CN111807979A - 两性离子氟化交联剂、纳米凝胶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了由两性离子氟化单体与两性离子氟化交联剂共聚制备的两性离子氟化纳米凝胶，涉及两性离子氟化交联剂和纳米凝胶的制备方法，以及作为氟‑19磁共振成像(19F MRI)纳米造影剂的应用。

Description

两性离子氟化交联剂、纳米凝胶及其应用
技术领域
本发明涉及由两性离子氟化单体与两性离子氟化交联剂共聚制备的两性离子氟化纳米凝胶，尤其是将两性离子氟化纳米凝胶作为19F MRI纳米造影剂的应用。
背景技术
多种疾病的早期监测，需要开发无创的诊断工具，从而实施有针对性的治疗，是当前医学面临的主要挑战之一，其中成像技术起着关键作用，而磁共振成像(MRI)无需使用放射性核素，不存在电离辐射，在临床的成像应用中极具潜力。
20世纪70年代初，Lauterbur等奠定了核磁共振成像的基础，其依赖于氢原子(1H)在外部磁场作用下的排列和进动。多年来，临床1H MRI利用活体组织中的大量流动水及其氢原子的不同弛豫特性，获得了高空间分辨率和良好软组织对比度等生理解剖信息。然而，由于正常组织与病灶之间对比度或弛豫率的变化不显著，容易导致假阳性或假阴性，图像解释因此受到干扰。
为了解决背景干扰问题，研究人员采用异核磁共振原子(如13C、23Na、31P或19F)发展了“第二色”或“热点”成像。在异核原子成像中，该原子的磁共振图像为相应的灰度1H MRI图像提供的解剖信息增加了第二层独立信息，Holland等人于1977年首次证明该成像方法的可行性。19F原子具有优异的核磁共振特性：天然丰度为100％，自旋量子数为1/2，磁旋比接近1H(40.08vs 42.58MHz/T)，灵敏度为1H的83％，此外19F原子对局部环境更加敏感，化学位移变化范围更广(>350ppm)，并且只有微量的19F(<10-6M)以固态形式存在于骨骼和牙齿中，背景信号远低于MRI检测限，因此19F原子成为继1H MRI成像后的另一种成像原子。
造影剂中19F原子的含量与19F MRI信号呈正相关，因此高对比度的19F MRI图像需要高密度的19F原子即高浓度的含氟造影剂。全氟化碳(PFCs)是所有氢原子都被氟原子取代的有机化合物，是最先被用于19F MRI研究的造影剂，如全氟溴辛烷(PFOB)，全氟聚醚(PFPEs)和全氟冠醚(PFCE)等。由于C-F键的键能高，并且氟原子具有高电负性和低极化率，PFCs通常表现为高热稳定性、化学稳定性和氧化稳定性，极性低，分子间相互作用力和表面张力低，高度疏水疏脂，因此易与周围环境分离形成聚集态。这些独特的物理化学特性决定了PFCs独特的生物特性：PFCs是最具生物惰性的有机外源性物质，即使高剂量也通常无毒；它们通常在生理pH值下不会被降解，不会被酶代谢，而是通过网状内皮系统被清除或通过呼气从肺排出；造影剂中氟原子通过共价键结合，这些分子比基于镧系的1H MRI造影剂更稳定，这些优异的生物特性使得PFCs在某些特定的医学应用具有很大潜力。由PFCs超疏水全氟化物制备的纳米乳造影剂，被率先用于免疫细胞示踪和分子影像研究。其中，EricT.Ahrens团队首次利用PFPE纳米乳(CS-1000,Celsense,Inc.)标记树突状细胞，在大肠腺癌患者的注射位点检测到了19F MRI信号“热点”，这项研究工作证明了利用19F MRI进行临床研究的可行性。但是，PFCs纳米乳造影剂依旧存在很多问题：全氟化物分子为超疏水性，需使用表面活性剂形成纳米乳液，然而纳米乳稳定性差，易发生絮凝、聚集、分相和Ostwald熟化等；全氟化物的弛豫速率受组织氧含量影响显著，难以建立统一的定量计算方法；全氟化物纳米乳纵向弛豫时间(T1)长，导致成像时间过长；特别是，全氟化物纳米乳造影剂静脉注射后，在肝脏和脾脏中快速累积，不仅不适于靶向分子影像研究，而且可滞留长达数月甚至更久，存在潜在的安全性问题。
为了克服上述问题，很多团队利用两亲性氟化聚合物和多肽等大分子自组装，构建“智能”19F MRI纳米造影剂，其作用机理是：强疏水性的含氟单元/链段的疏水聚集使含氟链段运动“冻结”，氟原子之间强烈的自旋耦合导致横向弛豫时间大大缩短(T2→0)，激发后19F MRI信号迅速衰减，在系统还未开始采集信号之前横向磁化强度已经衰减至零或接近零，图像上表现为低信号或无信号，从而使19FMRI信号为“关闭”状态；当在特定生物活性分子存在条件下，分子组装被剧烈扰动，含氟链段“解冻”，使19F MRI信号“开启”。智能19F MRI纳米造影剂在酶、pH、氧化还原微环境、离子和活性氧等生物活性分子或生物信号检测，以及肿瘤诊断等方面表现出巨大潜力。但是，氟含量低和含氟链段疏水聚集导致信号衰减，严重制约了自组装纳米造影剂体内成像效果，以及定量研究的可行性和准确性。为了使自组装纳米造影剂在生物信号刺激下发生解组装，必须将分子结构中强疏水性的氟含量控制在一定范围(通常<10w％)，否则含氟单元/链段的疏水聚集和高浓度纳米组装体的聚集，使纳米造影剂失去对生物信号的响应性。受此限制，即使进一步增加分子结构中的氟含量不仅不会增强，反而会加剧疏水聚集导致的信号衰减。
综上所述，研发理想的纳米造影剂是获得高信噪比体内成像效果的基础，是促进19F MRI在生物医学领域中定位和定量研究应用亟待解决的关键问题。理想的19F MRI纳米造影剂应满足如下要求：(i)磁等价氟含量高，含氟单元/链段亲水性强；(ii)水溶液中单一、狭窄(半峰宽<100Hz)19F磁共振波谱(19F MRS)；(iii)短T1，长T2；(iv)复杂生物环境中稳定的磁共振性质；(v)19F MRS/MRI信号强度与造影剂的氟含量之间呈线性正相关关系；(vi)生物利用度高。
因此，本发明提供了一种由两性离子氟化单体与两性离子氟化交联剂共聚制备的两性离子氟化纳米凝胶，涉及两性离子氟化交联剂和纳米凝胶的制备方法，特别是作为19FMRI纳米造影剂的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两性离子氟化交联剂，具有如下化学结构通式：
Figure BDA0002511061260000031
其中，
R1和R2分别独立选自氢、C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R3选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L1和L2分别独立选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L3和L4分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A1选自C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种两性离子氟化纳米凝胶，由两性离子氟化单体与上述两性离子氟化交联剂共聚制备，其中，交联单元具有如下化学结构通式：
Figure BDA0002511061260000041
R1和R2分别独立选自C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R3选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L1和L2分别独立选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L3和L4分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A1选自C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子；
x是5-5000的整数；
其中重复单元具有如下化学结构通式：
Figure BDA0002511061260000042
R4选自氢、C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R5选自C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R6选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L5选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L6和L7分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A2选自C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子；
n是5-10,000的整数；
*表示重复单元或交联单元共价链接到相邻重复单元或交联单元的点。
进一步地，其中R1和R2分别独立优选自C1-C3烷基。
进一步地，其中R3优选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基。
进一步地，其中L1和L2分别独立优选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-的基团，其中n是1-6的整数；
进一步地，其中L3和L4分别独立优选自-(CH2)n-，其中n是1-6的整数；
进一步地,其中M+选自金属离子或有机离子。
进一步地，其中X-选自含有卤化物、羧酸盐、烷基磺酸盐、硫酸盐；硝酸盐、高氯酸盐、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、三氟甲基磺酸盐、双(三氟甲基磺酰)酰胺、乳酸和水杨酸盐等的基团。
进一步地，其中A1优选自C或SO。
进一步地，其中R1和R2优选为甲基，R3优选为三氟甲基，L1和L2优选为-C(＝O)O-(CH2)2-，L3优选为-(CH2)-，L4优选为-(CH2)2-，A1优选为C，n优选为10-500的整数。
进一步地，其中R4和R5优选为甲基，R6优选为三氟甲基，L5优选为-C(＝O)O-(CH2)2-，L6优选为-(CH2)-，L7优选为-(CH2)2-，A2优选为C，x优选为10-200的整数。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种两性离子氟化纳米凝胶，将其作为19F MRI纳米造影剂的应用。
本发明所要解决的再一技术问题是提供一种标记细胞和通过19F MRI示踪细胞的19F MRI纳米造影剂，其中所述的19F MRI纳米造影剂由权利要求2-11中任一项的两性离子氟化纳米凝胶制备。
进一步地，其中细胞选自多种组织细胞，例如肌肉、肝脏、胰腺、肾脏、脑或皮肤、免疫细胞、多种类型的干细胞及血源细胞。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种负载、递送和通过19F MRI示踪治疗剂的19F MRI纳米造影剂，其中所述的19F MRI纳米造影剂由权利要求2-11中任一项的两性离子氟化纳米凝胶制备。
进一步地，其中治疗剂选自小分子、核酸、蛋白质(包括多聚蛋白质、蛋白质复合物、肽)、脂质、碳水化合物、金属、放射性元素和/或其组合。
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种负载、递送和和通过19F MRI示踪诊断剂的19F MRI纳米造影剂，其中所述的19F MRI纳米造影剂由权利要求2-11中任一项的两性离子氟化纳米凝胶制备。
进一步地，其中诊断剂选自放射性核素(包括125I、131I、90Y、88Y、111In、64Cu、99mTc和18F)、荧光剂(包括荧光素、罗丹明、吖啶染料、Alexa染料、菁染料)、荧光蛋白(包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强GFP、红色、蓝色、黄色、青色和蓝宝石荧光蛋白)，发光蛋白(包括荧光素酶、aeqourin及其衍生物)、MRI造影剂(包括钆螯合物、铁、镁、锰、铜和铬)和/或其组合。
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种键合和通过19F MRI示踪靶向剂的19FMRI纳米造影剂，其中所述的19F MRI纳米造影剂由权利要求2-11中任一项的两性离子氟化纳米凝胶制备。
进一步地，其中靶向剂选自任何适当分子，包括但不限于蛋白质、肽、多糖或寡糖、糖蛋白、脂质和脂蛋白、核酸，以及具有特定生物活性的合成有机或无机分子，例如抗生素、抗炎剂或细胞粘附介质。
有益效果：
1.本发明的两性离子氟化纳米凝胶，在每个结构单元均含有两性离子结构，使两性离子氟化纳米凝胶具有卓越的抗蛋白吸附能力，从而在复杂的生物环境中保持稳定的磁共振性质，从而保证其作为19F MRI纳米造影剂的灵敏度，以及定位和定量研究的可行性和准确性。
2.本发明的两性离子氟化纳米凝胶可以通过19F MRS/MRI在生物样品/系统中检测而无需放射性同位素或荧光分子标记，这对多模式成像探针和可见纳米药物/纳米疫苗的开发具有重要意义，其生物命运可以以无创、实时和定量的方式进行监测。
3.本发明的两性离子氟化纳米凝胶粒径分布均匀，制备方法具有可行性和可控性好，粒径小于100nm，有利于降低被Kupffer细胞和脾脏滤过清除的机会，有利于通过增强渗透性和滞留效应更有效地向肿瘤外渗。
4.本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶具有良好的血清稳定性，在与100％胎牛血清(FBS)共同孵育168h的过程中，能够保持其原有的粒径。
5.本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在血液和组织匀浆(心、肝、脾、肺和肾)中具有优异而稳定的磁共振性质，获得强烈的19F MRI信号。另外，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRS信号强度与其在血液中的浓度呈线性关系，有利于建立评价造影剂代谢动力学的定量测量方法。
6.本发明提供的anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶标记树突状细胞，被标记的树突状细胞的19F MRI信号强度与被标记的细胞数呈线性关系。在BALB/c小鼠皮下注射被anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶标记的树突状细胞后，检测到强烈的19F MRI信号，表明利用无创无辐射损伤的19F MRI技术示踪细胞的可行性。
7.被本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶标记的细胞可以通过19F MRI技术检测，由于缺乏内源性背景信号，19F在生物体中的含量极低，而且通常不以液态核磁共振技术可检测到的化学形式存在，使19F MRI技术成为生物系统的良好成像工具。这与传统的1H MRI截然不同，后者虽然提供了精细解剖结构的可视化，但不允许对特定细胞群进行选择性检测。19F MRI技术允许全身或局部筛查，19F MRI检测到被两性离子氟化纳米凝胶标记的细胞在活体中分布的精确位置。
8.本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶作为19F MRI纳米造影剂标记细胞，可用于监测细胞疗法在活体的或在任何其他需要的环境中的行为，如组织外植体。例如，通过19FMRI技术进行体内监测可能有助于评估给药细胞的生存能力。医生可以根据给药后在患者体内检测到标记细胞的程度来调整给药计划。体内监测也可能有助于确定治疗细胞是否已定位到所需位置。一般来说，研究治疗细胞在体内的迁移行为、治疗细胞在体内的数量和/或存活率与治疗结果之间的关系是可能的。当这种相关性已经建立时，治疗细胞的体内成像可以作为一种预后指标，可能有助于选择适当的剂量、给药模式和有利于患者的额外治疗干预措施。本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶作为19F MRI纳米造影剂标记细胞的进展，将有益于广泛的细胞治疗策略，因为这些成像方法将能够检测治疗细胞何时、何地以及是否已在体内被运送到所需靶点。
9.本发明提供的OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的粒径和形貌，与原始的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶相比，OVA的负载对其粒径和形貌没有造成明显的影响，证明两性离子氟化纳米凝胶具有高效地负载和递送治疗剂的能力。在BALB/c小鼠皮下注射OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶后，检测到强烈的19FMRI信号，证明可以利用无创无辐射损伤的19F MRI技术准确示踪治疗剂。
10.本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶可以有效地负载、递送和通过19FMRI示踪诊断剂。本发明提供的USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶，能够显著提高USPIO的血清稳定性。本发明提供的USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶，PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶与USPIO纳米粒子表面的Fe3+之间的静电相互作用顺磁弛豫增强效应，加速了19F的弛豫。本发明提供的USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶能够作为19F MRI和1H MRI双模态的造影剂，具有广阔的应用前景。
11.本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶其作为19F MRI纳米造影剂可用于疾病治疗和诊断目的，可通过共价键合的方式在两性离子氟化纳米凝胶表面上键合靶向剂，以增强其靶向效率。本发明提供的cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶，静脉注射12h后，在肿瘤血管周围区域检测到强烈的19F MRI信号；相比之下，静脉注射PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的小鼠，肿瘤部位的19F MRI信号强度显著降低，这种差异证明了本发明提供的cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶靶向整合素受体对肿瘤靶向精准诊断的重要作用。
附图说明
图1示出了本发明中具有代表性的两性离子氟化交联剂的化学结构，参见化合物1，这里称为CBMAF3X；具有代表性的两性离子氟化单体的化学结构，参见化合物2，这里称为CBMAF3。
图2示出了本发明中具有代表性的两性离子氟化交联剂CBMAF3X的合成路线。图3A显示了PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的合成路线。
图3B显示了具有不同PCBMAF3和PCBMAF3X摩尔比的PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的粒径分布。本发明提供的具有不同交联度的PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶粒径分布均匀，说明制备方法可行，可控性好。
图3C显示了本发明的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的形貌，其中清楚地观察到球形形貌。
图3D显示了本发明的不同交联度的PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的接触角，证实了PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶具有超亲水性。
图3E通过测量两性离子氟化纳米凝胶的尺寸随时间的变化，显示了本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在100％胎牛血清(FBS)中的稳定性。
图3F所示，在本发明的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19FMRS中，仅检测到一个半峰宽约为58Hz的尖峰。
图3G所示，本发明的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶19FMRS的信号强度与PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶浓度在1.0-100mg/mL范围内呈线性关系。
图3H所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的T1和T2值，未受PCBMAF3和PCBMAF3X比例变化的影响。
图3I所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的T1和T2值分别约为450ms和55ms，在0.1-100mg/mL的浓度范围内变化不明显。
图4A所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在与血液和组织匀浆(心、肝、脾、肺和肾)共同孵育一周后，其T1和T2弛豫时间没有发生显著变化。
图4B所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在与血液和组织匀浆(心、肝、脾、肺和肾)共同孵育一周后，其19F MRS的信号强度未发生明显变化。
图4C所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在血液中的19F MRS的信号强度与PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶浓度呈线性关系。
图4D所示，在浓度为20mg/mL的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的血液和组织匀浆(脏、脏、脏、肺和脏)样本中，检测到强烈的19F MRI信号。
图4E所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶即使在高浓度(50mg/mL)下，也具有极低的细胞毒性。
图4F所示，交联剂PCBMAF3X的摩尔比未对两性离子氟化纳米凝胶的细胞毒性产生明显影响，对于含有5％-30％摩尔比PCBMAF3X交联剂的两性离子氟化纳米凝胶，没有观察到明显的细胞毒性。
图5A示出了本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶与抗CD11c抗体(anti-CD11c)结合的合成路线(anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10))。
图5B显示了用anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)标记的树突状细胞的19FMRI信号，被标记的树突状细胞分散在0.5ml离心管中，离心管随着细胞数的减少而排列，信号强度与被标记的细胞数呈线性关系。
图5C显示了注射在BALB/c小鼠皮下的anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)标记的树突状细胞的19F MRI信号。MRI图像：左，高分辨率1H MRI图像与19F MRI图像叠加，其中19F MRI图像中的色条代表信号强度。
图6A显示了OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的粒径和形貌。
图6B显示了OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶，注射于雌性BALB/c小鼠皮下，获得19F MRI图像。
图7A显示了USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)的19F MRS，表明PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶成功负载USPIO。
图7B显示了通过TEM观察到的USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)和USPIO的形态。PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶对USPIO的负载，对USPIO纳米粒子的形貌未产生明显影响。
图7C显示了USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)的T1和T2弛豫时间，分别为329ms和43ms，这与上述半峰宽的变宽是一致的。证实了Fe3+对19F的顺磁弛豫增强效应。
图7D所示，在具有相同浓度19F的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶和USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液中，在扫描时间相同的情况下，USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRI信号强度高于PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶。
图7E和F显示了USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液中1H的T1和T2弛豫时间，及其随铁离子浓度的变化拟合曲线。1H的T1和T2弛豫时间与USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶溶液中铁离子的浓度成反比，表明USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶加速了净磁化强度的恢复。
图7G表明随着随着USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液中铁浓度的增加，T1加权磁共振信号正增强，T2加权磁共振信号负增强。
图7H显示了商业化USPIO-PEG2000和USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在100％血清中的稳定性。结果表明，PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶对USPIO的负载可以显著提高其血清稳定性。
图8A所示，在相同浓度的19F条件下，与cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶相比，未键合cRGD靶向基团的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的细胞摄取量很低，表现为共同孵育后HUVEC的19F MRS信号强度的显著差异。
图8B所示，静脉注射cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶12h后，主要在肿瘤血管周围区域(以椭圆形框架突出显示)检测到强烈的19FMRI信号，在1H MRI图像中可以清晰地观察到肿瘤与邻近组处血管。
具体实施方式
本发明提供了由两性离子氟化单体与两性离子氟化交联剂共聚制备的两性离子氟化纳米凝胶，涉及两性离子氟化交联剂和纳米凝胶的制备方法，以及作为氟19F MRI纳米造影剂的应用。
在本说明书和所附权利要求中，使用以下术语，其在下文中解释。
氟-19，简称19F，是氟的最稳定同位素，用于19F MRS和19F MRI。
“氟化”是指某些氢原子被氟取代的碳氢化合物部分。
“全氟化”是指基本上所有氢原子都被氟取代的碳氢化合物部分。
除非另有说明，“聚合物”包括均聚物和共聚物。
“造影剂”是一种在医学成像中用来增强体内结构或液体对比度的物质。
磁共振成像是一种非侵入性的医学成像技术，在放射学中经常用来显示人体内部的详细结构。与计算机断层扫描(CT)相比，MRI在不同的身体软组织之间提供了更高的对比度，这使得MRI在神经、肌肉骨骼、心血管和肿瘤成像中具有重要意义。
19F原子具有优异的核磁共振特性：天然丰度为100％，自旋量子数为1/2，磁旋比接近1H(40.08vs 42.58MHz/T)，灵敏度为1H的83％，此外19F原子对局部环境更加敏感，化学位移变化范围更广(>350ppm)，并且只有微量的19F(<10-6M)以固态形式存在于骨骼和牙齿中，背景信号远低于19F MRI检测限。
“弛豫时间”是指核磁共振信号的退化按两个独立的过程进行分析，每个过程都有自己的时间常数。与纵向弛豫时间(T1)相关的一个过程是信号强度损失的原因。另一个过程与横向弛豫时间(T2)有关，负责信号的展宽。更明确地说，T1是物理过程的时间常数，该物理过程负责核自旋磁化矢量M的成分与外部磁场B0(通常沿z轴定向)平行的弛豫。T2弛豫影响M垂直于B0的分量。在传统的核磁共振波谱中，T1决定了循环时间，即获得核磁共振波谱的速率。T1的值从毫秒到几秒不等。
近年来，由于水凝胶具有较高的载药能力和良好的生物相容性，人们越来越关注开发纳米尺度的水凝胶颗粒，即纳米凝胶，用于治疗和诊断。
目前纳米粒给药载体和诊断试剂的主要挑战之一，是静脉给药后的血液循环时间有限，肝脏和脾脏由于非特异性蛋白质吸附快速清除。因此，血液中纳米颗粒的稳定性，对药物传递或基于纳米颗粒的诊断的成功至关重要。为了延长血液循环时间，纳米颗粒被中性和亲水性材料修饰以减少非特异性蛋白质从血液中的吸附。尽管已经开发出许多材料来抵抗非特异性蛋白质的吸附，但很少有材料能达到超低污染水平，即吸附纤维蛋白原小于5ng/cm。本发明的两性离子氟化纳米凝胶，在每个结构单元均含有两性离子结构，有望使两性离子氟化纳米凝胶具有卓越的抗蛋白吸附能力，从而在复杂的生物环境中保持稳定的磁共振性质，从而保证其作为19F MRI纳米造影剂的灵敏度，以及定位和定量研究的可行性和准确性。
目前纳米药物载体的另一个挑战是静脉全身给药后的特异性跟踪。与目前使用的亲水性聚合物如聚乙二醇、多糖、两性离子聚合物和聚(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(PHPMA)相比，本发明的两性离子氟化纳米凝胶可以通过19F MRS/MRI在生物样品/系统中检测而无需放射性同位素或荧光分子标记，这对多模式成像探针和可见纳米药物/纳米疫苗的开发具有重要意义，其生物命运可以以无创、实时和定量的方式进行监测。
两性离子氟化交联剂
在一个方面，本发明提供两性离子氟化交联剂。两性离子氟化交联剂可与适当的可聚合单体和共聚单体共聚，得到交联聚合物和交联共聚物。
两性离子氟化交联剂有利于通过与一种或多种两性离子氟化单体共聚，制备交联聚合物和交联共聚物，例如两性离子氟化纳米凝胶。
在一个实施例中，两性离子氟化交联剂，具有化学结构通式(I)：
Figure BDA0002511061260000131
其中，
R1和R2分别独立选自氢、C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R3选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L1和L2分别独立选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L3和L4分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A1为C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子。
在一个实施例中，R1和R2分别独立优选自C1-C6烷基；在一个实施例中，R1和R2优选为甲基。
在一个实施例中，R3优选为三氟甲基。
在一个实施例中，L1和L2分别独立优选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-的基团，其中n是1-6的整数；在一个实施例中，L1和L2优选为-C(＝O)O-(CH2)2-。
在一个实施例中，其中L3和L4分别独立优选自-(CH2)n-，其中n是1-6的整数；在一个实施例中，L3优选为-(CH2)-，L4优选为-(CH2)2-。
在一个实施例中，A1优选为C。
图1示出了本发明具有代表性的两性离子氟化交联剂的化学结构，参见化合物1，这里称为CBMAF3X。本发明具有代表性的两性离子氟化交联剂CBMAF3X的制备在实施例1中描述，并在图2中示出合成路线。
两性离子氟化纳米凝胶
在另一方面，本发明提供了两性离子氟化单体与两性离子氟化交联剂共聚制备的两性离子氟化纳米凝胶。
本发明所述的两性离子氟化纳米凝胶，是交联的两性离子氟化聚合物，含有重复单元和源于两性离子氟化交联剂的交联单元。
在另一方面，本发明所述的两性离子氟化纳米凝胶，其可用作19F MRI纳米造影剂，以及治疗剂和诊断剂的负载、递送和通过19F MRI示踪的载体。
在一个实施例中，本发明所述的两性离子氟化纳米凝胶，是由两性离子氟化交联剂与适当的可聚合两性离子氟化单体共聚制备的交联聚合物。在此实施例中，本发明所述的纳米凝胶的重复单元的化学结构式(II)如下所示：
Figure BDA0002511061260000151
其中，
R4选自氢、C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R5选自C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R6选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L5选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L6和L7分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A2为C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子；
n是5-10,000的整数。
*表示重复单元共价链接到相邻重复单元的点。
在一个实施例中，R4和R5优选自C1-C3烷基。
在一个实施例中，R4和R5优选为甲基。
在一个实施例中，R6优选为三氟甲基。
在一个实施例中，L5优选自-C(＝O)O-(CH2)n-，其中n是1-10的整数。
在一个实施例中，L5优选为-C(＝O)O-(CH2)2-。
在一个实施例中，L6优选自-(CH2)n-，其中n是1-10的整数。
在一个实施例中，L6优选为-(CH2)-。
在一个实施例中，L7优选自-(CH2)n-，其中n是1-10的整数。
在一个实施例中，L7优选为-(CH2)2-。
在一个实施例中，A2优选为C。
在某些实施例中，n优选为10-5000的整数。
在一个实施例中，本发明所述的纳米凝胶的交联单元的化学结构式(III)如下所示：
Figure BDA0002511061260000161
其中，
R1和R2分别独立选自氢、C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R3选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L1和L2分别独立选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L3和L4分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A1为C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子。
x是5-5000的整数。
*表示交联剂重复单元共价连接到相邻重复单元或两性离子交联剂单元的点。
在一个实施例中，R1和R2分别独立优选自C1-C3烷基。
在一个实施例中，R1和R2优选为甲基。
在一个实施例中，R3优选为三氟甲基。
在一个实施例中，L1和L2分别独立优选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-的基团，其中n是1-6的整数。
在一个实施例中，L1和L2优选为-C(＝O)O-(CH2)2-。
在一个实施例中，L3和L4分别独立优选自-(CH2)n-，其中n是1-6的整数。
在一个实施例中，L3优选为-(CH2)-。
在一个实施例中，L4优选为-(CH2)2-。
在一个实施例中，A1优选为C。
在一个实施例中，x优选为5-3000的整数。
在一个实施例中，R1和R2优选为甲基，R3优选为三氟甲基，L1和L2优选为-C(＝O)O-(CH2)2-，L3优选为-(CH2)-，L4优选为-(CH2)2-，A1优选为C，x优选为10-500的整数。
以下是对上述化学结构式(I)-(III)中两性离子氟化交联剂、共聚物的描述。
在上述结构式中，具有代表性的聚合物骨架包括乙烯基骨架(如-C(R')(R")-C(R'")(R"")-，其中R',R",R'",和R""分别独立地选自氢、烷基和来自乙烯基的单体(例如，丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯的芳基)。
类似地，在上述结构式中，CH2＝C(R)-是可聚合的基团。可以理解为，包括上述的可聚合基团在内的其他可聚合基团，可用于提供本发明所述的单体和聚合物。
在上述结构式中，N+是一种季铵(例如，L1,L2,L3,L4,L5,L6,L7和R5键合到N上)，作为阳离子中心。
A(＝O)-O为阴离子中心，阴离子中心可以是羧酸酯(A为C)，可以是磺酸(A为SO)，可以是膦酸(A为P或PO)。
R1,R2和R4分别独立选自氢、烷基和芳基；典型的烷基包括C1-C12直链烷基；典型的芳基包括C6-C12芳基，例如苯基。
R5优选自典型的烷基，包括C1-C12直链烷基；优选自典型的芳基包括C6-C12芳基，例如苄基。
R3和R6分别独立选自氟化烷基基团，包括单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基。
L1,L2和L5是将阳离子中心共价连接到聚合物主链的连接体。
典型的L1,L2和L5基团包括-C(＝O)O-(CH2)n-或-C(＝O)NH-(CH2)n-，其中n是1-20的整数(例如，2)。
L3和L6是共价连接阳离子中心和阴离子基团(即(A＝O)O)的连接体。L3和L6可以是C1-C20的烷基链。代表性的L3和L6包括-(CH2)n-，其中n是1-20的整数(例如1、3或5)。
L4和L7是将氟化烷基共价偶联到阳离子中心的连接体。L4和L7可以是C1-C20的烷基链。代表性的L4和L7包括-(CH2)n-，其中n是1-20的整数(例如2、3或5)。
X-是与阳离子中心静电相互作用的反离子。反离子可以是阳离子聚合物或单体合成的反离子(例如，CI-、Br-或I-)。最初由合成阶段引入的反离子也可以与其他合适的反离子交换，以提供具有可控水解性能和其他生物性能的聚合物。
图1示出了具有代表性的两性离子氟化单体的化学结构，见化合物2，这里称为CBMAF3。
实例2中描述了具有代表性的两性离子氟化纳米凝胶PCBMAF3/PCBMAF3X的制备和表征。
PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的合成路线和表征如图3所示。
图3A显示了PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的合成路线。采用微乳液自由基聚合法合成了PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶。
由于PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶作为治疗剂和诊断剂负载和递送载体的潜在应用，涉及蛋白质、DNA或RNA等对温度敏感的生物活性化合物，因此在40℃下使用低温自由基引发剂引发聚合。
图3B显示了具有不同PCBMAF3和PCBMAF3X摩尔比的PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的粒径分布。纳米粒子的大小对其血液循环时间有很大的影响。据报道，小于200nm的纳米颗粒被Kupffer细胞和脾脏滤过清除的机会较小。此外，还报道小颗粒(<200nm)可以通过增强渗透性和滞留效应更有效地向肿瘤外渗。
在本发明中，通过调节表面活性剂的比例和浓度，纳米凝胶的尺寸保持在200nm以下。用动态光散射分析了PBS(pH 7.4)中的PCBMAF3/PCBMAF3X纳米凝胶的粒径和多分散性(表1)。含有5％-30％摩尔比的PCBMAF3XPCBMAF3/PCBMAF3X纳米凝胶的粒径小于100nm。本发明提供的具有不同交联度的PCBMAF3/PCBMAF3X纳米凝胶粒径分布均匀，说明制备方法可行，可控性好。
表1
Figure BDA0002511061260000191
图3C显示了本发明的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的形貌，其中清楚地观察到球形形貌。
如图3D所示，本发明不同交联度的PCBMAF3/PCBMAF3X纳米凝胶的接触角约为8°，证实了PCBMAF3/PCBMAF3X纳米凝胶具有超亲水性。
图3E通过测量纳米凝胶的尺寸随时间的变化，显示了本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶在100％胎牛血清(FBS)中的稳定性。本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶在与100％胎牛血清(FBS)共同孵育168h的过程中，能够保持其原有的粒径。静脉注射纳米凝胶的主要挑战是，血液蛋白质在纳米凝胶上的吸附会破坏纳米凝胶的稳定性，并导致肝、脾和巨噬细胞在纳米凝胶未达到预定目标之前被快速清除。中性和亲水性材料被包覆在纳米粒子上以减少非特异性蛋白质的吸附。
如图3F所示，在本发明的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶的19F MRS中，仅检测到一个半峰宽约为58Hz的尖峰。这有利于提高磁共振信号的灵敏度，因为19FMRI信号是通过选择性地激发最大的峰值和最佳的脉冲序列获得的。
如图3G所示，本发明的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶19F MRS的信号强度与PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶浓度在1.0-100mg/mL范围内呈线性关系。结果表明，PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶即使在高浓度溶液中也不会发生聚集，这可归因于本发明的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶的超亲水性。
如图3H所示，本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶PCBMAF3/PCBMAF3X的T1和T2值，未受PCBMAF3和PCBMAF3X比例变化的影响。纳米造影剂良好的弛豫率在19FMRI中起着至关重要的作用。为了避免信号饱和，重复时间(TR)最好足够长(TR≥5T1)，以便在再次扰动之前能够完全恢复纵向磁化。因此，在自旋回波序列的固定扫描时间(Ts＝TR×相位矩阵×平均数)内，T1值直接影响19FMRI数据采集的效率。同时，必须保持足够的链段运动以确保足够的横向弛豫，否则，如果T2与回波时间(TE)相当，则信噪比(SNR)将受到影响，导致19F MRI信号在数据采集之前发生衰减。
如图3I所示，本发明的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶的T1和T2值分别约为450ms和55ms，在0.1-100mg/mL的浓度范围内变化不明显。本发明的两性氟化纳米凝胶具有超亲水性和良好的弛豫性能，将有利于建立一种统一的信号采集和定量检测方法。
在一个方面，本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶优选用作人体或动物身体上的19F MRI纳米造影剂。为了使19FMRI充分发挥作用，两性离子氟化纳米凝胶在复杂的生物体系中具有稳定的弛豫性质是非常重要的。因此，进一步评价了本发明提供的代表性的两性离子氟化纳米凝胶PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)在血液和组织匀浆(心、肝、脾、肺和肾)中的弛豫性质。
在实施例3中描述了PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在血液和组织匀浆(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)中的磁共振性质。表征结果如图4所示。
如图4A所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在与血液和组织匀浆(心、肝、脾、肺和肾)共同孵育一周后，其T1和T2弛豫时间没有发生显著变化。
如图4B所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在与血液和组织匀浆(心、肝、脾、肺和肾)共同孵育一周后，其19F MRS的信号强度未发生明显变化。
如图4C所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在血液中的19F MRS的信号强度与PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶浓度呈线性关系。这将有助于建立评价药物动力学的定量测量方法。
如图4D所示，在浓度为20mg/mL的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的血液和组织匀浆(脏、脏、脏、肺和脏)样本中，检测到强烈的19F MRI信号。
通过测量NIH 3T3细胞的活性与纳米凝胶浓度之间的关系，评价纳米凝胶的细胞毒性。如图4E所示，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶即使在高浓度(50mg/mL)下，也具有极低的细胞毒性。
另外，研究了交联剂PCBMAF3X摩尔比对纳米凝胶细胞毒性的影响。如图4F所示，交联剂PCBMAF3X的摩尔比未对纳米凝胶的细胞毒性产生明显影响，对于含有5％-30％摩尔比PCBMAF3X交联剂的纳米凝胶，没有观察到明显的细胞毒性。
总之，利用微乳液自由基聚合法成功制备了PCBMAF3/PCBMAF3X纳米凝胶。其中，PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶在100％胎牛血清中表现出良好的稳定性，并且具有极低的细胞毒性。PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶在血液和组织匀浆(心、肝、脾、肺和肾)中显示出优异而稳定的磁共振性质，获得强烈的19F MRI信号。另外，本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶的19F MRS信号强度与其在血液中的浓度呈线性关系。由此推断，本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶，能够用作一种在生物体系中具有高灵敏度的19FMRI纳米造影剂。
两性离子氟化纳米凝胶标记细胞和通过19F MRI示踪
在某些方面，本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶可以用作19F MRI纳米造影剂，用于在体外标记细胞和在体内利用19F MRI跟踪所标记的细胞。被本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶标记的细胞可以通过19F MRI技术检测，由于缺乏内源性背景信号，19F MRI技术是生物系统的良好成像工具。19F在生物体中的含量极低，而且通常不以液态核磁共振技术可检测到的化学形式存在。这与传统的1H MRI截然不同，后者虽然提供了精细解剖结构的可视化，但不允许对特定细胞群进行选择性检测。19F MRI技术允许全身或局部筛查，以可视化被标记细胞在活体中的分布。19F MRI检测到被标记细胞的精确解剖位置，可以通过提供解剖细节的1H MRI图像的叠加确定。
在某些方面，本发明的两性离子氟化纳米凝胶提供了19F MRI纳米造影剂，用于体外标记细胞和检测体内被标记的细胞。被标记的细胞基本上可以是任何细胞，包括原核细胞和真核细胞。在优选实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，该细胞是免疫系统的细胞，例如树突状细胞或T细胞。细胞也可以是干细胞，也可以是作为细胞治疗或移植(如外周血干细胞移植或骨髓移植)的一部分而准备给受试者施用的细胞。其他细胞类型可以被标记和成像，例如胚胎干细胞、胰岛、肝细胞等，可能与治疗结合使用。
在某些方面，本发明的两性离子氟化纳米凝胶提供了19F MRI纳米造影剂，该造影剂可与细胞外表面结合或由细胞摄取。通过将造影剂与细胞靶向部分结合，可增加与细胞外表面的结合。细胞靶向部分基本上可以是与所需细胞结合的任何分子实体，例如与暴露于细胞外环境的表位结合的抗体。通过将两性离子氟化纳米凝胶与内化部分结合，可以增加细胞对两性离子氟化纳米凝胶的摄取。内化部分是刺激或促进两性离子氟化纳米凝胶进入细胞的任何分子实体。例如，与受体或其他细胞表面蛋白结合的内化肽部分，例如通过受体介导的内吞作用摄取。
在某些方面，被标记的细胞用于非治疗目的。例如，可以在体外标记细胞，给受试者注射，然后检测，期望标记细胞的行为与体内类似的未标记细胞相似，因此可以用于监测内源性细胞群的行为。监测可用于跟踪细胞的运动，特别是已知高度流动的细胞，如免疫系统细胞、许多类型的干细胞和血源性细胞。监测也可用于跟踪植入部位非移动细胞的存活率或粘附性。许多组织(如肌肉、肝脏、胰腺、肾脏、大脑或皮肤)的细胞往往是相对静止的，但标签的消失可能意味着高死亡率、低粘附性或其他信息。
在某些方面，标记细胞可用于治疗目的。本发明的两性离子氟化纳米凝胶作为19FMRI纳米造影剂可用于监测细胞疗法在活体的或在任何其他需要的环境中的行为，如组织外植体。例如，通过19F MRI技术进行体内监测可能有助于评估给药细胞的生存能力。医生可以根据给药后在患者体内检测到标记细胞的程度来调整给药计划。体内监测也可能有助于确定治疗细胞是否已定位到所需位置。一般来说，研究治疗细胞在体内的迁移行为、治疗细胞在体内的数量和/或存活率与治疗结果之间的关系是可能的。当这种相关性已经建立时，治疗细胞的体内成像可以作为一种预后指标，可能有助于选择适当的剂量、给药模式和有利于患者的额外治疗干预措施。本发明的两性离子氟化纳米凝胶作为19F MRI纳米造影剂的进展，将有益于广泛的细胞治疗策略，因为这些成像方法将能够检测治疗细胞何时、何地以及是否已在体内被运送到所需靶点。
在一个实施例中，本发明的两性离子氟化纳米凝胶应用于追踪树突状细胞。树突状细胞是已知的最有效的抗原提呈细胞，并有能力刺激原始T细胞启动免疫反应。由于树突状细胞是人体内最有效的免疫刺激因子，因此树突状细胞代表了一种可能的治疗方法，可以增加肿瘤对患者免疫系统的可见性。树突状细胞是肿瘤疫苗研究的热点。采用不同的方法将树突状细胞体外暴露于肿瘤抗原中，然后将受教育的树突状细胞再融合以刺激T细胞介导的肿瘤杀伤的发展。
在实施例4中描述了使用本发明的具有代表性的两性离子氟化纳米凝胶PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)标记树突状细胞。合成路线和表征如图5所示。
图5A示出了本发明提供的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶与抗CD11c抗体(anti-CD11c)结合的合成路线(anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10))。
图5B显示了用anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)标记的树突状细胞的19FMRI信号，被标记的树突状细胞分散在0.5ml离心管中，离心管随着细胞数的减少而排列，信号强度与被标记的细胞数呈线性关系。
图5C显示了注射在BALB/c小鼠皮下的anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)标记的树突状细胞的19F MRI信号。MRI图像：左，高分辨率1H MRI图像与19F MRI图像叠加，其中19F MRI图像中的色条代表信号强度。
作为一个例子，标记的免疫细胞可以作为检测病人免疫细胞运动的代表。免疫细胞参与炎症和自身免疫性疾病，以及癌症和动脉粥样硬化斑块的形成，并且是这些疾病的标志物。作为一种通用的方法，任何涉及免疫细胞招募的过程都可以通过给患者注射标记的免疫细胞来检测。19F MRI造影剂在特定区域的累积提供了一个指示，表明免疫反应的程度发生在身体的那一部分。在不使用放射性同位素的情况下，能够无创地追踪选定免疫细胞群的能力，可以影响基础和临床免疫学的许多领域，如多发性硬化、糖尿病、器官移植排斥反应监测和癌症。例如，肿瘤常被免疫细胞高度浸润。标记的细胞可以在受试者身上成像以显示肿瘤的位置，在某些情况下可以用作非侵入性检测屏幕。癌症的早期发现一直是一个关键问题，因为大多数早期癌症在不使用衰弱的化疗药物的情况下很容易通过手术治疗。同样，其他炎症性疾病的进展也可以通过追踪患者体内免疫细胞的动态来监测。免疫抑制治疗的效果也可以进行评估。
两性离子氟化纳米凝胶用于治疗剂负载、递送和通过19F MRI示踪
在一个方面，本发明的两性离子氟化纳米凝胶可以有效地负载、递送和通过19FMRI示踪治疗剂。
在某些实施例中，本发明的两性离子氟化纳米凝胶负载、递送和通过19F MRI示踪一种或多种治疗剂。
可被本发明提供的两性离子氟化纳米凝胶负载、递送和通过19F MRI示踪的代表性治疗剂，包括小分子、核酸、蛋白质(包括多聚蛋白质、蛋白质复合物、肽)、脂质、碳水化合物、金属、放射性元素及/或其组合。
在一些实施例中，治疗剂是具有药物活性的小分子和/或有机化合物。在一些实施例中，治疗剂是临床使用的药物。在一些实施例中，该药物是抗癌剂、抗生素、抗病毒剂、抗HIV剂、抗寄生虫剂、抗原生动物剂、麻醉剂、抗凝剂、酶抑制剂、类固醇剂、类固醇或非类固醇抗炎剂、抗组胺剂、免疫抑制剂、抗肿瘤剂、抗原、疫苗，抗体、减充血剂、镇静剂、阿片类、镇痛剂、解热剂、节育剂、激素、前列腺素、促孕剂、抗青光眼剂、眼科剂、抗胆碱能剂、镇痛剂、抗抑郁剂、抗精神病药、神经毒素、催眠剂、镇静剂、抗痉挛剂、肌肉松弛剂、抗帕金森剂、抗痉挛剂，肌肉收缩剂、通道阻滞剂、消瞳剂、抗分泌剂、抗血栓剂、抗凝剂、抗胆碱能剂、B肾上腺素能阻滞剂、利尿剂、心血管活性剂、血管活性剂、血管舒张剂、抗高血压剂、血管生成剂、细胞外基质相互作用的调节剂(如细胞生长抑制剂和抗粘附分子)，DNA、RNA或蛋白质合成的抑制剂。
在本发明的某些实施例中，治疗剂是核酸(例如，DNA、RNA及其衍生物)。在一些实施例中，核酸试剂是功能性RNA。一般来说，“功能性RNA”是指不编码蛋白质的RNA，而是属于一类RNA分子，其成员在细胞内具有一种或多种不同的功能或活动。应当理解，具有不同序列的功能性RNA分子的相对活性可能不同，并且至少部分地取决于RNA存在的特定细胞类型。因此，这里使用术语“功能性RNA”来指代一类RNA分子，并不意指该类的所有成员实际上将在任何特定条件集合下显示该类的活性特征。在一些实施例中，功能性RNAs包括RNAi诱导实体(例如，短干扰RNAs(siRNAs)、短发夹RNAs(shRNAs)和microRNAs)、核酶、tRNAs、rRNAs、对三螺旋形成有用的RNAs。
在一些实施例中，治疗剂可以是蛋白质或肽。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可以共同使用。多肽可以包含L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可以包含本领域已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任何一种。
在一些实施例中，治疗剂可以是激素、促红细胞生成素、胰岛素、细胞因子、用于接种的抗原、生长因子。在一些实施例中，治疗剂可以是抗体和/或其特征部分。在一些实施例中，抗体可包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合(即“人源化”)或单链(重组)抗体。在一些实施例中，抗体可具有降低的效应器功能和/或双特异性分子。在一些实施例中，抗体可包括Fab片段和/或由Fab表达库产生的片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scfv、Fv、dsFv-diabody和Fd片段)。
在一些实施例中，治疗剂是碳水化合物。在某些实施例中，碳水化合物是与蛋白质(例如糖蛋白、蛋白聚糖)相关联的碳水化合物。碳水化合物可以是天然的，也可以是合成的。碳水化合物也可以是衍生的天然碳水化合物。在某些实施例中，碳水化合物可以是简单或复杂的糖。在某些实施例中，碳水化合物是单糖，包括但不限于葡萄糖、果糖、半乳糖和核糖。在某些实施例中，碳水化合物是二糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖和纤维二糖。在某些实施例中，碳水化合物是多糖，包括但不限于纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素(MC)、葡萄糖、右旋糖酐、糖原、黄原胶、结冷胶、淀粉和普鲁兰多糖。在某些实施例中，碳水化合物是糖醇，包括但不限于甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苹果醇和乳糖醇。
在一些实施例中，治疗剂是脂质。在某些实施例中，脂质是与蛋白质(例如脂蛋白)相关联的脂质。根据本发明可使用的示例性脂质包括但不限于油、脂肪酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、必需脂肪酸、顺式脂肪酸、反式脂肪酸、甘油酯、单甘油脂、二甘油脂、甘油三酯、激素、类固醇(例如胆固醇、胆汁酸)，维生素(如维生素e)、磷脂、鞘脂和脂蛋白。
本发明具有代表性的两性离子氟化纳米凝胶PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)用于卵清蛋白(OVA)的负载、递送和通过19F MRI示踪(OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10))，制备与表征如实施例5所述，结果如图6所示。
图6A显示了OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的粒径和形貌。与原始的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶相比，OVA的负载对其粒径和形貌没有造成明显的影响。
图6B显示了OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶，注射于雌性BALB/c小鼠皮下，获得清晰的19F MRI图像。
两性离子氟化纳米凝胶用于诊断剂负载、递送和通过19F MRI示踪
在某些实施例中，本发明的两性离子氟化纳米凝胶可用于负载、递送和通过19FMRI示踪一种或多种诊断剂。
可被本发明的两性离子氟化纳米凝胶负载、递送和通过19F MRI示踪的诊断剂，包括用于正电子发射断层摄影术(PET)、计算机断层摄影术(CT)、单光子发射计算机断层摄影术、X射线、荧光透视和MRI的造影剂。MRI中用作造影剂的合适材料，包括钆及铁、镁、锰、铜和铬的螯合物,磁性纳米粒子(MNPs)。用于CT和X射线成像的材料，包括碘基材料。
在一些实施例中，诊断和/或治疗剂可以是放射性核素。在使用的放射性核素中，γ发射器、正电子发射器和X射线发射器适用于诊断和/或治疗目的，而β发射器和α发射器也可用于治疗。本发明中适用的放射性核素包括但不限于125I、131I、90Y、88Y、111In、64Cu、99mTc和18F。
在一些实施例中，诊断剂可以是荧光或化学发光分子。荧光和发光部分包括各种不同的有机或无机小分子，通常称为“染料”、“标记物”或“指示剂”。示例包括荧光素、罗丹明、吖啶染料、Alexa染料、菁染料。荧光和发光部分可包括各种天然存在的蛋白质及其衍生物，例如基因工程变体。例如，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强GFP、红色、蓝色、黄色、青色和蓝宝石荧光蛋白、珊瑚礁荧光蛋白。发光蛋白，包括荧光素酶、aeqourin及其衍生物。
MNPs具有许多吸引人的特性，通常是低毒性和优异的磁性相结合的产物。近年来，集治疗和诊断于一体的“治疗学”引起了人们的极大关注，并可能对当前的医学治疗产生革命性的影响。为了达到这一目的，MNPs可以作为多功能载体，选择性地在靶点聚集，通过一定的机制(热疗或药物释放)治疗疾病，并使用非侵入性1H MRI进行检测。因此，用本发明的两性离子氟化纳米凝胶可以用于负载和递送氧化铁磁性纳米颗粒，可以在获得多功能MNPs的同时，在19F/1H MRI造影剂方面发挥关键作用。
在实施例6中描述了本发明的具有代表性的两性离子氟化纳米凝胶PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)负载和递送超小型超顺磁性氧化铁(USPIO)纳米颗粒的制备和表征(USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10))。合成路线和表征如图7所示。
图7A显示了USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)的19F MRS，表明PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶成功负载USPIO。本发明的具有代表性的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在每个组成单元中都含有羧基，与USPIO纳米粒子表面的Fe3+有很强的静电相互作用。USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)的19F MRS半峰宽接近158Hz，明显宽于原始的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶(～58Hz)，这可能是由于Fe3+对19F的顺磁弛豫增强效应，加速了19F的弛豫。
图7B显示了通过TEM观察到的USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)和USPIO的形态。PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶对USPIO的负载，对USPIO纳米粒子的形貌未产生明显影响。
图7C显示了USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)的T1和T2弛豫时间，分别为329ms和43ms，这与上述半峰宽的变宽是一致的。证实了Fe3+对19F的顺磁弛豫增强效应。如上所述，在自旋回波序列的固定扫描时间(Ts＝TR×相位矩阵×平均数)内，T1值直接影响19F MRI信号采集的效率。因此，当获得相同的19FMRI信号强度时，由于负载USPIO而导致的T1缩短将导致固定扫描时间缩短。
如图7D所示，在具有相同浓度19F的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶和USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液中，在扫描时间相同的情况下，USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRI信号强度高于PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶。
与大多数标准超顺磁性氧化铁(SSPIO)纳米颗粒主要提高1H横向弛豫速率(1/T2)的阴性对比剂不同，一些核尺寸较小的USPIO纳米颗粒可以同时提高1H纵向弛豫速率(1/T1)和横向弛豫速率。此外，随着粒径的减小，USPIO对1H的T1弛豫速率的增强作用增强，核尺寸(5nm)被认为是有利于T1增强和T2抑制的最佳阳性T1造影剂。
图7E和F显示了USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液中1H的T1和T2弛豫时间，及其随铁离子浓度的变化拟合曲线。1H的T1和T2弛豫时间与USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶溶液中铁离子的浓度成反比，表明USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶加速了净磁化强度的恢复。
从图7G可以看出，随着USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液中铁浓度的增加，T1加权磁共振信号正增强，T2加权磁共振信号负增强。这些结果表明，与传统的负T2造影剂氧化铁纳米粒子相比，USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶可同时作为正、负1H MRI造影剂。
图7H显示了商业化USPIO-PEG2000和USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在100％血清中的稳定性。结果表明，PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶对USPIO的负载可以显著提高其血清稳定性。
这些结果表明，本发明提供的USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶有望作为19F MRI和1H MRI双模态的对比剂，具有广阔的应用前景。
两性离子氟化纳米凝胶用于靶向剂键合和通过19F MRI示踪
在一个方面，本发明的两性离子氟化纳米凝胶可用于疾病治疗和诊断目的，其可通过共价键合的方式在纳米凝胶表面上键合靶向剂，以增强其靶向效率。在一个实施例中，通过传统的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学，羧甜菜碱两性氟化纳米凝胶中丰富的羧基可以有效且容易地与靶向剂结合。此外，活化但未反应的NHS基团将作为两性离子基团的一部分水解回羧基，确保两性离子氟化纳米凝胶在后功能化后保持优异的抗蛋白吸附能力。
在一个实施例中，目标靶向剂对目标分子具有亲和力。在一个实施例中，键合靶向剂的纳米凝胶可以用于诊断分析。
可以键合到本发明中所述的两性离子纳米凝胶表面的靶向剂，可以是任何合适的分子，包括但不限于蛋白质、肽、多糖或寡糖、糖蛋白、脂质和脂蛋白、核酸，以及具有特定生物活性的合成有机或无机分子，例如抗生素、抗炎剂或细胞粘附介质。
可以键合到本发明中所述的两性离子纳米凝胶表面的蛋白质，可以包括配体结合蛋白质、凝集素、激素、受体和酶。代表性蛋白质包括抗体(单克隆、多克隆、嵌合、单链或其他重组形式)、其蛋白质/肽抗原、蛋白质肽激素、链霉亲和素、亲和素、蛋白质A、蛋白质G、生长因子及其各自的受体、DNA结合蛋白、细胞膜受体、内质膜受体，核膜受体、神经元受体、视觉受体和肌肉细胞受体。
可以键合到本发明中所述的两性离子纳米凝胶表面的代表性寡核苷酸，包括DNA(基因组或cDNA)、RNA、反义、核酶和RNA酶P的外部引导序列，其大小可从短寡核苷酸引物到整个基因。
可以键合到本发明中所述的两性离子纳米凝胶表面的分子，可以是与靶化合物特异结合的其他靶向分子，包括结合受体的糖蛋白上的多糖或寡糖，例如炎症介质P-选择素和E-选择素配体上的碳水化合物，以及结合互补序列的核酸序列，例如核酶、反义，核糖核酸酶P和适体的外部引导序列。
在一个实施例中，键合到本发明中所述的两性离子纳米凝胶表面的是抗体，而目标分子是针对抗体的抗原。在本实施例中，本发明的两性离子氟化纳米凝胶与抗原特异性结合并抵抗非特异性蛋白质吸附。在一个实施例中，键合到两性离子氟化纳米凝胶的靶向剂是促进细胞粘附的蛋白质，而目标分子是细胞。
在实施例7中描述了本发明的具有代表性的两性氟化纳米凝胶PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶与cyclo-[Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys](cRGD)多肽键合的制备和表征(cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶)。合成路线和表征如图8所示。
用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)测定细胞内19F的浓度，检测cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶的靶向性。如图8A所示，在相同浓度的19F条件下，与cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶相比，未键合cRGD靶向基团PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的细胞摄取量很低，表现为共同孵育后HUVEC的19F MRS信号强度的显著差异。结果表明，cRGD与PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶成功偶联，并与靶向配体作用后，cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶具有显著的靶向活性。
cRGD肽是αvβ3整合素的重要靶向配体之一。恶性肿瘤的持续生长、侵袭和转移与血管新生密切相关。其中，αvβ3整合素在肿瘤新生血管形成中起重要作用，在内皮细胞迁移和血管腔结构形成过程中高表达。因此，在体内对αvβ3表达的识别，对肿瘤新生血管的靶向显像具有重要作用，有助于恶性肿瘤的早期诊断。
如图8B所示，静脉注射cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶12h后，主要在肿瘤血管周围区域(以椭圆形框架突出显示)检测到强烈的19F MRI信号，在1HMRI图像中可以清晰地观察到肿瘤与邻近组织交界处血管。
相比之下，小鼠注射PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)纳米凝胶后，肿瘤部位的19F MRI信号明显减少，强度降低。这种差异证明了αvβ3整合素受体介导的阳性靶向性对肿瘤靶向精准诊断的作用。
下面将使用以下示例来说明本发明，这些示例仅用于说明性目的，并非限制权利要求的范围。
材料。化学试剂从Sigma Aldrich公司购买，除非另有说明。所有溶剂利用CaH2除水后，真空蒸馏，然后储存在含有分子筛
Figure BDA0002511061260000301
的溶剂瓶中。Anti-CD11c抗体购自Abcam。USPIO巯基乙酸(USPIO-COOH)和USPIO-PEG2000由中科莱明科技有限公司定制。具有代表性的两性氟化单体N-(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基)-N-甲基-N-(3，3，3-三氟丙基)-甘氨酸(CBMAF3)的合成在已公开专利CN109928889A中描述，通过引用将其全部明确纳入本协议。所有动物均购自中国医学科学院肿瘤研究所，严格按照中国医学科学院动物实验伦理委员会批准的方案进行。
实施例1：两性离子氟化交联剂的制备与表征。
在该实例中，描述了本发明的具有代表性的两性离子氟化交联剂CBMAF3X的制备，合成路线如图2所示。
2,2’-((3,3,3-三氟丙基)氮杂基)双(乙烷-1-醇)(1).在氩气保护下，向溶解于乙腈中的二乙醇胺(5mmol)溶液中加入3-溴-1,1,1-三氟丙烷(7.5mmol)。然后，在50℃下反应24小时后，冷却至室温，用90％DCM/10％甲醇为洗脱液，利用柱色谱分离法纯化混合物，得到目标产物为淡黄色油状(产率83％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.16(s,2H),3.42(t,J＝5.8Hz,3H),2.57(t,J＝5.8Hz,4H),2.46(t,J＝5.8Hz,2H),1.91(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ126.56(q,J＝274.7Hz),60.1,59.3,50.31(q,J＝3.4Hz),40.21(q,J＝27.3Hz),39.05.19F NMR(376MHz,Chloroform-d)δ-65.33(t,J＝10.8Hz).19F CPD NMR(376MHz,Chloroform-d)δ-66.11.
((3,3,3-三氟丙基)氮杂基)双(乙烷-2,1-二基)双(2-丙烯酸甲酯)(2)。将2,2’-((3,3,3-三氟丙基)氮杂基)双(乙烷-1-醇)(27.2mmol)和三乙胺(TEA)(54.4mmol)溶解在50mL无水四氢呋喃(THF)中，溶液温度降至0℃后，在氩气保护下，滴加甲基丙烯酰氯(60mmol)无水THF溶液。滴加完成后，将反应溶液升温至室温并搅拌24h。随后，过滤反应混合物以获得滤液，有机溶剂在真空中蒸发。以正己烷/DCM＝20％/80％为洗脱液，利用柱色谱分离法纯化混合物，得到目标产物为淡黄色油状(产率88％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.02(s,1H),5.57(s,1H),4.42(t,J＝5.2Hz,4H),2.97(t,J＝5.2Hz,4H),2.46(t,J＝5.2Hz,2H),2.01(s,3H),1.91(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ167.25,135.51,132.69,126.56(q,J＝274.7Hz),60.1,59.3,50.31(q,J＝3.4Hz),40.21(q,J＝27.3Hz),39.05,18.09.19F NMR(376MHz,Chloroform-d)δ-65.47(t,J＝10.4Hz).19F CPD NMR(376MHz,Chloroform-d)δ-66.38.
N-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-3,3,3-三氟-N,N-双(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基)丙烷-1-胺(3)。在氩气保护下，将((3,3,3-三氟丙基)氮杂基)双(乙烷-2,1-二基)双(2-丙烯酸甲酯)(5mmol)和溴乙酸叔丁酯(7.5mmol)溶解于30mL无水乙腈中。然后，在50℃下反应24小时后，冷却至室温，用90％DCM/10％甲醇为洗脱液，利用柱色谱分离法纯化混合物，得到目标产物为淡黄色油状(产率91％)。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ6.02(s,1H),5.57(s,1H),4.42(t,J＝5.2Hz,4H),2.97(t,J＝5.2Hz,4H),2.46(t,J＝5.2Hz,2H),2.01(s,3H),1.91(m,2H),1.42(s,9H).13CNMR(100MHz,Methanol-d4)δ167.25,135.51,132.69,126.56(q,J＝274.7Hz),81.82,60.1,59.3,50.31(q,J＝3.4Hz),40.21(q,J＝27.3Hz),39.05,28.75,18.09.19F NMR(376MHz,Methanol-d4)δ-66.06(t,J＝10.1Hz).19F CPD NMR(376MHz,Methanol-d4)δ-65.59.
2-(双(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基)(3,3,3-三氟丙基)铵)乙酸酯(CBMAF3X)(4).N-(2-(叔丁氧基)-2-氧乙基)-3,3,3-三氟-N,N-双(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基)丙烷-1-胺溶解于DCM和三氟乙酸(TFA)的混合溶液中(VDCM:VTFA＝1:1)，加入三乙基硅烷(12.5mmol)为阳离子捕获剂。室温下反应2h后，旋蒸除去DCM和TFA，粗产物用乙醚洗三次，获得白色固体产物(产率87％)。1H NMR(400MHz,DeuteriumOxide)δ6.02(s,1H),5.57(s,1H),4.42(t,J＝5.2Hz,4H),2.97(t,J＝5.2Hz,4H),2.46(t,J＝5.2Hz,2H),2.01(s,3H),1.91(m,2H),1.42(s,9H).13C NMR(100MHz,Deuterium Oxide)δ167.25,135.51,132.69,126.56(q,J＝274.7Hz),60.1,59.3,50.31(q,J＝3.4Hz),40.21(q,J＝27.3Hz),39.05,18.09.19F NMR(376MHz,Deuterium Oxide)δ-66.06(t,J＝10.1Hz).19F CPD NMR(376MHz,DeuteriumOxide)δ-65.59.
实施例2：具有代表性的PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的制备和表征。
PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的制备方法。在PCBMAF3单体溶液中，加入十二烷基硫酸钠(SDS)为表面活性剂，摩尔比为单体总摩尔数一定比例的交联剂PCBMAF3X；向反应体系中持续通氩气，油浴加热控制反应温度(40℃)，氩气保护下加入0.05wt％的过硫酸铵(APS)引发聚合反应。通过调节剪切速率、反应温度、单体浓度、交联剂与单体的摩尔比等，调控纳米水凝胶粒径、形态和交联度。反应结束后，将纳米凝胶在超纯水中透析，除去残留的单体、交联剂和表面活性剂等，冻干后得到超亲水纳米凝胶。利用动态光散射(DLS)测定纳米凝胶的粒径、分布和电位；利用透射电子显微镜(TEM)观察纳米凝胶的形态。
PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的接触角测试。采用溶剂蒸发法制备薄膜，在室温(22-25℃)和相对湿度(20-40％)条件下，使用DSA 10mk2(Kruss)系统进行接触角测量，为避免交叉污染，每个测试液体都使用一次性注射器，将注射器内2μL的液滴放置在样品表面，用电荷耦合器件(CCD)相机在液滴静置120秒后拍摄静接触角图像，接触角由供应商提供的软件计算，实验重复5次。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的血清稳定性测试。将PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶与100％胎牛血清共同孵育，测定PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶粒径随时间的变化。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRS。利用Bruker Avance400MHz(TopSpinTM3.5)测定PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRS，其中用重水作为核磁溶剂。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶19F MRS信号强度与浓度之间的关系。在PBS(10％D2O用于锁场)中配制浓度梯度(1.0-100mg/mL)的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶样品，利用19F MRS检测浓度梯度样品的信噪比。其中，扫描次数设为64。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的弛豫时间。首先，在磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH＝7.4,10mM；10％D2O用于锁场)，配制浓度梯度(1.0-100mg/mL)的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶样品。利用标准的反转回复序列(inversionrecovery,IR)和Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列，在Bruker Avance 400(TopSpinTM3.5)核磁共振设备上分别对样品的纵向弛豫时间(T1)和横向弛豫时间(T2)进行测试。根据指数变化编辑相应的vdlist和vclist。T1值可根据拟合报告直接得出。T2值根据公式计算得到：T2＝拟合循环次数×(2D20+P2)。
实施例3：PCBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶在血浆和组织匀浆中的磁共振性质。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在血浆和组织匀浆中的弛豫时间。在血浆和组织匀浆中配制PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液(10％D2O用于锁场)，20mg/mL。在室温下共同孵育1周后，按照实施例2中阐述的方法，测定样品的弛豫时间。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在血浆和组织匀浆中的19FMRS。在血浆和组织匀浆中配制PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液(10％D2O用于锁场)，20mg/mL。在室温下共同孵育1周后，测定样品的19F MRS，利用19F MRS检测浓度梯度样品的信噪比，其中扫描次数设为64。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在血浆中19F MRS的信噪比与浓度之间的关系。在血浆中配制浓度梯度(1.0-100mg/mL)的PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶样品，在室温下共同孵育24h后，利用Bruker Avance 400(TopSpinTM3.5)测定其19F MRS，利用19F MRS检测浓度梯度样品的信噪比，其中扫描次数设为64。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶在血浆和组织匀浆中的19F MRI信号。在血浆和组织匀浆中配制PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液(10％D2O用于锁场)，浓度为20mg/mL。采用小动物核磁共振谱像系统(Bruker Biospec 70/20USR)，19F/1H双频鸟笼线圈，RARE序列对PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶样品进行成像。为了避免温度对体内外成像造成影响，在成像过程中利用循环水浴加热恒温至37℃。参数设置：TR/TE＝3000/4.6ms,FA＝90,FOV＝50*50mm,MTX＝90*90,重复次数＝20.
CBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的细胞毒性。利用NIH 3T3细胞，对CBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶的细胞毒性进行评价。采用含有10％的热灭活的胎牛血清(FBS)以及青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM/高糖培养基(Hyclone)37℃培养细胞，然后将细胞密度为5×104细胞/孔的细胞溶液在96孔培养24h，按浓度梯度加入50μL的不同浓度及交联密度的CBMAF3/PCBMAF3X两性离子氟化纳米凝胶溶液，孵育48h后按标准方案进行CCK-8测定，实验每组五个样品以确定平均值和标准差(SDs)。
实施例4：PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶标记树突状细胞。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶与抗CD11c抗体(anti-CD11c)结合。将PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶解于缓冲溶液中：0.1M 2-[吗啉]乙磺酸(MES),0.5M NaCl,pH 6.0,EDC(1.0eq)和NHS(2.0eq)。在室温下反应15min后，混合溶液pH调节至7.4。随后，加入anti-CD11c抗体，在室温下继续反应30min。将样品置于截留分子量为30KDa的透析袋中透析48h，冻干得到anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶。
anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶标记树突状细胞。在标准细胞培养条件下，将上述anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶与树突状细胞2.4细胞系共同孵育30min。然后，用冷的1×PBS清洗细胞两次，利用细胞计数仪统计细胞密度。将anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶标记的树突状细胞，以梯度细胞数分散于0.5ml离心管中，按照实施例3中所述方法，获得19FMRI图像。
anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶标记树突状细胞，皮下注射后活体成像。将anti-CD11c-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶标记的树突状细胞(2×106,100μL)在雌性BALB/c小鼠皮下注射。在所有的活体成像过程中，动物的体温和呼吸频率都是通过探头和放置在胸腔下方的压力敏感垫进行监测。采用SA仪器(Stony Brook，NY，USA)的监测和门控模型(1030型)，将动物的体温和呼吸频率分别调节和维持在大约37℃和80-120次呼吸/min的合理生理范围内。采用小动物核磁共振谱像系统(BrukerBiospec 70/20USR)，19F/1H双频鸟笼线圈，RARE序列对PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶样品进行19F MRI成像，参数设置：TR/TE＝3000/4.6ms,FA＝90,FOV＝50*50mm,MTX＝100*100,重复次数＝40，层厚＝4mm。1H MRI图像采用2D T2RARE序列采集，参数设置：TR＝300ms,TE＝50ms,FA＝90,FOV＝50*50mm,MTX＝256*256。
实施例5：PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶用于卵清蛋白(OVA)的负载与递送(OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10))。
负载与递送OVA的OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的制备。负载与递送OVA的OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的制备方法与PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的相同，只不过在本体溶液中加入10mg的OVA。利用DLS和TEM对OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的粒径和形貌进行评价。
OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶活体成像研究。将OVA@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶(19F,10mmol/kg)在雌性BALB/c小鼠皮下注射，利用实施例4中所述方法进行成像。
实施例6：PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶负载和递送超小型超顺磁性氧化铁(USPIO)纳米颗粒的制备和表征
(USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10))。
USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的制备。负载与递送USPIO的USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的制备方法与PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的相同，只不过在本体溶液中加入10mg的USPIO。利用DLS和TEM对USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的粒径和形貌进行评价。
USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRS。利用BrukerAvance 400MHz(TopSpinTM3.5)测定USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRS，其中用重水作为核磁溶剂。
USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的弛豫时间。利用实施例2中所述的方法，测试USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的弛豫时间。
PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)和USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRI图像。利用实施例3中所述的方法，采集PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)和USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的19F MRI图像。
USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液中1H的弛豫时间。按照实施例2中所述的方法，测定不同浓度USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液中1H的弛豫时间。
USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的1H MRI图像。为了探讨USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的1HMRI特征，在离心管中(300μL)配制浓度梯度的溶液，铁离子浓度分别为1.5,1,0.5 0.25和0.1mM，采集参数设置：翻转角＝90,回波链＝1,TR＝500ms,TE＝11ms,FOV＝200*200mm,MTX＝90*90,slice thickness/gap＝1.0mm/2.5mm，重复次数＝1。
USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的血清稳定性。将USPIO-PEG2000和USPIO@PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶分散于胎牛血清中，在设定的时间点，利用DLS测定其粒径变化。
实施例7：PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶与
cyclo-[Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys](cRGD)多肽键合的制备和表征
(cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10))。
cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的制备。cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的制备方法与实施例4中anti-CD11c键合的方法相同。
cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶的靶向效率。将HUVEC细胞接种在6孔培养板中，采用补充低血清生长补充剂培养基200进行培养。首先，用PBS清洗细胞三次。其次，将分别含有cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)和PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶(5mg/mL)的培养基加入培养板中，在标准培养条件下共同孵育4h后，用PBS清洗细胞三次，50mM NaOH水溶液裂解。之后，将细胞分散于400μL PBS(含有50μLD2O)中，利用19F MRS评价细胞内的19F含量。
cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶对肿瘤新生血管αvβ3受体的靶向。cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶为靶向19F MRI分子造影剂，通过对新生血管αvβ3受体的靶向性，检测肿瘤。在6-7周龄的雌性BALB/c裸鼠皮下移植HepG2肿瘤，待肿瘤体积长到约为150mm3时，进行靶向19F MRI研究。每只小鼠的19F注射剂量保持在10mmol/kg。尾静脉注射cRGD-PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液12h后，腹腔注射4μL/g小鼠体重的水合氯醛PBS溶液，麻醉小鼠。同时，以注射PCBMAF3/PCBMAF3X(90/10)两性离子氟化纳米凝胶溶液的小鼠为阳性对照。成像方法同实施例4。

Claims (20)

1.一种两性离子氟化交联剂，其特征在于具有化学结构通式(1)：
Figure RE-FDA0002632706770000011
其中，
R1和R2分别独立选自氢、C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R3选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L1和L2分别独立选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L3和L4分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A1选自C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子。
2.一种两性离子氟化纳米凝胶及其氟-19磁共振成像纳米造影剂的应用，其特征在于两性离子氟化纳米凝胶由两性离子氟化单体与权利要求1所述的两性离子氟化交联剂共聚制备，其中交联单元具有化学结构通式(2)：
Figure RE-FDA0002632706770000012
R1和R2分别独立选自C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R3选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L1和L2分别独立选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L3和L4分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A1选自C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子；
x是5-5000的整数。
其中重复单元具有如下化学结构通式：
Figure RE-FDA0002632706770000021
R4选自氢、C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R5选自C1-C12烷基和C6-C12芳香基；
R6选自单氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、六氟异丙基、全氟叔丁基；
L5选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-和-C(＝O)NH-(CH2)n-的基团，其中n是1-20的整数；
L6和L7分别独立选自-(CH2)n-，其中n是1-20的整数；
A2选自C,S,SO,P或PO；
X-为与N+阳离子中心静电相互作用的反离子；
M+为与(A＝O)O阴离子中心静电相互作用的金属离子或有机反离子；
n是5-10,000的整数。
*表示重复单元或交联单元共价链接到相邻重复单元或交联单元的点。
3.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于R1和R2分别独立优选自C1-C3烷基。
4.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于R3优选自单氟甲基、二氟甲基和三氟甲基。
5.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于L1和L2分别独立优选自含有-C(＝O)O-(CH2)n-的基团，其中n是1-6的整数。
6.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于L3和L4分别独立优选自-(CH2)n-，其中n是1-6的整数。
7.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于M+选自金属离子或有机离子。
8.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于X-选自含有卤化物、羧酸盐、烷基磺酸盐、硫酸盐；硝酸盐、高氯酸盐、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、三氟甲基磺酸盐、双(三氟甲基磺酰)酰胺、乳酸和水杨酸盐等的基团。
9.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于A1优选自C或SO。
10.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于R1和R2优选为甲基，R3优选为三氟甲基，L1和L2优选为-C(＝O)O-(CH2)2-，L3优选为-(CH2)-，L4优选为-(CH2)2-，A1优选为C，n优选为10-500的整数。
11.如权利要求2所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于R4和R5优选为甲基，R6优选为三氟甲基，L5优选为-C(＝O)O-(CH2)2-，L6优选为-(CH2)-，L7优选为-(CH2)2-，A2优选为C，x优选为10-200的整数。
12.如权利要求2-11所述的两性离子氟化纳米凝胶，其特征在于作为氟-19磁共振成像纳米造影剂的应用。
13.如权利要求12所述的两性离子氟化纳米凝胶作为氟-19磁共振成像纳米造影剂的应用，其特征在于用于细胞的标记和通过氟-19磁共振成像示踪。
14.如权利要求13所述的细胞，其特征在于选自多种组织细胞，例如肌肉、肝脏、胰腺、肾脏、脑或皮肤、免疫细胞、多种类型的干细胞及血源细胞。
15.如权利要求12所述的两性离子氟化纳米凝胶作为氟-19磁共振成像纳米造影剂的应用，其特征在于用于治疗剂的负载、递送和通过氟-19磁共振成像示踪。
16.如权利要求15中所述的治疗剂，其特征在于选自小分子、核酸、蛋白质(包括多聚蛋白质、蛋白质复合物、肽)、脂质、碳水化合物、金属、放射性元素和/或其组合。
17.如权利要求12所述的两性离子氟化纳米凝胶作为氟-19磁共振成像纳米造影剂的应用，其特征在于用于诊断剂的负载、递送和通过氟-19磁共振成像示踪。
18.如权利要求17所述的诊断剂，其特征在于选自放射性核素(包括125I、131I、90Y、88Y、111In、64Cu、99mTc和18F)、荧光剂(包括荧光素、罗丹明、吖啶染料、Alexa染料、菁染料)、荧光蛋白(包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强GFP、红色、蓝色、黄色、青色和蓝宝石荧光蛋白)，发光蛋白(包括荧光素酶、aeqourin及其衍生物)、MRI造影剂(包括钆螯合物、铁、镁、锰、铜和铬)和/或其组合。
19.如权利要求12所述的两性离子氟化纳米凝胶作为氟-19磁共振成像纳米造影剂的应用，其特征在于键合靶向剂和通过氟-19磁共振成像示踪。
20.如权利要求19中所述的靶向剂，其特征在于选自任何适当分子，包括但不限于蛋白质、肽、多糖或寡糖、糖蛋白、脂质和脂蛋白、核酸，以及具有特定生物活性的合成有机或无机分子，例如抗生素、抗炎剂或细胞粘附介质。
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