CN111785330B - 一种抗肥胖活性化合物的筛选方法 - Google Patents
一种抗肥胖活性化合物的筛选方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，包括以下步骤：首先基于3T3‑L1前脂肪细胞膜脂质筏主要成分及含量理论构建脂质筏代表体系并通过分子动力学软件对脂质筏体系进行非限制性分子动力学平衡；汇总不同结构多酚抑制前脂肪细胞分化的IC50值以及多酚分子结构参数和对脂质筏结构影响的数据；使用多元统计法建立不同结构多酚抑制前脂肪细胞分化的IC50值与不同结构多酚对脂质筏影响的理论关系式，寻找关键评价指标；最后基于关键评价指标通过聚类分析进行不同活性化合物的分类并通过实验进行验证。本发明所述筛选方法成本低，稳定性强，筛选结果可靠，配合分子动力学和多元统计法等，为高效快速寻找抗肥胖活性化合物提供便捷。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种抗肥胖活性化合物的筛选方法。
背景技术
肥胖和脂质代谢异常已成为当今全球普遍关注的健康问题，不仅影响人们的行为方式，此外还是糖尿病、心脑血管等疾病的重要诱因。研究显示，某些地区饮食如地中海(Mediterranean)饮食可有效降低心脑血管疾病发生的有益效果主要归因于饮食中富含大量的膳食因子。
细胞膜是介导外源物质进入或是保护细胞的屏障，在细胞的生命活动中起着至关重要的作用，由于细胞膜结构十分复杂且组成不均一，在细胞膜表面通过脂质-脂质相互作用、脂质-蛋白质相互作用等会形成不均一、高度动态的、富含胆固醇和鞘磷脂的极其有序的微域，被称为“脂质筏”。由于脂质筏上存在大量的调节细胞生长、分化等受体信号蛋白，介导着细胞内一系列信号通路，控制着细胞正常的生长、增殖、分化以及凋亡等，而且这些受体蛋白的活性依赖于脂质筏的完整结构，因而脂质筏也被看作是细胞内外信号传递平台。
研究显示，天然化合物具有数量庞大，结构多样，毒副作用小，药效确切可靠等优势，由此成为新药筛选的主要来源。但其成分复杂，作用机制不明确，使其成分分离与活性筛选费时费力。通常在完成繁琐且艰巨的分离提取、分析鉴定过程之后，含量较低的天然产物还需在动物、器官(组织)和细胞水平模型上进行筛选，现有技术的方法筛选成本高、所需样品量大、实验周期长，不适合进行大规模、高通量的筛选。多酚类化合物因其种类繁多，分布广泛，同时又具有降血脂，降血糖，减肥等多种作用，往往被视为优良的膳食因子并一直备受关注。正因为多酚类化合物种类繁多，通过传统实验进行筛选，工作量大，耗费时间，人力，物力和财力，且效率低，近些年来发展的计算机模拟技术结合可视化技术可以从新的角度阐释化合物相互作用的方式等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以细胞膜脂质筏为靶标的抗肥胖活性化合物的筛选方法，该筛选方法操作简单，成本低，能够准确快速筛选出高活性抗肥胖化合物。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，包括以下步骤：
(1)进行3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏体系的理论构建，并判断该体系是否达到平衡；
(2)实验测定不同结构多酚化合物抑制前脂肪细胞分化的IC50；
(3)进行多酚化合物分子结构参数的理论计算及不同结构多酚与脂质筏的分子动力学模拟；
(4)采用多元统计法建立不同结构多酚化合物抑制前脂肪细胞分化的IC50与不同结构多酚对脂质筏影响的理论关系式，所述理论关系式为Y＝238.32-16.93X1-24.00X5+84.44X11，R2＝0.94，其中，Y为多酚化合物的IC50，,X1为多酚分子与脂质筏形成的氢键个数，X5为多酚分子的疏水性，X11为多酚分子与胆固醇的距离；
(5)对不同活性多酚化合物进行分类：将步骤(4)获得的自变量X1、X5和X11输入到Statistical analysis system中，进行分类，以半偏R方为0.06将不同化合物分为三组，从上到下依次规定为高活性组(IC50<50μM)，中活性组(IC50:50-100μM)，低活性组(IC50>150μM)。
(6)对不同活性多酚化合物分类的验证，选择步骤(5)高活性组、中活性组、低活性物各组的2个多酚化合物验证不同结构多酚化合物活性大小与其对脂质筏破坏效应大小存在相关性；
(7)对本方法的验证，通过分子动力学模拟待测化合物与脂质筏体系在分子层面的相互作用，并分析其数据，通过将分子动力学模拟获得的数据代入到步骤(4)所获得的理论关系式中得到IC50预测值，并通过步骤(2)获得待测化合物IC50实验值，将IC50实验值与预测值进行相关性分析及偏差分析，其中二者的相关系数R＝0.97,标准偏差介于0-6之间。
在一些具体的实施方式中，步骤(1)所述3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏体系的理论构建基于3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏主要成分及含量构建。优选地，以胆固醇(CHOL)，鞘磷脂(PSM)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)摩尔比为2:1:1作为3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏的代表。
在一些具体的实施方式中，步骤(1)所述3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏体系的平衡是首先基于CHARMM-GUI中Membrane Builder模块构建3T3-L1细胞膜脂质筏代表体系，之后通过分子动力学软件Gromacs 5.1.4对脂质筏体系进行非限制性分子动力学模拟并分析平衡参数。优选地，采用CHARMM36描述分子力场，包括键长、键角、二面角、范德华力和静电相互作用；采用脂质筏体系均方涨落偏差，脂分子头基面积作为体系平衡判断标准。
在一些具体的实施方式中，步骤(2)所述实验测定不同结构多酚抑制前脂肪细胞分化的IC50通过以下方式进行：3T3-L1前脂肪细胞置于37℃，含5％的CO2的培养箱中培养，待细胞产生接触抑制2天后，采用胰岛素，地塞米松和异丁基甲基黄嘌呤诱导细胞分化，在细胞分化的不同阶段，分别加入不同浓度的不同结构多酚，于第8天检测细胞内脂肪的含量，计算其IC50值。优选地，细胞内脂肪含量的测定采用甘油三酯测定试剂盒。
在一些具体的实施方式中，步骤(3)所述多酚分子结构参数的理论计算首先采用CHEMDRAW 12.0画出不同结构多酚的二维结构，随后运用MM2 job进行三维结构空间优化，之后获得多酚分子结构参数。
在一些具体的实施方式中，步骤(3)所述不同结构多酚与脂质筏的分子动力学模拟是在平衡好的脂质筏上通过GROMACS命令将多酚分子添加到脂质筏上方不同位置，包括角落和正中心，并进行至少3次重复模拟，对平衡后的轨迹分析二者的相互作用。
在一些具体的实施方式中，步骤(4)所述多元统计法为逐步回归法。
在一些具体的实施方式中，步骤(5)采用聚类分析法进行不同活性化合物的分类。优选地，以半偏R方为0.06将不同化合物分为三组，从上到下依次规定为高活性组(IC50<50μM)，中等活性组(IC50:50-100μM)，低活性组(IC50>150μM)。
在一些具体的实施方式中，步骤(6)所述验证通过荧光探针DiIC16染色脂质筏，选择不同活性代表化合物，观察其对细胞膜脂质筏结构的影响，从而验证不同结构多酚活性大小与其对脂质筏破坏效应大小存在相关性。
在一些具体的实施方式中，步骤(7)所述对本方法验证是通过将模拟获得的数据代入到步骤(4)所获得的理论关系式中得到IC50预测值，并通过步骤(2)获得待测化合物IC50实验值，将IC50实验值与预测值进行相关性分析及偏差分析，其中二者的相关系数R＝0.97,标准偏差介于0-6之间。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的抗肥胖活性化合物筛选方法，通过3T3-L1前脂肪细胞成功分化为脂肪细胞需要完整的脂质筏结构为切入点，基于3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏主要成分及含量，理论构建脂质筏体系并在分子层面通过经典分子动力学模拟不同结构多酚对脂质筏的影响，然后采用聚类分析法进行不同活性化合物的分类并通过细胞实验进行验证。本发明的筛选方法成本低，稳定性强，筛选结果可靠，配合分子动力学和多元统计法等，多学科交叉为高效快速寻找抗肥胖活性化合物提供便捷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为理论构建的3T3-L1细胞膜脂质筏代表体系平衡参数随平衡时间变化的结果，其中，A为体系均方涨落偏差(RMSD)，B为脂分子头基面积的变化图；
图2为逐步回归方法在SAS中实现的程序代码和逐步回归结果；
图3为通过聚类分析关键评价指标进行不同活性化合物的分类图以及通过荧光探针DiIC16染色脂质筏验证推论的结果，其中，A为不同活性化合物的分类图，B为选择不同活性代表验证假设图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏体系的理论构建、平衡
依据3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏微域主要脂质成分及含量确定脂质筏代表体系中脂质组成与比例(CHOL:PSM:POPC＝2:1:1)，采用CHARMM-GUI中Membrane Builder模块构建脂质筏体系，通过分子动力学软件Gromacs 5.1.4对脂质筏体系进行非限制性分子动力学模拟，以体系均方涨落偏差(RMSD)，脂分子头基面积波动大小为脂质筏体系平衡判断标准，若二者上下波动小则表示体系平衡，若二者上下波动大则表示未达到平衡，需继续延长平衡时间。平衡后体系均方涨落偏差(RMSD)，脂分子头基面积见图1所示。如图1A所示，刚开始的几ns内，RMSD值上下波动较大，直到20ns以后，体系的RMSD值上下波动小于0.5纳米；此外体系内总脂分子头基面积(如图1B)围绕上下波动，综合而言，脂质筏体系在20ns以内快速的趋于平衡，随后稳定平衡状态直至结束。
实施例2：实验测定不同结构多酚抑制前脂肪细胞分化的IC50
3T3-L1前脂肪细胞用DMEM+10％小牛血清培养，置于37℃，含5％的CO2的培养箱中培养。细胞产生接触抑制2天后，采用胰岛素，地塞米松和异丁基甲基黄嘌呤诱导细胞分化。在细胞分化的不同阶段，分别加入不同浓度的不同结构多酚，于第8天检测细胞内脂肪的含量，并计算IC50值。汇总不同结构多酚的IC50值于表1。表1中化合物1：表儿茶素(EC)；化合物2：表没食子儿茶素(EGC)；化合物3：表儿茶素没食子酸酯(ECG)；化合物4:表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)；化合物5：A型连接EC二聚体(A-EC dimer)；化合物6：A型连接ECG二聚体(A-ECG dimer)；化合物7：A型连接EGCG二聚体(A-EGCGdimer)；化合物8：没食子酸(GA)；化合物9：三没食子酰-β-D-葡萄糖(TGG)；化合物10：五没食子酰-β-D-葡萄糖(PGG)；化合物11：:B型连接EC二聚体(B-EC dimer)；化合物12：:B型连接EC-ECG二聚体(B-EC-ECGdimer)；化合物13：:B型连接ECG二聚体(B-ECG dimer)；
表1
注：本表中距离单位:nm，其中“-”表示多酚分子插入脂质筏内部
实施例3：多酚分子结构参数的理论计算及不同结构多酚与脂质筏的分子动力学模拟
多酚分子结构的优化
采用CHEMDRAW 12.0画出不同结构多酚的2D结构，随后将2D结构导入到3D窗口中，运用3D窗口中的MM2 job进行进行三维结构空间优化，保存此PDB结构，用GAUSSIAN09W设置优化方法及参数，然后导入到GAUSSIAN09中对多酚结构进行进一步量化优化，待能量收敛后，可以得到精细优化后的不同结构多酚以及静电势文件，之后获得多酚分子结构参数。
不同结构多酚拓扑文件的构建
拓扑文件主要描述体系的组成及力场，其中力场用来描述体系中最小单元间的相互作用，是对实验性质或量子化学计算结果拟合后生成的经验式。力场在动力学模拟中起着至关重要的作用，力场是否合理直接关系到模拟是否能够正常进行以及最后的分析结果是否可靠。目前常用的分子动力学模拟力场主要包括两部分，键相互作用和非键相互作用。多酚类化合物的力场选择与CHARMM力场相兼容的Cgenff(CHARMM General Force Field)力场，将不同结构多酚的PDB文件上传到Cgenff server(https://cgenff.umaryland.edu)中以获得.str(CHARMM-compatible stream file)文件，然后基于python 2.7构建拓扑文件。
不同结构多酚与脂质筏的分子动力学模拟
准备好脂质筏和不同结构多酚的拓扑文件后，在平衡后的脂质筏上通过GROMACS命令将多酚分子添加到脂质筏上方不同位置(包括角落和正中心)，并进行至少3次重复模拟，每次100ns。每个体系用TIP3P水分子进行溶剂化，盒子大小在设定过程中确保多酚分子中的任何原子距离盒子边界至少为随后使用最陡下降法对体系进行能量最小化处理，并进一步对体系进行预平衡，首先是NVT(恒原子数目，恒容，恒温)系综进行升温，利用V-rescale控温方法保持恒定温度310K，耦合时间常数为0.5ps。接着对整个系统进行第二次平衡控压，采用NPT(恒原子数目，恒压，恒温)系综，压力保持在1个大气压，使用Parrinello-Rahamn控压器，耦合时间常数为5.0ps。周期性边界条件和PME(particle-meshEwald)方法用于体系的模拟中。之后进行伴随时间步长为2fs的正式100ns分子动力学模拟，模拟过程之中，温度和压力控制方法与以上系综条件保持一致，每2ps输出一次轨迹，选取平衡轨迹进行分析。不同结构多酚对脂质筏影响的数据于表1所示。
实施例4：多元统计法建立不同结构多酚抑制前脂肪细胞分化的IC50与不同结构多酚对脂质筏影响的理论关系式
将不同结构多酚抑制前脂肪细胞分化的IC50值和多酚分子结构参数(疏水性，体积，拓扑极性表面积)及与脂质筏形成的氢键，位置分布，径向分布数据输入到Statisticalanalysis system(SAS)，采用逐步回归方法建立回归方程，得到关键的评价指标：多酚分子与脂质筏形成的氢键(X1)，疏水性(X5)，多酚分子与胆固醇的距离(X11)。其中逐步回归方法在SAS中实现的程序代码及结果如图2所示。
实施例5：不同活性化合物的分类及假设验证。
不同活性化合物的分类
将关键评价指标：多酚分子与脂质筏形成的氢键(X1)，疏水性(X5)，胆固醇与鞘磷脂的径向分布(X9)，多酚分子与胆固醇的距离(X11)输入到Statistical analysis system(SAS)，采用聚类分析法进行分类，然后在每一个类中选择代表性化合物进行验证实验。聚类分析的结果如图3A所示。以半偏R方为0.06将不同化合物分为三组，从上到下依次规定为高活性组(IC50<50μM)，中等活性组(IC50:50-100μM)，低活性组(IC50>150μM)，之后在每组内选择EC,B-EC dimer为低活性代表多酚，ECG,B-EC-ECG dimer为中等活性代表多酚，A-ECGdimer,B-ECG dimer为高活性代表多酚进行后续的验证实验。
细胞膜脂质筏染色
3T3-L1细胞培养24h后，用50μM不同活性代表多酚或3mM甲基β环糊精(β-MCD)处理30min后，PBS清洗细胞，DiIC16在37℃下染色3min,0.5％预冷的Triton X-100冰上处理细胞30min,细胞经洗涤后，用4％的多聚甲醛固定15min，PBS洗涤细胞后，封片液封片后于激光共聚焦下观察。不同活性代表多酚处理后脂质筏荧光强度的变化如图3B所示。通过荧光染料荧光强度的变化反应脂质筏结构的变化，当脂质筏结构被破坏以后，荧光染料则不能标记脂质筏发出荧光，由图3B可以看出低活性组荧光强度与对照组(Control)无显著差异，中等活性组染料荧光强度与对照相(Control)相比显著下降(P<0.05)，但和阳性对照药物β-MCD相比无显著差异，而高活性组无论与对照组(Control)还是阳性对照药物组相比染料荧光强度均显著下降(P<0.05)，表明对脂质筏的破坏效应最大，综上数据可以验证基于细胞膜脂质筏破坏效应大小与活性大小相关的假设。
实施例6：本方法的验证
采用实施例3的步骤通过分子动力学模拟获得以下待测化合物对脂质筏影响的模拟数据，其中待测化合物1为茶黄素(TF-0)；化合物2为茶黄素-3'-没食子酸酯(TF-1)；化合物3为茶黄素-3，3'-双没食子酸酯(TF-2)；将模拟数据代入到实施例4构建的理论关系式中获得待测化合物的IC50预测值，并通过实施例2所述方法测定以下待测化合物抑制前脂肪细胞分化的IC50实验值，将IC50实验值与预测值进行相关性分析及偏差分析，其中二者的相关系数R＝0.97,标准偏差介于0-6之间，再次反映本方法可靠性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)进行3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏体系的理论构建，并判断该体系是否达到平衡；
(2)实验测定不同结构多酚化合物抑制前脂肪细胞分化的IC50；
(3)进行多酚化合物分子结构参数的理论计算及不同结构多酚与脂质筏的分子动力学模拟；
(4)采用多元统计法建立不同结构多酚化合物抑制前脂肪细胞分化的IC50与不同结构多酚对脂质筏影响的理论关系式，所述理论关系式为Y＝238.32-16.93X1-24.00X5+84.44X11，R2＝0.94，其中，Y为多酚化合物的IC50，X1为多酚分子与脂质筏形成的氢键个数，X5为多酚分子的疏水性，X11为多酚分子与胆固醇的距离；
(5)对不同活性多酚化合物进行分类：将步骤(4)获得的自变量X1、X5和X11输入到Statistical analysis system中，进行分类，以半偏R方为0.06将不同化合物分为三组，从上到下依次规定为高活性组，中活性组和低活性组，其中所述高活性组的IC50<50μM，中活性组的IC50:50-100μM，低活性组的IC50>150μM；
(6)对不同活性多酚化合物分类的验证，选择步骤(5)高活性组、中活性组、低活性物各组的2个多酚化合物验证不同结构多酚化合物活性大小与其对脂质筏破坏效应大小存在相关性；
(7)对本方法的验证，通过分子动力学模拟待测化合物与脂质筏体系在分子层面的相互作用，并分析其数据，将分子动力学模拟获得的数据代入到步骤(4)所获得的理论关系式中得到IC50预测值，并通过步骤(2)获得待测化合物IC50实验值，将IC50实验值与预测值进行相关性分析及偏差分析，其中二者的相关系数R＝0.97,标准偏差介于0-6之间；
步骤(1)所述3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏体系的理论构建基于3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏主要成分胆固醇，鞘磷脂，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱摩尔比为2:1:1构建；
步骤(1)所述3T3-L1前脂肪细胞膜脂质筏体系的平衡通过分子动力学软件Gromacs5.1.4对脂质筏体系进行非限制性分子动力学模拟100ns并分析平衡参数。
2.根据权利要求1所述的一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，其特征在于，所述平衡参数为脂质筏体系均方涨落偏差，脂分子头基面积。
3.根据权利要求1所述的一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述实验测定不同结构多酚抑制前脂肪细胞分化的IC50通过以下方式进行：3T3-L1前脂肪细胞置于37℃，含5％的CO2的培养箱中培养，待细胞产生接触抑制2天后，采用胰岛素，地塞米松和异丁基甲基黄嘌呤诱导细胞分化，在细胞分化的不同阶段，分别加入不同浓度的不同结构多酚，于第8天检测细胞内脂肪的含量，计算其IC50值。
4.根据权利要求1所述的一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述多酚分子结构参数的理论计算首先采用CHEMDRAW 12.0画出不同结构多酚的二维结构，随后运用MM2 job进行三维结构空间优化，之后获得多酚分子结构参数：多酚的疏水性，拓扑极性表面积，体积及氢键受体个数。
5.根据权利要求1所述的一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述不同结构多酚与脂质筏的分子动力学模拟是在平衡好的脂质筏上通过GROMACS命令将多酚分子添加到脂质筏上方不同位置，包括角落和正中心，并进行至少3次100ns重复模拟，对平衡后的轨迹分析二者的相互作用，包括不同结构多酚分子与脂质筏及其各成分形成的平均氢键个数,胆固醇与鞘磷脂的径向分布，多酚分子与脂质筏磷原子的距离，多酚分子与胆固醇的距离。
6.根据权利要求1所述的一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，其特征在于，步骤(4)所述多元统计法为逐步回归法。
7.根据权利要求1所述的一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，其特征在于，步骤(5)采用聚类分析法进行不同活性化合物的分类。
8.根据权利要求1所述的一种抗肥胖活性化合物的筛选方法，其特征在于，步骤(6)所述验证通过荧光探针DiIC16染色脂质筏，选择不同活性代表化合物，观察其对细胞膜脂质筏结构的影响，从而验证不同结构多酚活性大小与其对脂质筏破坏效应大小存在相关性。
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| 柿单宁特征结构单元基于细胞膜脂质筏受体抑制前脂肪细胞3T3-L1分化的分子机制;朱维;华中农业大学博士学位论文;全文 * |
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