CN111818941A - 抗转化生长因子β的自然杀伤细胞 - Google Patents

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Abstract

描述了一种具有低SMAD3表达和改变的基因表达谱以产生高细胞因子表达和TGF‑β超家族抗性的NK细胞，所述NK细胞在本文中称为具有TGF‑β超家族印记的自然杀伤细胞(TGFβi NK细胞)。描述了一种治疗有需要的受试者的癌症或感染的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的TGFβi NK细胞。描述了一种生产TGFβi NK细胞的方法，其通过在TGF‑β超家族细胞因子的存在下进行自然杀伤细胞的体外激活来进行。

Description

抗转化生长因子β的自然杀伤细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年1月30日提交的美国临时专利申请第62/623,682号的优先权，将其通过引用以其整体特此并入。
背景技术
由于自然杀伤(NK)细胞在不需要任何特定肿瘤细胞标记物的情况下能够识别并杀伤肿瘤细胞，临床医生寻求使用自然杀伤细胞进行过继转移。Alizadeh等人，ClinCancer Res.16(13)：3399-3408(2010)。然而，NK细胞过继转移程序的开发由于活细胞的受限供给而受阻。NK细胞仅代表血液中细胞的一小部分，并且来自典型的血液抽取的分离并不产生许多细胞。此外，必须将NK细胞进行纯化以免由于CD3和CD19缺失而污染PBMC，分别诸如T细胞和B细胞。Childs等人，American Society of Hematology(ASH)EducationBook，2013卷第1期，234-246(2013)。这对于同种异体移植而言是必要的步骤，在所述同种异体移植中，T细胞和B细胞的存在增加移植物抗宿主病(GVHD)的风险，但是进一步降低NK细胞产率。
主要由于早衰，与其他种类的细胞相比，NK细胞在体外扩增较差。使用甚至最有效的方法，NK细胞也在仅几代之后易产生端粒缩短和衰老。Denman等人，PLoS ONE 7(1)：e30264(2012)。用于增加体外NK细胞活力和增殖的最有效方法是与饲养细胞共培养。用于NK细胞扩增的常用饲养细胞包括经辐照的外周血单核细胞(PBMC)、爱泼斯坦-巴尔病毒转化的类淋巴母细胞细胞系(EBV-LCL)、组成型表达IL-15或21的经基因修饰的K562细胞和其他经辐照的肿瘤细胞系。Berg等人，Cytotherapy，11(3)：341-55(2009)。与饲养细胞共培养显著增加NK细胞活力和增殖，所述增殖为1,000与50,000倍之间的群体增加。
免疫疗法有很大希望改善癌症诸如骨肉瘤(OS)的结果，骨肉瘤的存活率在过去30年中未改善。OS，包括化疗抗性OS，易于被自体和同种异体的激活NK细胞两者在体外杀伤。然而，OS和其他实体瘤中的肿瘤微环境提高了高度免疫抑制性细胞因子即转化生长因子-β(TGF-β)的水平。Lamora等人，Clin Cancer Res 20：5097-5112(2014)；Xu等人，DNA CellBiol，33：802-806(2014)。将封闭抗体添加到TGF-β改善了树突细胞疫苗在OS中的功效(Kawano等人，Clin Orthop Relat Res.，470：2288-2294(2012))，从而提供了TGF-β是OS中的活性抑制免疫疗法的原理的证据。
TGF-β对于NK细胞功能的抑制是多方面的。TGF-β调控NK细胞的发育，并且随后在达到成熟之后负面地影响所述NK细胞的功能。TGF-β通过防止NK细胞进展为CD16+NK细胞来促进未成熟NK细胞谱系。TGF-β还可以诱导之前CD16+NK细胞变为CD16-。Keskin等人，ProcNatl Acad Sci U S A，104：3378-3383(2007)。此外，与野生型小鼠相比，在NK细胞上表达显性负性TGFβR的小鼠具有增加数量的成熟NK细胞。Viel等人，Science signaling 9：ra19(2016)。
在成熟NK细胞中，TGF-β通过多种机制抑制抗肿瘤活性。TGF-β降低IL-2和IL-15诱导的NK细胞增殖(Wilson等人，PloS one 6：e22842(2011))和IL-15诱导的mTOR激活。Viel等人，Sci Signal.，16；9(415)：ra19(2016)。TGF-β还抑制对于刺激适应性免疫系统重要的IFNγ分泌，并且可以使肿瘤对于NK细胞裂解敏感。TGF-β直接地和间接地抑制IFNγ。SMAD3直接结合IFNγ启动子，并且还可以间接地通过降低IFNγ促进转录因子T-bet和E4BP4的表达来抑制IFNγ。Tang等人，NatCommun，8：14677(2017)。然而，TGF-β介导的对IFNγ分泌的抑制可以通过将NK细胞与IL-12、IL-15或IL-18预孵育得到部分缓解。Yu等人，Immunity，24∶575-590(2006)。此外，TGF-β还抑制TNFα和GM-CSF分泌，并且调控趋化因子受体表达以促进NK细胞在骨髓内的滞留。Castriconi等人，JImmunol，190：5321-5328(2013)。
具体地，TGF-β通过降低颗粒酶和穿孔素分泌和以下激活性受体的表达来介导TGF-β对于NK细胞的细胞毒性的抑制：NKG2D、NKp30、KIR、DNAM-1、NKp44、TRAIL和CD 16。这抑制了NK细胞对恶性细胞的识别，所述恶性细胞表达所述受体的同源配体。
已经存在针对生成对于TGF-β具有抗性的NK细胞和T细胞的若干方法。这些包括表达显性负性TGFβRII的细胞以及使用TGF-β小分子抑制剂和基于免疫的疗法的组合疗法。重要的是，所有这些方法已经证明增加了NK细胞疗法和T细胞疗法的体外和体内功效。Wallace等人，ClinCancer Res.，14(12)：3966-74(2008)；Bollard，C.，Blood，99∶3179-3187(2002)。然而，TGF-β的广谱抑制具有产生不利副作用的可能性；因为TGF-β信号传导是环境依赖性的并且可能具有肿瘤促进作用和肿瘤抑制作用两者。例如，鼠模型中TGF-β的抑制增加了循环肿瘤细胞的数量(Wrzesinski等人，ClinCancerRes.，13：5262-5270(2007))，并且TGF-β的广谱抑制导致严重的自身免疫性疾病。Li等人，Immunity25：455-471(2006)。因此，TGF-β的抑制应当小心地且在确定肿瘤对TGF-β的应答之后进行。因此，产生固有TGF-β抗性的非系统性方法是避免系统性TGF-β抑制可能具有的不利作用的有前景的替代方案。
发明内容
许多类型的癌症通过释放TGF-β减弱NK细胞杀伤。诸位发明人开发了一种训练NK细胞(对其加印记)对TGF-β有抗性的非遗传方法。通过在用IL-12/15/18刺激NK细胞期间添加TGF-β来开发具有TGF-β印记的NK(TGFβi NK)细胞。TGFβi NK在刺激之后比正常NK细胞更好地维持其细胞毒性。另外，与TGF-β一起培养的TGFβi NK细胞具有增加的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF分泌，这可以增加肿瘤杀伤并且广泛地刺激适应性免疫应答。增加的细胞因子分泌持续超过一个月。对TGF-β的抗性在体外持续至少1周，并且由SMAD3下调来介导。
附图说明
可以通过参考下图来更容易地理解本发明，其中：
图1提供了示出在TGFβ的存在下用亲本(未修饰)K562进行的NK细胞激活响应于肿瘤靶标诱导具有细胞因子过多分泌的TGFβi NK细胞的图。将NK细胞每周用K562刺激，并且在含有IL-2(对照)或IL-2和10ng/mL TGFβ(TGFβi)的培养基中培养14天。在培养之后，在与MG63肿瘤靶标共培养之后的上清液中评估IFNγ和TNFα分泌。线和棒代表平均值±SD。通过双向重复测量ANOVA以及Holm-Sidak多重比较检验来确定所有其他图的统计学差异。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
图2提供了示出在TGFβ的存在下用促炎细胞因子进行的NK细胞激活响应于肿瘤靶标诱导具有细胞因子过多分泌的TGFβiNK细胞的图。在具有或不具有IL-2和TGFβ的情况下用IL-12、IL-15和IL-18(分别为10ng/mL、50ng/mL和50ng/mL)将NK细胞激活过夜，接着在具有或不具有IL-2和TGFβ的情况下在IL-15(1ng/mL)中培养。在培养7-14天之后，通过细胞内流式细胞术测量响应于MG63的抗肿瘤IFNγ和TNFα产生(n＝4)。将IFNγ+和TNFα+NK细胞百分比针对无靶标归一化。针对全部描绘单独的数据点。通过双向重复测量ANOVA以及Holm-Sidak多重比较检验来确定所有其他图的统计学差异。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
图3提供了示出在TGFβ的存在下用K562 mbIL-15(克隆4)饲养细胞进行的NK细胞扩增响应于肿瘤靶标诱导具有细胞因子过多分泌的TGFβi NK细胞的图。在具有(TGFβi)或不具有(对照)TGFβ的情况下用饲养细胞进行14天扩增之后，将NK细胞在具有或不具有10ng/mL TGFβ的情况下在50IU/mL IL-2中静置过夜。然后在相同培养基中将NK细胞与肿瘤靶标共培养，并且收集上清液以测量细胞因子分泌。对照为黑色，TGFβi为红色。通过双向重复测量ANOVA以及Holm-Sidak多重比较检验来确定所有其他的统计学差异。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
图4提供了示出在TGFβ的存在下用K562mbIL-21饲养细胞进行的NK细胞扩增响应于肿瘤靶标诱导具有细胞因子过多分泌的TGFβiNK细胞的图。在具有(TGFβi)或不具有(对照)TGFβ的情况下用饲养细胞进行14天扩增之后，将NK细胞在具有或不具有10ng/mL TGFβ的情况下在50IU/mL IL-2中静置过夜。然后在相同培养基中将NK细胞与肿瘤靶标共培养，并且收集上清液以测量细胞因子分泌。对照为黑色，TGFβi为红色。通过双向重复测量ANOVA以及Holm-Sidak多重比较检验来确定所有其他的统计学差异。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
图5提供了示出添加TGFβ以生成TGFβi NK细胞不降低用K562 mbIL-21(CSTX002)饲养细胞进行的扩增培养中的增殖潜力的图。将来自5个供体的NK细胞在第0天从相同数量的细胞开始，在配对培养中在具有(TGFβi)或不具有(对照)TGFβ的情况下在饲养细胞上扩增14天。示出了14天之后活细胞的总数量，对于每个配对扩增针对对照NK细胞归一化。通过学生配对t检验为非显著的。
图6提供了示出TGFβi NK细胞维持针对肿瘤细胞的细胞因子过多分泌持续数周的图。A)将用亲本K562饲养细胞扩增14天(扩增)或扩增并再静置7天(静置)的TGFβi和对照NK细胞与MG63靶细胞共培养，并且针对细胞因子分泌评估上清液。B)在相似的实验中，在扩增的第7天和第14天评估K562mbIL-21扩增的对照和TGFβiNK细胞针对MG63的细胞因子分泌，并且在静置之后在第21天、第35天和第47天再次进行评估。描绘具有最小至最大须触线的中值。对照为黑色，TGFβi为红色。通过配对t检验确定统计学差异，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
图7提供了示出TGFβi NK细胞展现出针对多种癌症类型的细胞因子过多分泌的图。在对照条件下或存在TGFβ以诱导TGFβi NK细胞的情况下进行14天扩增之后，将NK细胞在具有或不具有IL-2或TGFβ的情况下静置过夜。然后在相同的新鲜培养基中将NK细胞与肿瘤靶标共培养3小时，并且收集上清液以测量IFNγ和TNFα细胞因子分泌。描绘DAOY(髓母细胞瘤，n＝12)和CHLA-255(神经母细胞瘤，n＝5)的单独数据点。线和棒代表平均值±SD。
图8提供了示出TGFβi NK细胞展现出TGFβi信号传导蛋白SMAD3的极大下调的图。在对照条件下或存在TGFβ以诱导TGFβi NK细胞的情况下进行14天扩增之后，通过蛋白质印迹法评估NK细胞的SMAD3和E4BP4蛋白质表达(n＝4)。
图9提供了示出TGFβi NK细胞过多分泌GM-CSF、TNFα和IFNγ的图。在2x10e6个NK细胞/mL下用10μg/mL PHA刺激对照和TGFβi NK细胞4小时，并且测量细胞因子分泌。线和棒代表平均值±SD。通过配对t检验确定统计学差异。
图10提供了示出用亲本K562扩增的TGFβi NK细胞与对照NK细胞具有相似的细胞毒性的图。使用4小时钙黄绿素释放细胞毒性测定，接着在单独的IL-2或IL-2和TGFβ中过夜处理来测量对照和TGFβi NK细胞的细胞毒性。线和棒代表平均值±SD。通过双向重复测量ANOVA以及Holm-Sidak多重比较检验来确定统计学差异。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
图11提供了示出扩增的TGFβi NK细胞在骨肉瘤的小鼠模型中比对照扩增的NK细胞更好地控制肿瘤生长的图。用在K562mbIL-21饲养细胞上扩增的TGFβi NK细胞而不是对照NK细胞进行的小鼠处理显著减少NSG小鼠的肺中143b骨肉瘤细胞系的生长。
图12提供了示出TGFβiNK细胞具有将其与标准扩增的NK细胞区分开的基因表达谱的图。将来自4个供体的标准和TGFβi NK细胞在CSTX002上成对扩增。分离mRNA并进行RNA测序。鉴定前100个差异表达的基因。A)进行主成分分析，其中对原始值进行ln(x+1)转换。对行应用单位方差缩放；使用具有填补的SVD来计算主成分。X轴和Y轴示出了主成分1和主成分2，其分别解释总方差的95.4％和1.6％。TGFβi NK细胞在红框中标出。>95％的方差是由于加TGFβ印记，而＜2％是由于供体变化。B)对相同的经log转换的数据进行聚类分析。对行进行居中；对行应用单位方差缩放。使用相关距离(correlationdistance)和平均连锁对行和列两者进行聚类。
具体实施方式
本发明提供了具有TGF-β印记的自然杀伤(TGFβiNK)细胞，其具有高度细胞毒性，产生高水平的细胞因子，并且对免疫抑制性细胞因子的TGF-β超家族具有抗性。这些细胞可以通过在TGF-β超家族细胞因子的存在下进行自然杀伤细胞的慢性体外激活来制备。本发明还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症或感染的方法，其通过向受试者施用治疗有效量的TGFβi NK细胞来进行。
定义
为了清楚地理解和易于参考，在此汇编了在整个简述部分中和本申请的剩余部分中使用的一系列术语。一些术语在整个本领域中是熟知的，并且为了清楚起见在此定义，而一些术语是本申请独有的并且因此为了正确地理解本申请而必须被定义。
″一个/种(a/an)″在本文中意指一个/种或多于一个/种；至少一个/种。在本文使用复数形式的情况下，它通常包括单数。
另外在本文中，通过端点引用数值范围包括归纳在此范围内的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
如本文所用，术语″受试者″可以指任何温血生物体，包括但不限于人类、大鼠、小鼠、狗、山羊、绵羊、马、猴、猿、猪、兔、牛等。在需要或要求本申请的组合物的受试者的情况下使用术语时，所述术语可以称为″有需要的受试者″，并且包括已经在临床上被诊断(例如，由医学专业人员，例如医师)为需要本申请的组合物的受试者，怀疑需要本申请的组合物的受试者，具有患疾病或病症的风险并且可受益于本申请的组合物的受试者，以及已经患有疾病或病症并且可受益于本申请的组合物的受试者。
如本文所用，术语″药学上可接受的″是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类或动物的组织接触，而不产生过多毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语″治疗有效的″旨在定量实现降低疾病严重性同时避免不利副作用(诸如通常与替代性疗法相关联的那些副作用)的目标的药剂的数量或量。可以按一个或多个剂量施用治疗有效量。治疗上有效的治疗包括改善受试者的生活质量(即使它们并不实质上改善疾病结果)的治疗。
″有效量″通常意指提供所需的局部或系统性作用，例如有效刺激细胞因子形成，包括实现本申请中所述的特定所需作用的量。例如，有效量是足以实现有益或所需临床结果的量。
″治疗(treat、treating、或treatment)″关于本发明被广泛使用，并且每个这种术语尤其涵盖预防、改善、抑制或治愈缺陷、功能障碍、疾病或其他有害过程，包括那些干扰疗法和/或由疗法产生的过程。在各种实施方案中，疾病或障碍的症状改善了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
如本文所用，术语″施用″是指通过一种方法或途径将组合物(例如，细胞组合物)置于受试者中，所述方法或途径导致组合物至少部分定位在所需部位处，使得产生所需作用。本文所述的抗性自然杀伤细胞或组合物可以通过本领域已知的任何适当途径来施用，所述适当途径包括但不限于口服或肠胃外途径，包括静脉内、肌肉内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、肺部、鼻腔、直肠和局部(包括颊和舌下)施用。
如本文所用，术语″细胞因子″是指在细胞信号传导中并且特别是在免疫调控中重要的小蛋白质(约5至20kDa)。细胞因子的示例包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。
使用TGFβi NK细胞进行的治疗
一方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的癌症或感染的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的具有TGF-β印记的自然杀伤(TGFβi NK)细胞。如本文所述，与典型的扩增的自然杀伤细胞相比，TGFβi NK细胞可以是更有效的且持续更久，因为它们对于TGF-β超家族的细胞因子的抗性保护其不受免疫系统抑制。
如本文所用，″自然杀伤细胞″(″NK细胞″)是指免疫系统的一类型细胞毒性淋巴细胞。NK细胞提供对于病毒感染细胞的快速应答，并且对转化细胞产生应答。通常免疫细胞检测感染细胞的表面上来自由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的病原体的肽，从而触发细胞因子释放，导致裂解或细胞凋亡。然而，NK细胞是独特的，因为它们能够识别应激细胞，无论来自病原体的肽是否呈现在MHC分子上。由于初始认为它们不需要预先激活来杀伤靶标，所以它们被称为″自然杀伤细胞″。NK细胞是大颗粒淋巴细胞(LGL)，并且已知在骨髓中分化并成熟，它们然后从骨髓进入循环。
本发明包括对转化生长因子-β(TGF-β)超家族的细胞因子具有抗性的NK细胞以及制备和使用此类抗性NK细胞的方法。TGF-β超家族是结构相关细胞调节蛋白的一个大组。TGF-β是控制许多细胞类型中的增殖、分化和其他功能的多功能肽。TGF-β-1是通过从前体蛋白的C末端的蛋白水解切割衍生的具有112个氨基酸残基的肽。这些蛋白质与细胞表面丝氨酸/苏氨酸特异生蛋白激酶受体的保守家族相互作用，并且使用称为SMAD的保守蛋白质家族生成细胞内信号。TGF-β超家族的主要亚家族包括TGF-β亚家族(包括TGF-β1至4亚型)、decapentaplegic Vg相关(DVR)相关蛋白(例如，骨形态发生蛋白)、生长分化因子(例如，GDF-1至GDF-15)以及激活素和抑制素亚家族。在一些实施方案中，TGFβi NK细胞对TGF-β具有抗性。
TGFβi N细胞可以用于治疗受试者的癌症或感染。TGFβi NK细胞通常通过细胞的过继转移来施用。在一些实施方案中，所述受试者已被诊断为患有癌症。如本文所定义，癌症是基于含有遗传损伤、从而导致细胞的相对无限制生长的细胞的发展的疾病。癌细胞中存在的遗传损伤在癌细胞系的后代中维持为遗传性状。通过本发明的方法治疗的癌症可以是本领域技术人员已知或本文所述的任何形式的癌症。可以治疗表现为实体瘤和相反形成如通常在白血病中所见的非实体瘤的癌症两者的癌症。本发明提供了用于治疗患有各种不同类型的癌症(包括癌、肉瘤和淋巴瘤)的受试者的方法。
在一些实施方案中，所治疗的癌症是白血病(例如，急性淋巴母细胞性白血病；急性髓性白血病；慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤(例如，B细胞非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴母细胞性淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤)、实体瘤(例如，乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、肝细胞癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、高级别神经胶质瘤)、肉瘤(例如，尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤)。在另外的实施方案中，癌症选自由白血病、淋巴瘤、横纹肌肉瘤、脑癌和骨癌组成的群组。
癌症治疗的有效性可以通过评价响应于施用TGFβi NK细胞在受试者中的肿瘤负荷减少或肿瘤生长降低来测量。肿瘤负荷减少可以表现为质量的直接降低，或者它可以关于肿瘤生长延迟来测量，所述肿瘤生长延迟是通过从经治疗的肿瘤生长至某一体积所需的时间减去对照肿瘤生长至同一体积的平均时间来计算的。
在其他实施方案中，正在治疗的受试者患有感染性疾病。TGFβi NK细胞具有广泛的系统性作用，并且可以用于治疗各种不同的微生物的感染。如本文所用，术语“感染性疾病”意指包括通过病毒、病原细菌或真菌感染导致的并且可以通过呼吸器官、血液或皮肤接触而发生感染的所有疾病。此类感染性疾病的非限制性示例包括但不限于乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)、感染、人免疫缺陷病(HIV)、巨细胞病毒感染、病毒性呼吸道疾病、流感等。
具有TGF-β印记的自然杀伤细胞
本发明的另一方面提供了一种在TGF-β超家族细胞因子的存在下培养的自然杀伤(NK)细胞或NK细胞系，其在本文中称为TGFβi NK细胞。这包括通过本文所述的方法产生的NK细胞或细胞系以及包含本文提供的NK细胞的组合物。在特定方面，所述组合物是包含本文提供的一种或多种NK细胞或细胞系的药物组合物。在一些实施方案中，TGFβi NK细胞对TGF-β展现出增加的抗性。
TGFβi NK细胞可以是同种异体或自体细胞。在一些方面，NK细胞是哺乳动物NK细胞。″哺乳动物的″或″哺乳动物″的示例包括灵长类动物(例如，人类)、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、猪、反刍动物等。具体示例包括人、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、兔、豚鼠、大鼠和小鼠。在特定实施方案中，哺乳动物NK细胞是人NK细胞。
TGFβi NK细胞展现出多种将其与天然存在的NK细胞区分开的特征。在一些实施方案中，NK细胞或细胞系对TGF-β展现出增加的抗性。在其他实施方案中，NK细胞产生增加量的干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在另外的实施方案中，NK细胞显示降低水平的SMAD家族成员3(SMAD3)蛋白和/或转化生长因子β受体III(TGFBR3)蛋白。SMAD蛋白由秀丽隐杆线虫Sma和果蝇Mad名称的缩写而得其名(Derynck等人，Cell，95(6)，p737-740，1998)，并且是TGF-β应答的转录激活物。
TGFβi NK细胞展现出多种将其与天然存在的NK细胞区分开的特征。在一些实施方案中，NK细胞具有与图12中所示的基本上相似的基因表达谱。基本上相似的基因表达谱是基因表达在所示的10％内的基因表达谱。在一些实施方案中，TGFβi NK细胞产生增加量的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，NK细胞或细胞系展现出增加的SCUBE1、MYO7A、KLF3、WIPF3和EPHA1表达。
TGFβi NK细胞展现出多种将其与天然存在的NK细胞区分开的特征。在一些实施方案中，TGFβi NK细胞显示降低水平的SMAD3蛋白和/或TGFBR3蛋白。在一些实施方案中，NK细胞或细胞系展现出降低的CD300A、SGSM1、SMAD3、TBX21和GZMK、TGFBR3和GZMA表达。
制备具有TGF-β超家族印记的自然杀伤(TGFβi NK)细胞系
本发明的另一方面提供了一种制备具有TGF-β超家族印记的自然杀伤(TGFβi NK)细胞系的方法，其包含在TGF-β超家族细胞因子的存在下进行自然杀伤细胞的体外激活。所述方法可以进一步包含分离或分开通过本文所述的方法产生的一种或多种TGFβi NK细胞。此外，所述方法可以进一步包含培养一种或多种TGFβi NK细胞。在一些实施方案中，产生了TGFβi NK细胞系。在一些实施方案中，将TGFβi NK细胞系在TGF-β的存在下扩增。细胞系是可以维持在细胞培养物中的多个细胞。
扩增(即，激活)是指NK细胞的离体增殖，使得NK细胞的群体增加。NK细胞可以例如由外周血单核细胞扩增。然而，NK细胞还可以由其他类型的细胞，诸如造血干细胞或祖细胞扩增。初始血液或干细胞可以由各种不同的来源，诸如胎盘、脐带血、胎盘血、外周血、脾或肝分离。扩增在细胞培养基中发生。合适的细胞培养基是本领域技术人员已知的，并且包括基础伊格尔培养基(BME)、杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)、格拉斯哥极限必需培养基(GMEM)、杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12Ham(DMEM/F-12)、极限必需培养基(MEM)、伊斯科夫改良杜氏培养基(IMDM)、营养混合物F-10Ham(Ham′sF-10)、营养混合物F-12Ham(Ham′s F-12)、RPMI-1640培养基、Williams培养基E、
Figure BDA0002663336800000111
(目录号Stem CellTechnologies，温哥华，加拿大)、Glycostem基础生长培养基
Figure BDA0002663336800000113
Figure BDA0002663336800000114
培养基(Invitrogen)、X-VIVOTM 10(Lonza)、X-VIVO.TM.15(Lonza)、OPTMIZER(Invitrogen)、
Figure BDA0002663336800000112
H3000(STEMCELL Technologies)、CELLGRO COMPLETETM(Mediatech)或任何修饰的变体或其组合。
如本文所用，术语″饲养细胞″是指不能分裂和增殖，但是具有代谢活性，并且因此产生有助于靶NK细胞增殖的各种代谢产物的细胞。可以用于本发明的饲养细胞的示例包括但不限于引入基因的动物细胞系、用各种细胞因子或化合物处理的外周血白细胞(PBL)、自体或同种异体性外周血白细胞(PBL)、T细胞、B细胞、单核细胞等。在一些实施方案中，饲养细胞是K562饲养细胞。在另外的实施方案中，K562饲养细胞选自克隆4细胞、克隆9细胞和CSTX002细胞。
在一些实施方案中，在NK刺激性外泌体或NK刺激性纳米颗粒的存在下进行自然杀伤细胞的体外激活。外泌体是源自内体的小的细胞外小泡，直径在30-100nm之间。肿瘤来源的外泌体携带来自肿瘤细胞的许多分子和因子，并且可以用于刺激自然杀伤细胞。参见Li等人，Exp Cell Res.，363(2)：141-150(2018)。纳米颗粒还可以用于刺激自然杀伤细胞。纳米颗粒是具有周围界面层的、大小在1与2500nm之间的颗粒。这包括具有从1至100nm的大小的超细纳米颗粒和具有从100至2500nm的大小的细纳米颗粒。纳米颗粒可以使用聚合物或矿物质(诸如氧化石墨烯)来制备。在一些实施方案中，对纳米颗粒进行官能化以包括另外的基团，诸如帮助刺激自然杀伤细胞的抗体。参见例如，Loftus等人，Nano Lett.，18(5)：3282-3289(2018)。
剂量和施用
TGFβi NK细胞应当根据良好的医学实践，考虑施用的部位和方法、施用的时间安排、患者年龄、性别、体重、待治疗或预防的障碍的性质和严重性以及医学从业者已知的其他因素来施用和给药。可以按单剂量或按分剂量施用细胞。因此，出于本文的目的，药学上“有效的量”由本领域已知的此类考虑因素决定。所述量必须有效实现改善，包括但不限于改善的存活率或更快速的恢复，或者症状和其他迹象的改善或消除，如本领域技术人员作为适当的量度所选择的。
通常所述剂量为约10x 106个细胞/kg受试者体重或更低，约9x 106个细胞/kg或更低，约8x 106个细胞/kg或更低，约7x 106个细胞/kg或更低，约6x 106个细胞/kg或更低，约5x 106个细胞/kg或更低。在替代性实施方案中，所述剂量可以在约0.25x 106个细胞/kg至约5x 106个细胞/kg之间；或更优选地约1x106个细胞/kg至约5x 106个细胞/kg之间。因此，在另外的替代性实施方案中，所述剂量可以为约0.25x 106个细胞/kg、0.5x 106个细胞/kg、0.6x 106个细胞/kg、0.7x 106个细胞/kg；0.8x 106个细胞/kg；0.9x 106个细胞/kg；1.1x106个细胞/kg；1.2x 106个细胞/kg；1.3x 106个细胞/kg；1.4x 106个细胞/kg；1.5x 106个细胞/kg；1.6x 106个细胞/kg；1.7x 106个细胞/kg；1.8x 106个细胞/kg；1.9x 106个细胞/kg或2x 106个细胞/kg。在其他实施方案中，所述剂量可以在10万与1百万个细胞/kg之间；或在1百万与2百万个细胞/kg之间；或在2百万与3百万个细胞/kg之间；或在3百万与4百万个细胞/kg之间；或在4百万与5百万个细胞/kg之间；或在5百万与6百万个细胞/kg之间；或在6百万与7百万个细胞/kg之间；或在7百万与8百万个细胞/kg之间；或在8百万与9百万个细胞/kg之间；或在9百万与1千万个细胞/kg之间。
示例性施用模式包括但不限于注射、输注、灌注、吸入或摄食。″注射″包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑内脊髓和胸骨内注射和输注。在优选的实施方案中，将所述组合物通过静脉内输注或注射施用。
可以将TGFβi NK细胞以包含用于人施用的在充分无菌的条件下制备的等渗赋形剂的药物组合物的形式提供。所述组合物可以是无菌的。配制应当符合施用模式。对于药物配制的一般原理，读者参考Cell Therapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，G.Morstyn&W.Sheridan编，Cambridge University Press，1996；和HematopoieticStemCellTherapy，E.D.Ball，J.Lister&P.Law，ChurchillLivingstone，2000。包含TGFβiNK细胞群体的组合物的细胞赋形剂和任何附带要素的选择将根据用于施用的途径和装置来改变。
在一些实施方案中，将TGFβi NK细胞与药学上可接受的载体一起施用。合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、右旋糖)、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等以及其组合。如果需要的话，药物制剂可以与助剂混合，所述助剂为例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、风味剂和/或芳香族物质以及不与活性化合物发生有害反应的类似物。
包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表了由本发明人发现在本发明实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开文本，本领域技术人员应理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例
实施例1：通过TGF-β对NK细胞加印记以成为抗TGF-β的
诸位发明人最可能通过关键TGF-β信号传导蛋白之一SMAD3的缺失来生成用TGF-β培养物扩增的对TGF-β具有降低的敏感性的人NK细胞(TGFβi NK)。诸位发明人证明了：a)TGFβi NK细胞具有针对肿瘤靶标的明显增加的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF分泌；并且b)TGFβiNK细胞在激活后保留细胞因子过多分泌持续至少1个月。
方法
细胞培养：将NK细胞在补充Glutamax、10％FBS和抗生素的RPMI 1640培养基中培养。使用Lonza MycoAlert(Lonza，LT027-58)常规地测试所有细胞的支原体污染，并且发现在所有时间点处均为阴性的。从ATCC(CCL-243)购买K562饲养细胞并且在100Gy下辐照。
NK细胞扩增：将纯化的原代人NK细胞用经辐照的K562在第0天以1∶2并且在第7天以1∶1刺激。所使用的K562细胞系在图例中指示为未修饰的(亲本)、表达4-1BBL和膜结合IL-15的(克隆4)、或表达4-1BBL和膜结合IL-21的(克隆9或CSTX002)。对标准的扩增NK细胞补充以50IU/mL重组人IL-2，并且抗性(TGFβi NK)的扩增NK细胞接受50IU/mL IL-2和10ng/mL TGF-β(Biolegend，580706)。每2-3天添加新鲜培养基和细胞因子。基于CD3-/CD56+细胞的百分比计算NK细胞扩增。
流式细胞术：使用具有GolgiStop的BD Cytofix/Cytoperm固定/渗透试剂盒(BDBiosciences，554715)进行细胞内流式细胞术。使用针对以下蛋白质的抗体来评估NK表型和功能：CD3 PeCy7/APC-H7、CD56 FITC/BV421、NKG2D Pe-CF594/BV510、TRAIL PE/APC/BV421、FasL PE、NKp30 PE/Alexa Fluor 647/PE-Vio615、颗粒酶A APC、颗粒酶B BV510、穿孔素BV421、DNAM-1BV711、CD107a BV510、IFN-γAPC、TNF-αBV421、CD16PE和Tonbo Ghost染料510/780。在LSR Fortessa上获取细胞事件。仅使用用活力染料染色的细胞确定流式细胞术门控，并且使用FlowJo7.6.5/10.SMAD3流分析单色对照。
细胞毒性测定：通过在单独的人IL-2中或在具有10ng/mL可溶性TGF-β(Biolegend)的情况下在IL-2(50IU/mL)中静置过夜来制备用于细胞毒性测定的NK细胞。使用3μg钙黄绿素AM/mL/1,000,000个靶细胞在完全培养基中至少一式两份进行用基于钙黄绿素-AM的方法进行的细胞毒性测定。在与NK细胞静置过夜时相同的细胞因子中进行钙黄绿素测定。Somachi等人，Journalofvisualizedexperiments：JoVE48，2540(2011)。
细胞内功能流式细胞术：为了确定响应于肿瘤通过CD 107a表达和细胞内细胞因子产生进行的脱粒，在如针对细胞毒性测定所述的200μl培养基中，将300,000个NK细胞与60,000个肿瘤细胞(5∶1 E∶T比率)或用于对照的无靶标在96孔圆底板中共培养。在测定开始时，将1μl莫能菌素连同CD 107a添加到每个样品中。将板在100g x 2分钟下旋转以促进细胞-细胞接触，并且置于37℃培养箱中3小时。在3小时之后，去除培养基并且开始对细胞表面和细胞内蛋白质的染色，如详细所述。
流式微珠阵列(CSA)：为了确定IFNγ和TNFα的NK细胞释放，如针对细胞内功能流式细胞术所述培养NK细胞，除了莫能菌素和CD107a抗体。在与肿瘤靶标共培养3h或用10μg/mL PHA刺激4h之后，收集上清液并在-75℃下冷冻，直至使用。在进行测定当天，将上清液解冻并且根据BD CBA Soluble Protein Master试剂盒(BD Biosciences，目录号：558265)和IFNγ和TNFα Flex套装(BD Biosciences，目录号：558269，560112)或MACSPlex Cytokine12试剂盒(Miltenyi，目录号：130-099-169)的制造商说明书使用50μL未稀释的上清液。在BD LSR II或MACSQuant上获取分析物。在Flow Jo v.10.1中确定每个分析物的几何平均值，并且使用来自针对BD LSR II获取样品的已知标准品的具有R2≥0.9的标准曲线将未知样品进行内插。使用MACSQuantify软件(2.8版本，贝尔吉施格拉德巴赫，德国(BergischGladbach，Germany))进行对MACSQuant获取的分析物的分析。此软件使用MACSPlex标准品的平均APC中值，并且计算每个样品中的细胞因子浓度。
用细胞因子进行NK细胞激活：对于用IL-12、IL-15和IL-18进行的NK细胞刺激，如所述将原代NK细胞用10ng/mL IL-12(Biolegend，573002)、50ng/mL IL-15(Biolegend，570302)和50ng/mL IL-18(Biolegend，592102)刺激过夜，并且在用IL-12、IL-15和IL-18过夜刺激之后在1ng/mL IL-15中静置7-14天。为了确定IL-2和TGFβ对于细胞因子产生的影响，如所述处理NK细胞，但是如在用IL-12、IL-15和IL-18进行过夜刺激中所指示的添加IL-2和/或TGF-β，以及1ng/mL IL-15，持续7-14天。为了测量细胞因子产生，将NK细胞在1ng/mLIL-15中仅静置过夜和在整个测定中静置，并且与MG63以5∶1比率共培养或仅相等数量的NK细胞(作为无靶标对照)共培养，并且如下所述进行细胞内流式染色。
RT-PCR/qPCR：使用RNAeasy试剂盒、QiaShredder柱和无RNA酶的DNA酶套装(全部为Qiagen，74104、79654、79254)分离来自新鲜的未冷冻的第14天扩增的人NK细胞的RNA，并且使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher，4368814)合成cDNA。在AppliedBiosystems 7900HT上使用Taqman快速PCR主混合物和人快速96孔TGF-β通路阵列(ThermoFisher，4418742)进行TGF-β通路的PCR。
统计分析：使用GraphPad Prism 6.0或7.0(La Jolla，加利福尼亚州，美国)，如每个图例中所述进行统计分析，小于0.05的p值被认为是显著的。
结果和讨论
IFNγ和TNFα是抗肿瘤应答中重要的两种促炎细胞因子，并且据报告它们的产生会被TGF-β抑制。为了确定由NK细胞进行的促炎细胞因子的产生，将NK细胞与亲本(未修饰的K562)加或减TGFβ一起培养2周。在2周结束时，将对照和TGFβiNK细胞与如所述的肿瘤靶标一起孵育，并且收集上清液以使用流式微珠阵列测量IFN-γ和TNF-α分泌。观察到与对照扩增NK细胞相比，在TGF-β存在和不存在的情况下IFN-γ和TNFα分泌均显著增加(图1)。
接下来，我们确定通过K562或其他肿瘤细胞进行的刺激是否是TGFβi细胞因子过多产生所必需的。为此，我们在肿瘤刺激不存在的情况下使用良好建立的IL-12、IL-15和IL-18来激活NK细胞。在将TGFβ添加到培养物时，响应于肿瘤刺激物，NK细胞产生增加的IFNγ和TNFα(图2)。
为了确定其他K562饲养细胞是否可以生成具有提高的细胞因子产生的TGFβi NK细胞，将表达mbIL-15(图3)或mbIL-21(图4)的K562在加或减TGFβ的情况下与NK细胞共培养2周。两种饲养细胞均诱导具有增加的细胞因子产生的TGFβi NK细胞。
因为已经报告了TGFβ抑制NK细胞增殖，我们测量了响应于K562mbIL-21刺激的2周增殖。为此，TGFβ并未显著影响增殖(图5)。
接下来，确定TGFβi NK细胞表型和功能的持久性。在完成2周激活之后，将TGFβiNK和供体匹配的标准NK细胞在仅低剂量IL-2中静置(例如，从TGF-β去除TGFβi NK)。在扩增结束时并且在激活之后7-33天评估TGFβi NK细胞的IFN-γ和TNF-α分泌。在激活之后，TGFβi NK细胞在基线处和在TGF-β处理的情况下均维持其IFN-γ和TNF-α分泌的增加(图6)。
此外，我们想要确定TGFβi NK细胞是否响应于各种刺激物而维持细胞因子过多产生。为此，我们发现TGFβi NK细胞响应于髓母细胞瘤和神经母细胞瘤细胞系产生增加的IFNγ和TNFα，并且细胞因子的此提高的产生可以用PHA刺激诱导，从而表明了产生增加的抗肿瘤细胞因子的固有能力(图7和图9)。
SMAD3作为NK细胞抗肿瘤功能的抑制物的功能是清楚的。SMAD3直接结合IFNγ启动子以抑制IFNγ表达，并且SMAD3-/-小鼠具有增强的NK细胞功能和降低的肿瘤生长。因此，诸位发明人通过蛋白质印迹法确定SMAD3是否在蛋白质水平方面降低，并且发现TGFβi NK具有显著减少的SMAD3蛋白(图8)。
此外，我们测试了在体外亲本K562培养的NK细胞和体内mbIL-21扩增的NK细胞的情况下TGFβi NK细胞的细胞毒性。细胞毒性未受影响(图10)。事实上，体内TGFβi NK细胞显著降低了NSG小鼠的肺中骨肉瘤的生长(图11)。
另外，使用RNA-seq分析，我们发现TGFβi NK细胞与对照NK细胞在转录上不同，从而表明除功能以外细胞表型的广泛变化(图12)。
总而言之，最可能通过关键TGF-β信号传导蛋白之一SMAD3的缺失，用TGF-β培养物扩增的人NK细胞(TGFβi NK)对TGF-β具有降低的敏感性。TGFβi NK细胞具有明显增加的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF分泌。出人意料地，并且相比于先前的论文，TGF-β并未抑制TGFβiNK细胞的整个2周增殖。Bellone等人，J Immunol 155∶1066-1073(1995)。先前的论文中用于诱导增殖(IL-2和IL-15)的刺激条件和时间点可能是增殖中观察到的差异的关键原因。TGF-β对于NK细胞增殖的影响的先前测量检查到短期增殖而不是2周增殖。Viel等人，Science signaling 9：ra19(2016)。诸位发明人提出：用肿瘤激活进行的慢性TGF-β刺激驱动了NK细胞的特定子集(可能是SMAD3阴性而存活的那些NK细胞)的激活。这些SMAD3阴性NK细胞对于细胞培养基中通过TGF-β进行的SMAD3的磷酸化具有抗性，从而允许增殖增加。Oida等人，Journal of immunological method362：195-198(2010)。
评估TGFβi NK细胞产生IFN-γ和TNF-α的能力，因为这些细胞因子可以抑制TGF-β，并且相反地，TGF-β可以抑制IFN-γ和TNF-α的产生。出人意料地，发现在具有和不具有TGF-β处理的两种情况下，与标准NK细胞相比，TGFβi NK细胞中抗肿瘤IFN-γ和TNF-α分泌明显增加。先前的研究证明了，SMAD3缺失增加基线IFN-γ产生，因此，可能相似的机制在不表达SMAD3的TGFβi NK细胞中发生。Tang等人，Nat Commun 8：14677(2017)。据报告，TGF-β抑制原代NK细胞中的TNFα产生(Bellone等人，J Immunol 155：1066-1073(1995))。出乎意料地，与标准NK细胞相比，TGFβiNK细胞在测定培养基中在具有或不具有TGF-β的情况下具有显著增加的TNF-α分泌。对于TNF-α产生的调节了解较少，但是也已知其被TGFβ抑制，所以发现TGFβi NK细胞中TNF-α分泌增加是出乎意料的。
虽然已参考本发明的优选实施方案特定地显示并描述了本发明，但本领域技术人员将理解，在不背离随附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在本发明中作出各种形式和细节的变化。前述说明书中引用的所有专利、出版物和参考文献均通过引用以其整体并入本文。

Claims (25)

1.一种治疗有需要的受试者的癌症或感染性疾病的方法，其包含向所述受试者施用治疗有效量的具有转化生长因子-β(TGF-β)超家族印记的自然杀伤(TGFβi NK)细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有感染性疾病。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒感染。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述癌症选自由白血病、淋巴瘤、横纹肌肉瘤、脑癌和骨癌组成的群组。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述TGFβi NK细胞对TGF-β具有抗性。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述TGFβi NK细胞产生增加量的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述TGFβi NK细胞显示降低水平的SMAD3蛋白和/或TGFBR3蛋白。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述TGFβi NK细胞具有与图12中所示的基本上相似的基因表达谱。
11.根据权利要求1所述的方法，其中将所述TGFβi NK细胞与药学上可接受的载体一起施用。
12.一种自然杀伤(NK)细胞或NK细胞系，其对TGF-β超家族细胞因子展现出增加的抗性。
13.根据权利要求12所述的NK细胞或细胞系，其中所述NK细胞或细胞系对TGF-β展现出增加的抗性。
14.根据权利要求12所述的NK细胞或细胞系，其中所述NK细胞产生增加量的IFN-γ、TNF-α和GM-CSF中的一种或多种。
15.根据权利要求12所述的NK细胞或细胞系，其中所述NK细胞显示降低水平的SMAD3蛋白和/或TGFBR3蛋白。
16.根据权利要求12所述的NK细胞或细胞系，其中所述NK细胞具有与图12中所示的基本上相似的基因表达谱。
17.根据权利要求12所述的NK细胞或细胞系，其中通过在TGF-β的存在下进行自然杀伤细胞的体外激活来制备所述NK细胞。
18.根据权利要求12所述的NK细胞或细胞系，其中所述NK细胞是人NK细胞。
19.根据权利要求12所述的NK细胞或细胞系，其中所述NK细胞是犬NK细胞。
20.一种制备具有TGF-β超家族印记的自然杀伤(TGFβi NK)细胞系的方法，其包含在TGF-β超家族细胞因子的存在下进行自然杀伤细胞的体外激活。
21.根据权利要求20所述的方法，其中将所述TGFβi NK细胞系在TGF-β的存在下激活。
22.根据权利要求20所述的方法，其进一步包含在白血病饲养细胞的存在下进行自然杀伤细胞的体外激活。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述饲养细胞是K562饲养细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中将所述K562饲养细胞进行基因修饰以表达共刺激蛋白和/或细胞因子。
25.根据权利要求20所述的方法，其进一步包含在NK刺激性外泌体或NK刺激性纳米颗粒的存在下进行自然杀伤细胞的体外激活。
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