTCAGCTACTCCACTTTCATC-3'；
1.05μL CD上游引物SEQ ID No.3：
5'-CTTTCTTGTTTACAGTTTCATCAGTTTCATTG-3'；
1.05μL CD下游引物SEQ ID No.4：
5'-CATTTACAGGAGAAGTTTCACCTCTTATGTT-3'；
25μL反应缓冲液；5μL基本酶混合液；4μL dNTPs；5.2μL去离子水；2.5μL核心反应混合液；2.5μL醋酸镁溶液构成共50μL的反应扩增体系，于39℃恒温下进行RPA扩增反应20min；
3)根据扩增反应结果确定所述待测样品中是否含有艰难梭菌和艰难梭菌毒素B。
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|---|---|---|---|---|
| CN103911430A (zh) * | 2014-02-21 | 2014-07-09 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 一种荧光标记多重pcr艰难梭菌检测试剂盒 |
| CN110129458A (zh) * | 2018-02-02 | 2019-08-16 | 广州赛哲生物科技股份有限公司 | 一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光pcr试剂盒和方法 |
| CN108315451A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-07-24 | 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| I. M. LOBATO, C. K. O’SULLIVAN: "Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances", 《TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
| M.-N. TSALOGLOU等: "Real-time microfluidic recombinase polymerase amplification for the toxin B gene of Clostridium difficile on a SlipChip platform", 《ANALYST》 * |
| O. HIGGINS等: "Duplex recombinase polymerase amplification assays incorporating competitive internal controls for bacterial meningitis detection", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
| 胡金强等: "食源性致病菌RPA检测技术研究进展", 《食品工业科技》 * |
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