CN111803636B - 1-磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA-9调控血管生成的药物靶点的应用 - Google Patents

1-磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA-9调控血管生成的药物靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种1‑磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA‑9调控血管生成的药物靶点的应用。1‑磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA‑9调控血管生成的药物靶点在制备治疗血管生成药物中的应用。本发明能够通过1‑磷酸鞘氨醇受体1调控血管生成，特别是miR‑9诱导的血管生成，具体为：促进S1P1的表达可以抑制血管内皮细胞迁移、侵袭和血管生成，而抑制S1P1的表达可以促进血管内皮细胞迁移、侵袭和血管生成。

Description

1-磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA-9调控血管生成的药物靶 点的应用
技术领域
本发明属于血管生成技术领域，具体涉及一种1-磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA-9调控血管生成的药物靶点的应用。
背景技术
血管生成是动脉粥样硬化斑块破裂、肿瘤等疾病进程中的一个关键病理生理事件。血管生成涉及一个复杂的血管生长过程，指的是现有血管上出芽形成新血管，或肿瘤等组织中新生血管样结构。血管生成障碍可导致心肌梗死、中风或肥胖相关性疾病的缺血，而过度的血管生成则会促进包括肿瘤、炎症性疾病如动脉粥样硬化，以及眼病的发生发展。抗血管生成疗法已被用于抗击肿瘤转移。当前抗血管生成的策略主要针对肿瘤血管的修剪(vessel pruning)、破坏、正常化及肿瘤增敏，但治疗效果均不理想。贝伐单抗拮抗血管内皮生长因子 (VEGF)诱导的血管正常化，从而减轻水肿。血管破坏剂如VB-111通过促进肿瘤饥饿和增强肿瘤环境中的血管通透性来破坏血管生成系统，从而促进水肿并招募免疫细胞。抗血管生成治疗和免疫检查点抑制剂相结合，可以达到较好的癌症治疗效果。当前，尚缺少理想的血管生成的靶向调控药物。
血管生成过程相当复杂，包括基底膜和细胞外基质的局部破坏，毛细血管内皮细胞向周围组织的增殖和迁移，以及新血管的形成。在促血管生成信号(包括细胞因子和相关受体)的刺激下，内皮细胞迁移和侵袭能力增强。最近研究发现，微小RNA(MicroRNAs，miR)与肿瘤发生和血管生成密切相关，可调控相关基因的表达。乳腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、肺癌、结直肠癌和卵巢癌等高表达miR-9。miR-9在肿瘤相关性内皮细胞中显著高表达。最近研究表明， miR-9可以通过活化自噬促进血管生成，还可以通过自噬促进内皮祖细胞血管生成。在动脉粥样硬化中，miR-9与脂质聚集和泡沫细胞的形成密切相关，可能用于抑制动脉粥样硬化斑块内血管生成。
内皮细胞中富含G蛋白偶联受体1-磷酸鞘氨醇(又称鞘氨醇-1-磷酸，sphingosine-1-phosphate，S1P)受体1，之前称为内皮细胞分化基因-1(endothelialdifferentiation gene-1,EDG-1)。在体内血管发育过程中，内皮细胞需要S1P1。但是，miR-9诱导的血管生成与S1P受体1之间的关系尚不明确。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种1-磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA-9调控血管生成的药物靶点的应用，通过1-磷酸鞘氨醇受体1调控血管生成，特别是miR-9诱导的血管生成，具体为：促进S1P1的表达可以抑制血管内皮细胞迁移、侵袭和血管生成，而抑制S1P1的表达可以促进血管内皮细胞迁移、侵袭和血管生成。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
1-磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA-9调控血管生成的药物靶点在制备治疗血管生成药物中的应用。
进一步地，药物为通过抑制1-磷酸鞘氨醇受体1表达来促进microRNA-9 表达的药物。
进一步地，药物包括抑制1-磷酸鞘氨醇受体1表达的抑制剂。
进一步地，抑制剂为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义 RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体中的至少一种。
进一步地，抑制剂为病毒载体或质粒。
进一步地，药物为促进microRNA-9表达的药物。
进一步地，药物为治疗血管生成障碍导致的心肌梗死、中风或肥胖相关性疾病的缺血的药物。
进一步地，药物为抗血管生成药物。
进一步地，该抗血管生成药物包括抑制miR-9表达的药物。
一种用于检测microRNA-9诱导的血管生成生成的试剂盒，包括用于检测 1-磷酸鞘氨醇受体1表达量的引物。
本发明的有益效果为：
本发明基于新的实验现象和作用机制，发现1-磷酸鞘氨醇受体1是miR-9 调控血管生成的作用靶点。在此基础上，通过1-磷酸鞘氨醇受体1调控血管生成，特别是miR-9诱导的血管生成，通过促进S1P1的表达可以抑制miR-9诱导的血管内皮细胞迁移、侵袭和血管生成，而抑制S1P1的表达可以促进miR-9诱导的血管内皮细胞迁移、侵袭和血管生成。
附图说明
图1为qRT-PCR检测miR-9过表达的HUVECs中的miR-9和S1P1表达水平；
图2为免疫印迹法检测miR-9过表达的HUVECs中S1P1表达水平；
图3为S1P1与miR-9的相关性检测；
图4为S1P1对VEGF和miR-9诱导的血管生成的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1细胞培养
1、人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs，Allcells，中国上海)培养于HUVEC 培养基(HUVEC-004；Allcells)中。利用携带miR-9模拟物 (5′-TCTTTGTGTATCTAGCTTGTATGA-3′；SEQ ID NO.1)及其阴性对照(NC； 5′-UUGUACUACAAAAGUACUG-3′；SEQ ID NO.2；B04001；GeneParma，中国上海)的慢病毒对血管内皮细胞进行转染，构建血管内皮细胞miR-9过表达的内皮细胞株及其阴性对照。
2、将S1P1的cDNAs接入质粒pcDNA3.1中，利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)完成血管内皮细胞转染，使血管内皮细胞过表达S1P1。转染48小时后备用，以便于进行后续细胞实验。
3、重组人血管内皮生长因子165蛋白(50ng/mL；hVEGF；293-VE，R&D system，美国)用于检测S1P1过表达对血管内皮细胞的迁移、侵袭和体外血管生成的作用。
实施例2实时荧光定量PCR分析miR-9对S1P1表达的抑制作用
利用Trizol从实施例1培育得到的miR-9过表达的细胞中提取RNA，并使用SYBRPremix Ex-Taq试剂盒(TaKaRa,日本)进行qRT-PCR检测，引物具体序列如下：
S1P1-F：5′-tttctggggagggattatgt-3′；(SEQ ID NO.3)
S1P1-R：5′-gcagagaggcgggagttatt-3′；(SEQ ID NO.4)
GAPDH-F：5′-tgttcgtagggtgatgac-3′；(SEQ ID NO.5)
GAPDH-R：5′-atggcatgggtcat-3′；(SEQ ID NO.6)
所有引物和探针均来自TaKaRa。使用2–△△CT方法分析基因表达水平，最终结果表示成与相应对照的相对表达水平。
miR-9和U6小核(sn)RNA的茎环引物和探针如下：
hsa-miR-9-5p-F：5′-acactccagtgggtctttgtttatctag-3′；(SEQ ID NO.7)
hsa-miR-9-5p-R：5′-ctcactggtgtcaggcagtcagtcagtcagttgagtcag-3′；(SEQ IDNO.8)
U6-snRNA-F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；(SEQ ID NO.9)
U6-snRNA-R：5′-aacgcttcacgaatttgcgt-3′。(SEQ ID NO.10)
miR-9的相对表达水平被标准化为U6-snRNA的相对表达水平，并表达成相应对照的相对表达水平。实验进行三次独立重复，其结果见图1。
如图1所示，图1中左侧附图为对照组和实验组(miR-9)中miR-9表达量的检测结果；右侧附图为对照组和实验组(miR-9)中S1P1 mRNA表达量的检测结果；平均值±标准误差。n＝4，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与NC相比。
与NC(miR-9模拟物阴性对照)相比，miR-9组(实验组)的ECs细胞中 miR-9增加了94.3倍(图1左侧附图)；与对照组相比，实验组的ECs细胞中 S1P1的mRNA水平显著下调(实验组中S1P1表达量为0.18±0.04，对照组中 S1P1表达量为1.01±0.07，P<0.001，图1右侧附图)，说明miR-9基因的过表达能够有效的抑制S1P1的基因表达水平。
实施例3免疫印迹分析
用含有蛋白酶抑制剂cocktail(碧云天，中国)的细胞裂解液从从实施例1 培育得到的miR-9过表达的细胞中提取蛋白质。使用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳对等量(20-30μg) 蛋白质样品进行片段分离，然后电转，使蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)上，膜用5％的脱脂奶粉封闭液封闭后，用S1P1抗体(1：1000稀释)4℃孵育过液。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。用辣根过氧化物酶(HRP)结合二抗(1:5000；碧云天)常温孵育，并使用Western化学发光HRP底物(WBKLS0050；Millipore，美国)进行增强化学发光以显示条带。使用ImageJ软件(1.52u版；美国立卫生研究院)进行灰度值测量，然后收集实验组、对照组和正常组蛋白各20μg进行Western Blot检测，其结果见图2。图2中对照组为miR-9模拟物阴性对照(NC)；正常组为正常的HUVECs细胞(Normal)；平均值±标准误差。 n＝3，***P<0.001与NC。
如图2所示，实验组中S1P1的表达水平显著下调，低于正常组细胞和对照组细胞(实验组中S1P1表达量为0.30±0.11；对照组中S1P1表达量为1.20± 0.07，P<0.001)，而正常组细胞之间S1P1表达水平无明显变化，表明miR-9显著抑制S1P1的mRNA和蛋白表达水平。
实施例4双荧光素酶报告分析检测MiR-9与S1P1的靶向关系
将S1P1的野生型(WT)和相应的突变位点(MUT)分别克隆到psiCHECK-2 载体(Promega，美国)中。重组报告质粒经DNA测序验证后，用lipofectamine2000 试剂将其转染入miR-9高表达细胞和NC细胞。使用双荧光素酶报告检测系统 (E1910，Promega)测定荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性被标准化为萤火虫荧光素酶活性的相对值。其结果见图3，图3中A为S1P1 mRNA的结构。编码 DNA序列(CDS)，非翻译区域中miR-9在3′UTR处的结合位点及其突变序列。 B为荧光素酶活性测定结果，其中，NC为miR-9模拟物阴性对照。平均值±标准误差。n＝3，***P<0.001与NC。
如图3所示，在S1P13′UTR的2390-2386位置有一个miR-9结合位点 (7mer-A1)。利用含有WT和S1P1(2390-2386)3′UTR位点的荧光素酶报告质粒分析发现，miR-9显著抑制S1P1的WT-3′UTR细胞的荧光素酶活性，而miR-9对具有MUT-3′UTR的细胞的荧光素酶活性没有明显的抑制作用，表明 S1P1是一个真正的miR-9靶点。
实施例5 S1P1过表达对VEGF诱导的内皮细胞迁移、侵袭及血管生成的影响
将实施1中培育得到的VEGF细胞用0.25％EDTA胰蛋白酶消化，并重悬于含有或不含50ng/mL hVEGF的血管内皮细胞基础培养基(HUVEC-004B； Allcells)中。细胞以每个Transwell(BD Biosciences)100000个细胞的密度接种，并将含有10％胎牛血清的基础培养基添加到下室。侵袭实验除膜使用 Matrigel预包被外，其他操作与迁移检测相同。48小时后，对通过细胞膜的迁移或侵袭细胞进行计数，评价细胞的迁移和侵袭能力变化。其结果见图4中A～G。
图4中A为S1P1蛋白的免疫印迹分析检测结果；根据其检测结果可知，S1P1 过表达后，S1P1在ECs中显著过表达(2.17±0.11vs.0.89±0.03，S1P1过表达 vs.载体，P<0.05)。
图4中B、C、D为HUVECs的迁移和侵袭检测结果，平均值±标准误差， n＝4。***P<0.001vs.Vector。根据B、C、D的检测结果可知，S1P1的过表达显著抑制了50ng/mL VEGF诱导的迁移和侵袭。因此，S1P1的过表达显著抑制了 VEGF诱导的内皮细胞管形成。
图4中E、F、G为血管生成情况检测结果；其中，E为血管网络；F为血管长度；G为连接数；平均值±标准误差，n＝4，*P<0.05，**P<0.01vs.Vector。根据E、F、G的检测结果可知，由于S1P1过表达，生成的血管长度和连接数量显著减少。这些结果表明S1P1的过表达抑制了VEGF诱导的HUVECs血管生成。通过S1P1可以调控VEGF诱导的血管生成。
实施例6 S1P1过表达对miR-9诱导的内皮细胞迁移、侵袭及血管生成的影响用pcDNA3.1 S1P1(miR-9+S1P1)表达质粒或pcDNA3.1空质粒(miR-9+Vector)转染过表达miR-9的血管内皮细胞。转染48小时后，将细胞接种入Transwell，进行蛋白水平分析、细胞迁移、侵袭和体外血管生成实验。其结果见图4中H～M。
图4中H～M为HUVECs的迁移、侵袭和血管生成的检测结果。其中，NC 为miR-9模拟物阴性对照。平均值±标准误差，n＝4。*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001vs.NC；P<0.001vs.miR-9。
由图4 中 H～M可知，S1P1表达的恢复显著逆转了miR-9诱导的HUVECs迁移、侵袭和血管生成。通过恢复S1P1的表达(图4 中 K-M)，miR-9诱导的血管生成、血管长度和连接数量显著减少(图4 中 K-M)。表明通过S1P1可以调控miR-9诱导的血管生成。
序列表
<110> 四川大学
<120> 1-磷酸鞘氨醇受体1作为microRNA-9调控血管生成的药物靶点的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctttgtgta tctagcttgt atga 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uuguacuaca aaaguacug 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttctgggga gggattatgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcagagaggc gggagttatt 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgttcgtagg gtgatgac 18
<210> 6
<211> 14
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcatggg tcat 14
<210> 7
<211> 28
<212> DNA/RNA
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<400> 7
acactccagt gggtctttgt ttatctag 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acactccagt gggtctttgt ttatctag 28
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<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 10
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (3)

1.过表达1-磷酸鞘氨醇受体1的质粒在制备治疗血管生成药物中的应用，所述过表达1-磷酸鞘氨醇受体1的质粒为pcDNA3.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗血管生成引起的肿瘤的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为抗血管生成药物。
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