CN111789949A - 基于特异性趋化因子受体的阿尔兹海默病治疗靶点 - Google Patents

基于特异性趋化因子受体的阿尔兹海默病治疗靶点 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于特异性趋化因子受体的阿尔兹海默病治疗靶点。本发明提供的是与趋化因子受体或其基因特异性结合的分子在制备阿尔兹海默病的治疗的试剂或试剂盒中的应用。本发明还提供用于治疗阿尔兹海默病的试剂盒和组合物，以及阿尔兹海默病的治疗方法。本发明通过以趋化因子受体为靶点对阿尔兹海默病进行治疗，特异性高，效果优异。

Description

基于特异性趋化因子受体的阿尔兹海默病治疗靶点
技术领域
本发明涉及生命科学的技术领域，具体地，本发明涉及阿尔兹海默病的治疗靶点和治疗方法，更具体地，本发明涉及基于特异性趋化因子受体的阿尔兹海默病治疗靶点和治疗方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，是全世界老年人中最常见的神经系统退行性疾病之一，其主要症状为渐进性记忆丢失、认知功能障碍、智力水平的慢性缺失。阿尔茨海默病已严重影响越来越多的老年人。据统计数据表明，目前全球AD患者总数已经超过3500万，预计到2050年该数目将增至1.15亿。
中国人口基数大、老龄化程度高。我国2010年第六次全国人口普查数据显示，中国60岁及以上人口已经达到1.78亿，占全国总人口的13.3％，预计到2050年，老龄化人口将达到4.3亿。因此对于中国来说，该疾病是一个强大的负担。而在全球范围内，2010治疗阿尔兹海默病的成本约6040亿美元，相当于全球总GDP的1％，其增长幅度可能会比患病率还要高，给家庭、社会带来了巨大的经济、人力负担。因此，如何能够早期发现和诊断该疾病，是有效降低AD发生的关键。
阿尔茨海默病的病理特征包括神经元细胞外出现以淀粉样蛋白(Aβ)过度聚集形成的老年斑(senile plaques，SP)；还包括神经元胞体内出现高度磷酸化TAU蛋白聚集所形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)。Aβ作为老年斑最为重要的成分，在阿尔茨海默的发生发展中发挥着极为重要的作用。
Aβ是多种细胞的正常产物。在病理状态下，β淀粉样前体蛋白被β-和γ-分泌酶水解产生40个氨基酸残基或42个氨基酸残基的Aβ肽段。Aβ42形成的寡聚体可直接对神经元产生毒性作用，引起线粒体损伤，诱导神经元凋亡，加速神经纤维缠结的出现，并进一步造成空间记忆缺失。Aβ通过作用于血液单核细胞或者脑内胶质细胞上的多种受体，激活星型胶质细胞与小胶质细胞，活化的星型胶质细胞与小胶质细胞产生多种炎症反应补体，炎症细胞因子，诱发脑内炎症反应，加重AD病人的恶化。因此，发现Aβ42相关的功能性受体对推动AD研究发展具有重要意义。
鉴于Aβ是导致阿尔兹海默病发病机制的主要候选者(参见参考文献1-3)。迄今已有重点努力集中寻找Aβ受体，特别是在神经元中。已经鉴定出几种Aβ受体，包括PrPc(参见参考文献4)、α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)(参见参考文献5)和白细胞免疫球蛋白样受体B2(LirB2)/配对免疫球蛋白样受体B(PirB)(参见参考文献6)等。这些受体在记忆和认知功能的进行性丧失中起重要作用。此外，研究报道小胶质细胞，星型胶质细胞或神经元上存在数种内源性Aβ受体，如清道夫受体(SR)、糖基化终产物受体(RAGE)、和G蛋白偶联受体(FPR2)等。但是，这些受体能否作为治疗Aβ42寡聚体引起的痴呆症状依旧存在争议。而且，已发现的这些受体特异性不高，并且不特异性针对有神经毒性的Aβ寡聚体；基于已发现的受体治疗不能改善阿尔兹海默症的多种症状。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于上述现有技术中的问题和现状，本发明的目的在于，基于仅被Aβ寡聚体激活、而不会被其他形式的Aβ如Aβ单体和Aβ纤维缠结激活的受体，提供阿尔兹海默病的治疗靶点和基于该靶点的治疗方法。
用于解决问题的方案
本发明人进行了深入研究，验证了趋化因子受体是促进阿尔兹海默病相关的病理学的Aβ寡聚体的特异性受体，并且利用发现的Aβ寡聚体特异性受体，通过减少炎症反应，改善阿尔兹海默病症状。因此，已完成了本发明。
在一个技术方案中，本发明提供与趋化因子受体或其基因特异性结合的分子在制备阿尔兹海默病的治疗的试剂或试剂盒中的用途，所述趋化因子受体包含CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7，XCR1和/或CX3CR1，优选为CCR2、CCR3、CCR4和/或CX3CR1，更优选CX3CR1。
在一个技术方案中，本发明提供上述用途，其中所述与趋化因子受体或其基因特异性结合的分子包含能够敲除或敲低趋化因子受体的病毒或趋化因子受体拮抗剂。
在一个技术方案中，本发明提供一种用于治疗阿尔兹海默病的试剂盒，其包含与趋化因子受体特异性或其基因结合的分子。
在一个技术方案中，本发明提供上述用于治疗阿尔兹海默病的试剂盒，其中所述与趋化因子受体特异性或其基因结合的分子为病毒或趋化因子受体拮抗剂。
在一个技术方案中，本发明提供一种用于治疗阿尔兹海默病的组合物，其包含与趋化因子受体特异性或其基因结合的分子。
在一个技术方案中，本发明提供一种阿尔兹海默病的治疗方法，其包括给药敲除或敲低趋化因子受体的病毒，所述趋化因子受体包含CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7，XCR1和/或CX3CR1，优选为CCR2、CCR3、CCR4和/或CX3CR1，更优选CX3CR1。
在一个技术方案中，本发明提供上述治疗方法，其中给药方法包括静脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入途径给药，优选静脉内给药。
在一个技术方案中，本发明提供CX3CR1受体在制备阿尔兹海默病的检测、诊断、或治疗的试剂或试剂盒中的用途。
在一个技术方案中，本发明提供一种用于检测、诊断、或治疗阿尔兹海默病的试剂盒，其包含CX3CR1受体。
在一个技术方案中，本发明提供上述用于检测、诊断、或治疗阿尔兹海默病的试剂盒，其中所述CX3CR1受体存在于细胞中或细胞表面上，所述细胞为单核吞噬细胞，优选地，所述细胞为选自T细胞和自然杀伤(NK)细胞亚群、DC亚群、小神经胶质细胞、血液单核细胞的一种或多种，更优选地，所述细胞为外周血单核细胞或RAW 264.7细胞；所述多孔膜为无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜。
发明的效果
本发明通过以趋化因子受体为靶点对阿尔兹海默病进行治疗，特异性高，效果优异。
从以下详细的说明和附图、以及从权利要求中，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图说明
图1是描述Aβ寡聚体吸引单核细胞迁移的示意图。(A)，Transwell迁移测定(左图)和计算的簇(cluster)(右图)的示意图。(B)，RAW 264.7细胞迁移的代表性图像。上图：原始图像；下图：从上图提取的迁移的细胞。(C)，Aβ42寡聚体和CX3CL1(CX3CR1受体的内源性配体(参见参考文献12))增加了迁移RAW 264.7簇的数量。(D)，Aβ42寡聚体增加了从野生型小鼠中提取的迁移外周血单核细胞(PBMC)的数量。每次实验每组重复2-3个孔，每组3次以上实验。相对于PBS对照组，*P<0.05且***P<0.001。单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后Tukeys事后检验(Tukeys’s post-hoc test)。数据为平均值±SEM。比例尺＝100μm。
图2是说明CX3CR1对Aβ42寡聚体诱导的单核细胞迁移至关重要的示意图。(A)和(B)，用CX3CR1-抗体或PTX预处理的RAW 264.7簇的代表性图像。上图：原始图像；下图：从上图提取的迁移的细胞。(C)，用CX3CR1抗体和PTX预处理阻止Aβ42寡聚体(左图)或CX3CL1(右图)介导的迁移簇的数量增加。(D)，CRISPR-cas 9转染的RAW 264.7簇迁移的代表性图像。上图：原始图像；下图：从上图提取的迁移的细胞。(E)，用靶向CX3CR1的CRISPR-cas9转染RAW 264.7细胞阻止Aβ42寡聚体或CX3CL1介导的迁移簇数增加。(F)，Aβ42寡聚体不影响来自CX3CR1GFP/GFP小鼠的迁移PBMC的数量。每个处理组3次以上实验。相对于PBS对照组，**P<0.01且***P<0.001；相对于Aβ42寡聚体或CX3CL1组(D)，##P<0.01且###P<0.001，NS，不显著。单因素方差分析，然后Tukeys事后检验。数据为平均值±SEM。比例尺＝100μm。
图3是描述Aβ42寡聚体诱导恒河猴和人源PBMC迁移的示意图。(A-B)，从恒河猴血液中提取的PBMC的代表性图像。上图：原始图像；下图：从上图提取的迁移的细胞。(C)，Aβ42寡聚体和CX3CL1增加迁移的PBMC。CX3CL1和PTX阻断Aβ42寡聚体或CX3CL的作用。(D-E)，从人血液中提取的PBMC的代表性图像。上图：原始图像；下图：从上图提取的迁移的细胞。(F)，Aβ42寡聚体和CX3CL1增加迁移的PBMC。CX3CL1和PTX阻断Aβ42寡聚体或CX3CL的作用。将来自2-3只恒河猴或人的血液合并在一起用于一次实验。每个处理组9-10次实验。相对于PBS组，*P<0.05，***P<0.001；相对于Aβ42寡聚体或CX3CL1组，#P<0.05，###P<0.001。单因素方差分析，然后Tukeys事后检验。数据为平均值±SEM，并且示出了各实验数据点。比例尺＝100μm。
图4是描述Aβ42寡聚体诱导人CX3CR1的Tango测定的剂量依赖性反应的示意图。(A)，生物素-β-淀粉样蛋白(1-42)-寡聚体(生物素-Aβ42寡聚体)与hCX3CR1 HEK293细胞结合。(B)，改编自Kroeze WK等人(参见13)的Tango构建体的模块化设计。HA，血凝素。第一、二处箭头，Cla I位点；第三、四处箭头，Age I位点。(C)，β-抑制蛋白募集试验(β-arrestinrecruitment assay)的方案。(D)，未转染的细胞对Aβ42寡聚体的反应的浓度-反应曲线。(E)，hCX3CR1对Aβ42单体、纤维和寡聚体的反应的浓度-反应曲线(EC 50＝0.24μM单体当量)。(F)，hCX3CR1对CX3CL1的反应的浓度-反应曲线(EC 50＝0.23nM)。值为各自来自3次实验的6次测量的平均值。(G)和(H)，Aβ42寡聚体和CX3CL1在hCX3CR1转染的HEK293细胞中激活ERK1/2磷酸化(p-ERK1/2)。相对于Aβ42单体组，***P<0.001；相对于Aβ42寡聚体组，###P<0.001。单因素方差分析，然后Tukeys事后检验。数据为平均值±SEM。比例尺＝10μm。
图5是采用细胞模型发现Aβ寡聚体特异性受体的流程图。
具体实施方式
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。与本文中所述的那些相似或等同的任何方法、装置和材料可以用于本公开的实践。提供以下定义从而便于理解在本文中频繁使用的某些术语并且不旨在限制本公开的范围。
必须注意的是，如本文中和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一个/种”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指示对象。
如本文中所使用的，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”旨在意指组合物和方法包括叙述的要素，但是不排除其它。“基本上由...组成”在用于定义组合物和方法时将意指排除对用于所述目的的组合具有任何实质意义的其它要素。因此，如本文中定义的基本上由要素组成的组合物将不排除不会实质地影响请求保护的基本和新颖的特征的其他材料或步骤。“由...组成”将意指排除超过痕量要素的其它成分和实质性的方法步骤。由这些过渡术语的每一个定义的实施方案在本公开的范围内。
如本文所使用的术语“约”在数字标识(例如，温度、时间、量和浓度，包括范围)之前使用时表示可以变化(+)或(-)10％、5％或1％的近似值。
如本文所使用的术语“检测”是指获得疾病相关的信息例如数据或图像等。“检测”可以定量或定性进行。“检测”不需要该方法提供100％的灵敏度和/或100％的特异性。
如本文所使用的术语“诊断”是指旨在获得在评估患者是否或有可能或比平均值或比较受试者(后者优选地具有相似的症状)更可能在过去、在诊断时或在将来的时候患有某种疾病或病症的有用信息以找出疾病如何进展或在未来有可能进展或评估患者针对某种治疗(例如施用合适的药物)的反应性的任何种类的操作。换言之，术语“诊断”不仅包括帮助诊断，而且包括预后和/或监测疾病或病症进程的努力。
因此，术语“诊断”优选地不暗示根据本发明的诊断方法或试剂将是确定性的并且足以基于单个测试(更不用说参数)来完成诊断。例如，可需要收集较多的进一步的信息，例如通过成像技术(超声扫描和计算机断层扫描)，并且需要由医生仔细考量以获得一致的图像或信息，其允许所述医生提供最终的诊断。
术语“诊断”可以指对所谓的“鉴别诊断”的贡献，即，考虑基于一系列诊断参数的一系列可能条件的可能性的系统诊断操作。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或药剂。换句话说，所述方法或药剂可涉及选择受试者的治疗方案。
如本文所使用的术语“治疗”涵盖治疗哺乳动物中，特别是人中的疾病状态，并且包括：(a)预防疾病状态在哺乳动物中发生，特别是当这种哺乳动物易患此疾病状态但尚未诊断患此疾病状态时；(b)抑制所述疾病状态，即，阻止疾病状态发展；和/或(c)消除疾病状态，即，使疾病状态消退。
如本文所使用的术语“生物样品”或“样品”是指从受试者或患者获得或源自受试者或患者的材料。生物样品可包括组织的切片如活检和尸检样品，以及为了组织学目的而取的冷冻切片。这类样品还可包括例如血液等体液和血液级分或产品(例如，血清、血浆、血小板和红细胞等)、痰、组织、培养的细胞(例如，原代培养物、外植体和转化的细胞)、粪便、尿、滑液、关节组织、滑膜组织、滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、免疫细胞、造血细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等。在优选实施方案中，所述生物样品是从受试者或患者获得或源自受试者或患者的脑脊液。
如本文所使用的术语“给药方法”意指，根据公知的方法，例如静脉内给药(例如，作为大丸剂或通过经一段时间连续输注)，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入途径，将制剂给予需要用抗体治疗的哺乳动物，优选人。在一个实施方案中，通过静脉内给药将制剂给予哺乳动物。为了这种目的，可以例如使用注射器或通过IV管线(line)注射制剂。在一个实施方案中，通过静脉注射将制剂给予哺乳动物。
如本文所使用的术语“趋化因子受体拮抗剂”意指，与趋化因子受体结合后本身不引起生物学效应，但阻断趋化因子受体与Aβ或与其他趋化因子激动剂的作用。该趋化因子受体拮抗剂可以包括竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂。在本文中，“拮抗剂”、“阻滞剂”、“抑制剂”或“调节剂”可以互换地使用。
本文还提供的是制品或试剂盒，其包含容纳本文所述的任何实施方案的水性药物制剂的容器，并且任选地提供其使用说明。合适的容器包括例如，瓶(bottle)、管瓶(vial)、袋和注射器。容器可以从多种材料例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)、或合金(例如不锈钢或哈斯特洛合金)形成。示例性容器为300cc合金容器(例如用于在-20℃下贮存)。另一示例性容器可为10-50cc玻璃管瓶(例如用于在2-8℃在贮存)。例如，容器可为10cc、15cc、20cc、或50cc玻璃管瓶。容器容纳制剂，并且在容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。制品可以另外包括其他从商业和使用者的角度期望的材料，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针、注射器、和具有使用说明的包装插页。在一些实施方案中，制品另外包括一种或多种其他试剂(例如，化学治疗剂、和抗肿瘤剂)。用于一种或多种试剂的合适的容器包括例如，瓶、管瓶、袋和注射器。
趋化因子受体属于7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族，通常表达于免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上，与趋化因子结合后活化下游效应物参与炎症反应。按趋化因子的分类，将同CC类趋化因子结合的受体称为CC类受体(CCR)，包括CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、和CCR10；同CXC类趋化因子结合的受体称为CXC类受体(CXCR)，包括CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、和CXCR7，同样有C和CX3C受体(CR、CX3CR)，包括CX3CR1等；此外还包括XCR1等。趋化因子受体在AD病人中枢和外周免疫细胞中表达增加。我们发现趋化因子受体能够特异性与Aβ寡聚体结合，被Aβ寡聚体激活，启动下游信号通路，使细胞发生趋向性运动。
其中，趋化因子受体CX3CR1(C-X3-C motif chemokine receptor 1)富含于包括T细胞和自然杀伤(NK)细胞亚群、DC亚群、脑小神经胶质细胞以及血液单核细胞等的单核吞噬细胞中，其被发现在阿尔兹海默病中起重要作用，参与炎症反应(参见参考文献8)、神经元丢失(参见参考文献9)和长期增强障碍(参见参考文献10,11)的病理学。
分离并纯化不同类型的Aβ刺激表达有趋化因子受体的细胞，观察Aβ单体，Aβ寡聚体和Aβ纤维缠结与受体的结合情况。筛选出只与Aβ寡聚体特异性结合的受体。见图5，趋化因子受体与配体结合后，通过激活下游不同的信号通路，产生多种生物学功能。其主要的生物学功能包括引起趋化，产生钙流，调节炎症反应。免疫细胞如巨噬细胞，树突细胞上的趋化因子受体被激活后，通过激活钙流信号通路，引起内钙的释放，同时激活NF-kB，Erk等不同的信号通路，促进巨噬细胞等免疫细胞迁移，调节体内炎症反应。采用不同类型的细胞，这些细胞的共同点是表达有趋化因子受体。用Aβ单体，Aβ寡聚体和Aβ纤维缠结刺激细胞，观测并测定细胞内钙离子释放情况，蛋白酶磷酸化情况以及细胞内转录因子水平的改变。这些指标均用来反应Aβ寡聚体与细胞表面特异性受体结合并激活受体后细胞功能改变。最终确定Aβ寡聚体的特异性趋化因子受体。
实施例
本发明将借助下述实施例进一步详细描述。然而，本发明不意欲受这些实施例的限制。
材料与方法
小鼠
在本文中使用C57/BL6J小鼠和CX3CR1GFP/GFP(C57/BL6背景)小鼠。CX3CR1GFP/GFP品系由Bo Peng(SIAT)赠予。对于原代小神经胶质细胞的培养，使用各基因型的出生后第0天的小鼠。小鼠在中国科学院(CAS)深圳先进技术研究院(SIAT)的无特定病原体设施中饲养。动物饲养和动物实验操作的各个方面均经中国科学院(CAS)深圳先进技术研究院(SIAT)的动物管理和使用委员会批准。
Aβ单体、寡聚体和纤维的制备
Aβ单体：将人Aβ42(AnaSpec)或人生物素-β-淀粉样蛋白(1-42)(AnaSpec)以1mM溶解于冷的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)中，并孵育2小时，从而使Aβ单体化。将单体干燥并储存在-80℃下。
Aβ寡聚体：对于寡聚化，参见参考文献27中的方法，将干燥的肽重悬于DMSO中至5mM的浓度。超声处理并用PBS稀释至浓度为100μM。将溶液涡旋30秒，然后在4℃下温育12小时从而进行寡聚化。
Aβ纤维：将干燥的肽溶解于DMSO中，然后稀释至PBS中，随后在37℃下温育24小时，从而制备Aβ42纤维。
细胞培养
在37℃下、含有5％CO2/95％空气的加湿培养箱中，在补充有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM中，培养HEK 293(F)T细胞、HTLA细胞(稳定表达tTA依赖性荧光素酶报告基因和β-arrestin2-TEV融合基因的HEK293细胞系)和A鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7。
转染和病毒生产
所有转染均用优化的磷酸钙方法完成(参见Jordan，M.，Nucleic AcidsRes.1996)。将HEK 293FT细胞以1至2×105个细胞/cm培养皿涂板。24小时后，使用磷酸钙转染试验，用1.5至2μgDNA/cm培养皿转染细胞。将包装质粒pVSVg(Addgene 8454)和psPAX2(Addgene 12260)共转染以用于病毒生产。转染后12至16小时，吸出培养基并加入新鲜培养基。48小时后收集上清液，从而转染原代小神经胶质细胞、INS-1E细胞和RAW 264.7细胞至少48小时。通过蛋白质印迹法评价转染效率。
蛋白质印迹法
将细胞在RIPA缓冲液(20mmol/L Tris-HCL pH 7.5，150mmol/L Nacl，1mmol/LEDTA，1％Triton-X100，0.5％脱氧胆酸钠，1mmol/L PMSF，和10μg/ml亮抑酶酞(leupeptin))中均化。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离来自每个样品的50μg等份的蛋白质。随后将凝胶转移到硝酸纤维素膜上，然后用PBS(pH7.4)中的5％脱脂牛奶封闭。将该膜在4℃下与针对CX3CR1(Invitrogen；1:1000)、p-Erk(abcam,1:500)、和Flag(Sigma；1:500)的一抗温育过夜。在室温下施用针对兔或小鼠IgG(Invitrogen；1:1000)的HRP缀合的二抗2小时。使用SuperSignal West Pico Substrate将印迹暴露于化学发光检测系统并暴露于膜。用Image J软件使用光密度测量来量化数字图像。
标准抑制蛋白募集试验
将HTLA转染的细胞以每孔15,000至20,000个细胞在50μl培养基中转移至聚-L-赖氨酸涂覆的和冲洗的384孔白色透明底细胞培养板(Greiner Bio-One)中。第二天，在由20mM HEPES和1×HBSS组成pH 7.4的过滤灭菌的测定缓冲液中配制药物刺激溶液，并向每个孔中加入20μl。24小时后，从孔中取出培养基和药物溶液，并将在测定缓冲液中稀释20倍的Bright-Glo溶液(Promega)加入每个孔中(每孔20μl)。在室温下温育15至20分钟后，在Trilux发光计数器中计数发光。将相对发光单位(RLU)导出到Excel电子表格中，并使用GraphPad Prism进行数据分析。
迁移试验
1.小神经胶质细胞的迁移的移液器测定
将约3×104个小神经胶质细胞/cm2接种到PDL涂覆的35mm无菌玻璃底皿(In vitroScientific)中。使用LSM 880Zessis显微镜在37℃下、具有5％CO2的加湿室中捕获活细胞的图像。使用Image J追踪和量化单个细胞迁移。为了追踪小神经胶质细胞的运动并计数固定的细胞，用ImageJ的额外插件制作细胞的动态波形图(kymograph)。从每个延时图像的100帧计算计数的平均，以确保静止和移动事件的准确性。将小神经胶质细胞速度量化和平均为每秒距离置换(参见参考文献16，28)。
2.RAW264.7细胞的迁移的Transwell测定
Transwell测定是一种常用的测试，用于研究免疫细胞对炎症诱导物或抑制剂的迁移反应(图1A)。使用具有无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯(PVFP)过滤器(直径6.5mm，孔径5.0μm)的Transwell细胞培养室(Costar)进行RAW264.7细胞的迁移测定。收获RAW264.7细胞并用无FBS培养基洗涤，并且以1×105个细胞/200μl的密度重悬于无FBS培养基中，同时，将不同形式的Aβ(200nM)和CX3CL1(50nM)加入含有具有10％FBS的500μl培养基的底部孔中。将PTX或CX3CR1抗体预温育30分钟。在37℃下温育过夜后，轻轻取出插入物，并用棉签擦拭transwell内部。然后，将迁移至下表面的细胞用4％多聚甲醛固定，并且用结晶紫染色30分钟并在PBS中洗涤。对于每个过滤器，捕获五个随机选择的视野中的细胞。对于定量分析，用Image J计算迁移的斑块的数量和面积。
免疫细胞化学和共聚焦显微镜法
对于免疫染色，使用针对Iba-1(1:1000，WAKO；1:1000)、CX3CR1(Invitrogen；1:1000)、Flag(Sigma；1:500)的抗体。简言之，用PBS洗涤细胞，然后用4％PFA固定。然后，将细胞在室温下、5％BSA中透化1.5小时，然后用0.3％Triton X-100透化10分钟。然后将细胞用一抗在4℃下过夜处理。随后将用AlaxFluor 488或594标记的二抗加入细胞中。对于生物素-Aβ42寡聚体，将细胞与链霉抗生物素蛋白、Alexa Fluor 488缀合物(Thermofisher，1:1000)在室温下温育3小时。在共聚焦显微镜(LSM 880Zessi)上观察盖玻片。独立地重复实验至少三次。
实施例1.CX3CR1是促进阿尔兹海默病相关病理学的Aβ寡聚体的受体
为了验证CX3CR1是促进阿尔兹海默病相关病理学的Aβ寡聚体的受体，我们使用富含CX3CR1的鼠单核细胞系RAW 264.7，并通过上述Transwell测定(图1A)来评估这些细胞的趋化性迁移。计算迁移的细胞簇的数目。
结果，如图1B和C所示，Aβ寡聚体和CX3CL1显著增加了迁移的RAW 264.7簇的数量，而Aβ单体和纤维没有显示出效果。
我们还测试了在Aβ处理下从野生型小鼠中提取的外周血单核细胞(PBMC)的迁移。结果，如图1D所示，Aβ寡聚体显著增加迁移的PBMC的数量，而Aβ单体或纤维没有显示出效果。这些结果表明Aβ寡聚体可以吸引单核细胞迁移，而Aβ单体或纤维则不能。
实施例2.CX3CR1对Aβ寡聚体引起的PBMC迁移至关重要
为了进一步检验CX3CR1对Aβ寡聚体引起的PBMC迁移至关重要，我们使用CX3CR1抗体中和CX3CR1。
结果，如图2A、B和C所示，CX3CR1抗体阻断Aβ寡聚体诱导的和CX3CL1诱导的RAW264.7细胞迁移。这表明Aβ寡聚体或CX3CL1的迁移效应确实由CX3CR1激活介导。
已知CX3CR1诱导的迁移需要对百日咳毒素(PTX)敏感的G蛋白信号传导(参见参考文献12)。如图2A、B和C所示，在PTX处理下，Aβ寡聚体或CX3CL1对RAW 264.7细胞迁移的作用被消除，这表明Gi/o介导的途径在Aβ寡聚体诱导的和CX3CL1诱导的RAW 264.7细胞迁移中起关键作用。
ERK磷酸化是由CX3CR1激活触发的下游事件。当用Aβ寡聚体或CX3CL1处理时，RAW264.7细胞显示出增加的p-Erk，其被CX3CR1抗体的预处理阻断。
接下来，我们使用CRISPR/cas9慢病毒载体系统沉默CX3CR1表达。CRISPR/cas9沉默导致CX3CR1转录物的减少以及CX3CR1蛋白不可检测量。如图2D和E所示，基于CRISPR的CX3CR1敲低确实显著减少了迁移的RAW 264.7簇的数量。与基于CRISPR的敲低实验一致，Aβ寡聚体或CX3CL1对从CX3CR1GFP/GFP(CX3CR1KO)小鼠提取的PBMC没有显示迁移效应。
因此，上述结果表明，CX3CR1对于Aβ寡聚体诱导的单核细胞迁移是必需的。
实施例3.“寡聚Aβ-CX3CR1”信号通路在物种间具有通用性
为了严格检查“寡聚Aβ-CX3CR1”信号通路是否在物种间具有通用性，我们从恒河猴和人中提取PBMC，所述PBMC表达CX3CR1蛋白。然后，我们试验了Aβ寡聚体和CX3CR1之间的相互作用。将从2-3只恒河猴中提取的血液合并在一起，用于一次实验的PBMC提取。
结果，如图3A-C所示，Aβ寡聚体和CX3CL1显著增加迁移的PBMC的数量，而Aβ单体和纤维没有显示出效果。与该结果一致，通过CX3CR1抗体阻断CX3CR1活化、或者通过PTX抑制CX3CR1Gi/o途径，消除了Aβ寡聚体诱导的或CX3CL1诱导的从恒河猴提取的PBMC的迁移(图3A-C)。
我们还从健康献血者中提取PBMC以试验Aβ寡聚体的作用。如图3D-F所示，Aβ寡聚体以及CX3CL1显著增加迁移的PBMC的数量，而CX3CR1-抗体和PTX消除了Aβ寡聚体或CX3CL1对PBMC迁移的影响。
因此，上述结果表明，“寡聚Aβ-CX3CR1”信号通路在物种间具有通用性。
实施例4.Aβ寡聚体-CX3CR1的结合特异性
为了表征Aβ寡聚体-CX3CR1的结合特异性，我们在HEK293细胞中表达人CX3CR1受体(hCX3CR1)并用生物素-Aβ42寡聚体处理细胞。
结果，如图4A所示，生物素-Aβ42寡聚体与hCX3CR1转染的细胞结合，但不与未转染的细胞结合。并且，在CX3CR1抗体的预处理下未观察到结合。这表明Aβ寡聚体与CX3CR1受体特异性结合。值得注意的是，生物素-Aβ42单体或纤维不与hCX3CR1转染的细胞结合，这表明CX3CR1是寡聚Aβ的特异性受体。CX3CR1的激活可以触发多种细胞内信号传导事件，包括β-抑制蛋白募集和Gi/o依赖性途径的激活。
实施例5.CX3CR1通过与Aβ42寡聚体结合而被激活
为了试验CX3CR1是否通过与Aβ42寡聚体结合而被激活，我们将人CX3CR1(hCX3CR1)Tango构建体(参见参考文献13,14)(图4B和C)转染到HTLA细胞(稳定表达tTA依赖性荧光素酶报告基因和β-arrestin2-TEV融合蛋白的HEK293细胞系)中。
结果，如图4D所示，在未转染的对照细胞中，在不同浓度的Aβ42寡聚体刺激下，仅检测到最小的荧光素酶应答。如图4E所示，在用Tango化的hCX3CR1转染的细胞中，Aβ42寡聚体诱导剂量依赖性β-抑制蛋白募集和荧光素酶活性。相比之下，Aβ单体或Aβ纤维没有显示出效果。如图4F所示，与先前的发现(参见参考文献13)一致，CX3CL1诱导了Tango化的hCX3CR1的激活以及强烈的荧光素酶反应。如图4G和H所示，与β-抑制蛋白募集测定一致，我们发现Aβ寡聚体和CX3CL1均显著增加表达hCX3CR1的HEK293细胞中的ERK磷酸化。Aβ寡聚体对ERK磷酸化的影响弱于CX3CL1，而Aβ单体和Aβ纤维没有变化。因此，这些结果证实Aβ寡聚体与CX3CR1结合并激活包括β-抑制蛋白募集和ERK磷酸化的细胞内信号传导途径。
实施例6.通过基于趋化因子受体的阿尔兹海默病治疗靶点对阿尔兹海默病小鼠进行治疗
阿尔兹海默症转基因小鼠具有明显的星形胶质细胞激活和空间记忆下降。星形胶质细胞激活表现为细胞胞体变大，细胞分支变粗，和空间记忆损伤。将阿尔兹海默症转基因小鼠微静脉注射病毒，从而敲除血液中单核细胞的趋化因子受体。
结果，基于已发现的特异性趋化因子受体为靶点，阿尔兹海默症转基因小鼠星形胶质细胞激活得到明显改善，表现为细胞胞体缩小，分支变细。
同时，通过旷场实验检验小鼠的空间记忆。结果为空间记忆明显改善。
综上，CX3CR1是Aβ寡聚体的特异性趋化因子受体。此外，通过基于趋化因子受体的阿尔兹海默病治疗靶点对阿尔兹海默病小鼠进行治疗，取得了优异的效果。因此，利用基于趋化因子受体的阿尔兹海默病治疗靶点，提供了高特异性的治疗方法。
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以上制备例和效果例均是对于本发明具体实施方案和效果的示例，而不得被视为对本发明的限制。本发明公开和提出的所有方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料和条件等环节实现，尽管本发明的方法已通过较佳实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (10)

1.一种用于治疗阿尔兹海默病的试剂盒或组合物，其包含与趋化因子受体特异性或其基因结合的分子。
2.根据权利要求1所述的用于治疗阿尔兹海默病的试剂盒或组合物，其中所述与趋化因子受体特异性或其基因结合的分子为病毒或趋化因子受体拮抗剂。
3.一种用于检测、诊断、或治疗阿尔兹海默病的试剂盒，其包含CX3CR1受体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述CX3CR1受体存在于细胞中或细胞表面上，所述细胞为单核吞噬细胞，优选地，所述细胞为选自T细胞和自然杀伤(NK)细胞亚群、DC亚群、小神经胶质细胞、血液单核细胞的一种或多种，更优选地，所述细胞为外周血单核细胞或RAW264.7细胞；可选地，所述试剂盒还包含多孔膜，所述多孔膜为无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜。
5.CX3CR1受体在制备阿尔兹海默病的检测、诊断、或治疗的试剂或试剂盒中的用途。
6.与趋化因子受体或其基因特异性结合的分子在制备阿尔兹海默病的治疗的试剂或试剂盒中的用途，所述趋化因子受体包含CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7，XCR1和/或CX3CR1，优选为CCR2、CCR3、CCR4和/或CX3CR1，更优选CX3CR1。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述与趋化因子受体或其基因特异性结合的分子包含能够敲除或敲低趋化因子受体的病毒或趋化因子受体拮抗剂。
8.一种阿尔兹海默病的治疗方法，其包括给药敲除或敲低趋化因子受体的病毒，所述趋化因子受体包含CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7，XCR1和/或CX3CR1，优选为CCR2、CCR3、CCR4和/或CX3CR1，更优选CX3CR1。
9.根据权利要求8所述的治疗方法，其中给药方法包括静脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入途径给药，优选静脉内给药。
10.根据权利要求8或9的治疗方法，其中所述趋化因子受体为血液中单核细胞的趋化因子受体。
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