CN111781181A - 一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法 - Google Patents
一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111781181A CN111781181A CN202010678008.9A CN202010678008A CN111781181A CN 111781181 A CN111781181 A CN 111781181A CN 202010678008 A CN202010678008 A CN 202010678008A CN 111781181 A CN111781181 A CN 111781181A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- porous silicon
- bragg reflector
- dna
- light
- biosensor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229910021426 porous silicon Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 101
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 6
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910021421 monocrystalline silicon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 claims description 4
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 3
- 238000000866 electrolytic etching Methods 0.000 claims description 3
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 abstract description 16
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000376 reactant Substances 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 abstract description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical compound [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明公开了一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法。第一个信号光是从多孔硅布拉格反射镜表面反射的波长为635nm的探测光。生物探针用半导体量子点标记后与目标分子在多孔硅布拉格反射镜内进行反应，半导体量子点起折射率放大的作用。生物分子在多孔硅布拉格反射镜内发生特异性结合引起了器件折射率增大而导致探测反射光的增强。第二个信号光是生物反应物中量子点的荧光。反应物中的量子点在短波长光激发下，产生波长约为630nm的荧光。荧光信号由多孔硅布拉格反射镜进一步增强。用数字显微镜同时获得多孔硅布拉格反射镜表面两种光叠加的图像，通过计算生物反应前后图像的平均灰度值变化，可高灵敏的检测目标生物分子。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，具体领域为一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法。
背景技术
多孔硅是一种具有比表面积大、生物活性好、生物相容性好且室温下可发光等优点的纳米结构材料，可被制备成为各类光学结构的器件，能够增强和放大光信号，应用在各类光学生物传感器中，如微腔传感器、布拉格反射镜传感器、光栅耦合波导传感器等。
多孔硅光学生物传感器检测机理主要有两类，第一类是对生物反应引起的折射率变化进行检测的，获取发生生物反应前后多孔硅生物传感器的折射率变化，进而根据折射率变化确定生物分子浓度。第二类是对生物反应引起的荧光变化进行检测，检测生物分子荧光标记变化，进而荧光标记变化确定生物分子浓度。为了进一步提高多孔硅光学生物传感器的检测灵敏度，人们引入了半导体胶体量子点。半导体胶体量子点具有很好的光稳定性，荧光寿命长，可控的表面特性等优点，表面修饰后具有良好的生物兼容性。在第一类方法中，通过量子点标记生物分子探针，放大了生物反应引起的折射率变化。在第二类方法中，将量子点作为荧光标记物标记生物分子探针。
数字图像法被用于多孔硅生物传感器对生物分子或生物芯片的检测中，解决了基于折射率变化检测中利用角度谱法进行生物检测时其检测灵敏度受限的问题，以未发生生物反应的单元图像为定标参照，可消除探测激光和光检测器不稳定造成的测量误差。
因此，提供一种将基于折射率变化和基于荧光变化两种多孔硅光学生物传感器检测方法与数字图像法相结合的检测方法，能够实施成本低且灵敏度高的生物检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，包括以下具体步骤：
S1：使用P型单晶硅，硅片切成小片，拟制备的多孔硅区域为圆形，通过单槽阳极电化学腐蚀法制备多孔硅布拉格反射镜；
S2：制备好的多孔硅布拉格反射镜将其浸泡在过氧化氢溶液中进行氧化，使其表面形成一层SiO2层；取出用去离子水和无水乙醇反复冲洗，放置在室温下降温；然后将氧化后的样品放3-氨基丙基三乙氧基硅烷中浸泡，使样品形成氨基；取出后用去离子水和乙醇反复冲洗干净，室温下吹干后放入真空干燥箱中；取出后将硅烷化后的多孔硅样品浸入到戊二醛的水溶液中浸泡；取出后用磷酸缓冲液和去离子水反复冲洗，以除去多余戊二醛；
S3：用PBS将目标DNA稀释六个浓度，用6种不同浓度的目标DNA修饰多孔硅样品；放入恒温箱中，取出后用PBS冲洗，冲去未连接到多孔硅样品的多余DNA，在N2中干燥；再放入乙醇胺盐酸盐溶液中浸泡；放入恒温箱中，取出后用HEPES缓冲液彻底冲洗；
S4：使用微量移液器取量子点滴入微量离心管中，再加入PBS，搅拌后，加入EDC和sulfo-NHS对量子点活化，震荡反应，加入氨基修饰的探针DNA，避光震荡反应；取出后在离心机中离心，去上清留沉淀；
S5：用微量移液器取量子点偶联探针DNA的溶液滴加到已经连接不同浓度目标DNA分子的多孔硅表面，恒温反应，使DNA杂交，然后取出用PBS和DI反复冲洗去除过量的DNA和QDs，在N2中干燥；
S6：将多孔硅样品连接至多孔硅布拉格生物传感器的检测光路中，探测光的反射光和激发光激发出多孔硅样品的荧光，同时通过滤波器进入到数字显微镜；
S7：用数字显微镜获得6种不同浓度的DNA与量子点偶联的探针DNA发生生物反应前后的数字图像，并计算6种不同浓度的DNA与量子点偶联的探针DNA发生生物反应前后的数字图像的平均灰度值；
S8：通过计算生物反应前后的平均灰度值变化量来计算待测生物分子的浓度。
优选的，在S1中P型单晶硅的电阻率为0.01-0.06Ω·cm，晶向为<100>，厚度为400±10μm；硅片切成1.5×1.5cm的小片；多孔硅区域圆形的直径为0.8cm；单槽阳极电化学腐蚀法中电解腐蚀液是由体积比为1：1的氢氟酸浓度为40％和无水乙醇浓度≥99％配置而成；电化学腐蚀多孔硅布拉格反射镜时的电流密度为40mA/cm2、110mA/cm2对应的腐蚀时间为1.1s、0.9s。
优选的，在S2中的多孔硅布拉格反射镜放在30％过氧化氢溶液60℃环境下进行氧化3h；3-氨基丙基三乙氧基硅烷的浓度为5％，其组成为氨基丙基三乙氧基硅烷：甲醇：去离子水＝1：10：10，浸泡时间为1h；真空干燥箱中的内部温度为100℃，干燥时间为10min；硅烷化后的多孔硅样品浸入到戊二醛的水溶液的浓度为2.5％，浸泡时间为1h。
优选的，在S3中两个恒温箱的内部温度为37℃，前者恒温箱的工作时间为2h，后者恒温箱的工作时间为1h。
优选的，在S4中量子点的量为50μL，8μM；微量离心管选用1.5ml规格；PBS的加入量为340uL；搅拌时间为5min；EDC的加入量为30μL，0.01M；sulfo-NHS的加入量为30μL，0.01M；震荡反应时间为10min；氨基修饰的探针DNA的浓度为10μM，加入量为200μL；避光震荡反应时间为10h；离心机的参数为10000r/min，离心时间为10min。
优选的，在S5中量子点偶联探针DNA的溶液的量为50μL；恒温反应的温度为37℃时间为2h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，首先采用电化学腐蚀法制备出多孔硅布拉格反射镜，依次经过热氧化处理、硅烷化处理、戊二醛处理，用羧基水溶性CdSe/ZnS量子点标记生物探针后与目标分子在多孔硅布拉格反射镜内进行反应，再以波长为635nm的红光半导体激光器作为探测光源，以波长为375nm的紫外半导体激光器作为激发光源，反应物中的量子点在布拉格结构的多孔硅孔洞中被激发产生荧光，通过布拉格反射镜使荧光信号得到增强，生物分子在多孔硅内部发生生物反应后，反射光增强，用数字显微镜获得多孔硅布拉格反射镜表面两种光叠加的图像生物反应前后的数字图像，通过计算生物反应前后数字图像的平均灰度值变化来检测出目标生物分子的浓度。
附图说明
图1为本发明中理论仿真布拉格反射镜有效折射率增加0.005、0.01、0.02后的反射谱图；
图2为本发明中理论仿真反射率变化量随布拉格反射镜有效折射率变化的图谱；
图3为本发明中理论仿真多孔硅布拉格反射镜入射角度为0°、5°、10°的反射谱图；
图4为本发明中多孔硅布拉格生物传感器的检测光路。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，包括以下具体步骤：
S1：使用P型单晶硅(电阻率为0.01-0.06Ω·cm，晶向为<100>，厚度为400±10μm)，硅片切成1.5×1.5cm的小片，拟制备的多孔硅区域为圆形，直径为0.8cm。通过单槽阳极电化学腐蚀法制备多孔硅布拉格反射镜，电解腐蚀液是由体积比为1：1的氢氟酸(浓度为40％)和无水乙醇(C2H5OH，浓度≥99％)配置。电化学腐蚀多孔硅布拉格反射镜时的电流密度为40mA/cm2、110mA/cm2对应的腐蚀时间为1.1s、0.9s。
S2：制备好的多孔硅布拉格反射镜将其浸泡在30％过氧化氢溶液中，放在60℃环境下进行氧化3h，使其表面形成一层SiO2层，取出用去离子水和无水乙醇反复冲洗，放置在室温下降温。然后将氧化后的样品放5％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(氨基丙基三乙氧基硅烷：甲醇：去离子水＝1：10：10)，浸泡时间为1h，使样品形成氨基，取出后用去离子水和乙醇反复冲洗干净，室温下吹干后放入100℃的真空干燥箱中10min。将硅烷化后的多孔硅样品浸入到2.5％戊二醛的水溶液中1h，取出后用磷酸缓冲液(PBS)和去离子水反复冲洗，以除去多余戊二醛。
S3：用PBS将目标DNA稀释六个浓度，用6种不同浓度的目标DNA修饰多孔硅样品，放入37℃恒温箱中2h，取出后用PBS冲洗，冲去未连接到多孔硅样品的多余DNA，在N2中干燥。再放入浓度为3M乙醇胺盐酸盐溶液中浸泡，放入37℃恒温箱中1h，取出后用HEPES(PH9)缓冲液彻底冲洗。
S4：使用微量移液器取50μL，8μM的量子点滴入1.5mL的微量离心管中，再加入340uL的PBS，搅拌5min后，加入30μL，0.01M的EDC和30μL，0.01Msulfo-NHS对量子点活化，震荡反应10min，量子点的最终浓度为1μM。加入200μL浓度为10μM氨基修饰的探针DNA，避光震荡反应10h。取出后在10000r/min离心机中离心10min，去上清留沉淀。
S5：用微量移液器取50μL的量子点偶联探针DNA的溶液滴加到已经连接不同浓度目标DNA分子的多孔硅表面，37℃恒温反应2h，使DNA杂交，然后取出用PBS和DI反复冲洗去除过量的DNA和QDs，在N2中干燥。
S6：将多孔硅样品连接至图4多孔硅布拉格生物传感器的检测光路中，激光器1为375nm的半导体激光器，M1为平面镜，透镜L1和L2构成准直扩束系统，BS1为半反半透镜，激光器2为635nm的半导体激光器，M2为平面镜，透镜L3和L4构成准直扩束系统，BS2为半反半透镜，G为测角仪，L5为600nm长通滤波片。探测光的反射光和激发光激发出多孔硅样品的荧光，同时通过滤波器进入到数字显微镜。
S7：用数字显微镜获得6种不同浓度的DNA与量子点偶联的探针DNA发生生物反应前后的数字图像，并计算6种不同浓度的DNA与量子点偶联的探针DNA发生生物反应前后的数字图像的平均灰度值；
S8：通过计算生物反应前后的平均灰度值变化量来计算待测生物分子的浓度。
第一个信号光是从多孔硅布拉格反射镜表面反射的波长为635nm的探测光。生物探针用半导体量子点标记后与目标分子在多孔硅布拉格反射镜内进行反应，半导体量子点起折射率放大的作用。由于生物分子在多孔硅布拉格反射镜内发生特异性结合引起了器件折射率增大而导致探测反射光的增强。第二个信号光是生物反应物中量子点的荧光。反应物中的量子点在短波长光激发下，产生波长约为630nm的荧光。荧光信号由多孔硅布拉格反射镜进一步增强。用数字显微镜同时获得多孔硅布拉格反射镜表面两种光叠加的图像，通过计算生物反应前后图像的平均灰度值变化，可高灵敏的检测目标生物分子。
假设多孔硅布拉格反射镜的高折射率层的折射率为1.42，厚度为98nm，低折射率层的折射率为1.12，厚度为124nm。通过转移矩阵法计算多孔硅布拉格反射镜中心波长为556nm，如图1的黑线所示。
半导体激光器垂直入射到多孔硅布拉格反射镜表面，使反射光光强最小。加入生物分子后，也就是增大多孔硅布拉格反射镜每一层的折射率后，光谱会整体向右移动，图1所示的折射率增加0.005、0.01和0.02后的反射谱。图2给出了由理论计算得出的多孔硅布拉格反射镜表面反射率随器件有效折射率变化的关系。
进一步的，制备好的多孔硅布拉格反射镜如果经过热氧化处理、硅烷化处理、戊二醛处理、加入目标生物分子、加入用半导体量子点标记的生物探针后，由于器件有效折射率的增大，多孔硅布拉格反射镜光子禁带边缘处最弱光强所对应的波长大于635nm，可采用改变入射角度的方法，使反射谱发生蓝移，多孔硅布拉格反射镜光子禁带边缘处反射率最小的位置正好位于635nm处。图3给出了入射角度为0°、5°、10°的反射谱。
进一步的，本发明采用波长为635nm的半导体激光器产生探测光和波长为375nm的半导体激光器产生激发光，作为激发反应物中的量子点。之所以使用半导体激光器是因为其具有体积小，重量轻，使用寿命长，便于携带等优点，能够更好地用于开发实际的生物检测产品中。
进一步的，探测反射光的增强，是因为用半导体量子点标记的生物探针与目标分子在多孔硅内部发生生物反应导致多孔硅布拉格反射镜器件的有效折射率增大，多孔硅布拉格反射镜的反射谱红移，原处于禁带边缘635nm处反射率最低，现因反射谱红移，635nm处的反射率增加，其反射光增强。
进一步的，荧光信号由多孔硅布拉格反射镜进一步增强，是因为生物反应之前多孔硅布拉格反射镜没有荧光，发生生物反应后，反应物中的量子点在布拉格结构的多孔硅孔洞中被激发产生荧光，多孔硅布拉格反射镜可以将落在其高反射带的荧光进行反射，使其向下发射的荧光反射成向上发射的荧光，则荧光通过多孔硅布拉格反射镜得到增强。
进一步的，用数字显微镜同时获得多孔硅布拉格反射镜表面两种光叠加的图像，通过计算生物反应前后图像的平均灰度值变化来检测目标生物分子。
本发明提出的一种多孔硅布拉格生物传感器的检测方法，快速、高效、检测灵敏度高、检测成本低，只需用到数字显微镜和一般的光学器件。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，其特征在于：包括以下具体步骤：
S1：使用P型单晶硅，硅片切成小片，拟制备的多孔硅区域为圆形，通过单槽阳极电化学腐蚀法制备多孔硅布拉格反射镜；
S2：制备好的多孔硅布拉格反射镜将其浸泡在过氧化氢溶液中进行氧化，使其表面形成一层SiO2层；取出用去离子水和无水乙醇反复冲洗，放置在室温下降温；然后将氧化后的样品放3-氨基丙基三乙氧基硅烷中浸泡，使样品形成氨基；取出后用去离子水和无水乙醇反复冲洗干净，室温下吹干后放入真空干燥箱中；取出后将硅烷化后的多孔硅样品浸入到戊二醛的水溶液中浸泡；取出后用磷酸缓冲液和去离子水反复冲洗，以除去多余戊二醛；
S3：用PBS将目标DNA稀释六个浓度，用6种不同浓度的目标DNA修饰多孔硅样品；放入恒温箱中，取出后用PBS冲洗，冲去未连接到多孔硅样品的多余DNA，在N2中干燥；再放入乙醇胺盐酸盐溶液中浸泡；放入恒温箱中，取出后用HEPES缓冲液彻底冲洗；
S4：使用微量移液器取量子点滴入微量离心管中，再加入PBS，搅拌后，加入EDC和sulfo-NHS对量子点活化，震荡反应，加入氨基修饰的探针DNA，避光震荡反应；取出后在离心机中离心，去上清留沉淀；
S5：用微量移液器取量子点偶联探针DNA的溶液滴加到已经连接不同浓度目标DNA分子的多孔硅表面，恒温反应，使DNA杂交，然后取出用PBS和DI反复冲洗去除过量的DNA和QDs，在N2中干燥；
S6：将多孔硅样品连接至多孔硅布拉格生物传感器的检测光路中，探测光的反射光和激发光激发出多孔硅样品的荧光，同时通过滤波器进入到数字显微镜；
S7：用数字显微镜获得6种不同浓度的DNA与量子点偶联的探针DNA发生生物反应前后的数字图像，并计算6种不同浓度的DNA与量子点偶联的探针DNA发生生物反应前后的数字图像的平均灰度值；
S8：通过计算生物反应前后的平均灰度值变化量来计算待测生物分子的浓度。
2.根据权利要求1的一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，其特征在于：在S1中P型单晶硅的电阻率为0.01-0.06Ω·cm，晶向为<100>，厚度为400±10μm；硅片切成1.5×1.5cm的小片；多孔硅区域圆形的直径为0.8cm；单槽阳极电化学腐蚀法中电解腐蚀液是由体积比为1：1的氢氟酸浓度为40％和无水乙醇浓度≥99％配置而成；电化学腐蚀多孔硅布拉格反射镜时的电流密度为40mA/cm2、110mA/cm2对应的腐蚀时间为1.1s、0.9s。
3.根据权利要求2的一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，其特征在于：在S2中的多孔硅布拉格反射镜放在30％过氧化氢溶液60℃环境下进行氧化3h；3-氨基丙基三乙氧基硅烷的浓度为5％，其组成为氨基丙基三乙氧基硅烷：甲醇：去离子水＝1：10：10，浸泡时间为1h；真空干燥箱中的内部温度为100℃，干燥时间为10min；硅烷化后的多孔硅样品浸入到戊二醛的水溶液的浓度为2.5％，浸泡时间为1h。
4.根据权利要求3的一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，其特征在于：在S3中两个恒温箱的内部温度为37℃，前者恒温箱的工作时间为2h，后者恒温箱的工作时间为1h。
5.根据权利要求4的一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，其特征在于：在S4中量子点的量为50μL，8μM；微量离心管选用1.5ml规格；PBS的加入量为340uL；搅拌时间为5min；EDC的加入量为30μL，0.01M；sulfo-NHS的加入量为30μL，0.01M；震荡反应时间为10min；氨基修饰的探针DNA的浓度为10μM，加入量为200μL；避光震荡反应时间为10h；离心机的参数为10000r/min，离心时间为10min。
6.根据权利要求5的一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法，其特征在于：在S5中量子点偶联探针DNA的溶液的量为50μL；恒温反应的温度为37℃时间为2h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010678008.9A CN111781181B (zh) | 2020-07-15 | 一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010678008.9A CN111781181B (zh) | 2020-07-15 | 一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111781181A true CN111781181A (zh) | 2020-10-16 |
| CN111781181B CN111781181B (zh) | 2024-06-21 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104034693A (zh) * | 2014-05-08 | 2014-09-10 | 新疆大学 | 一种基于反射光强的多孔硅微腔生物传感器检测生物分子的方法 |
| CN106442438A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-02-22 | 新疆大学 | 一种基于多孔硅的荧光生物传感器基底材料的制备方法 |
| CN107064489A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-08-18 | 新疆大学 | 一种基于多孔硅/量子点的荧光生物传感器基底材料的制备方法 |
| CN107167592A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-09-15 | 新疆大学 | 一种多孔硅光子晶体生物检测方法 |
| CN108931510A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-12-04 | 新疆大学 | 多孔硅荧光生物传感器的检测方法 |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104034693A (zh) * | 2014-05-08 | 2014-09-10 | 新疆大学 | 一种基于反射光强的多孔硅微腔生物传感器检测生物分子的方法 |
| CN106442438A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-02-22 | 新疆大学 | 一种基于多孔硅的荧光生物传感器基底材料的制备方法 |
| CN107064489A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-08-18 | 新疆大学 | 一种基于多孔硅/量子点的荧光生物传感器基底材料的制备方法 |
| CN107167592A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-09-15 | 新疆大学 | 一种多孔硅光子晶体生物检测方法 |
| CN108931510A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-12-04 | 新疆大学 | 多孔硅荧光生物传感器的检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dıaz et al. | Sol–gel horseradish peroxidase biosensor for hydrogen peroxide detection by chemiluminescence | |
| Attridge et al. | Sensitivity enhancement of optical immunosensors by the use of a surface plasmon resonance fluoroimmunoassay | |
| US7387892B2 (en) | Biosensor using microdisk laser | |
| US8920729B2 (en) | Porous membrane waveguide sensors and sensing systems therefrom for detecting biological or chemical targets | |
| US7768640B2 (en) | Fluorescence detection enhancement using photonic crystal extraction | |
| Bras et al. | Optimisation of a silicon/silicon dioxide substrate for a fluorescence DNA microarray | |
| US7319046B2 (en) | Integrated optoelectronic silicon biosensor for the detection of biomolecules labeled with chromophore groups or nanoparticles | |
| JP5588454B2 (ja) | 分析物検出アッセイ | |
| JP2010518389A (ja) | エバネセント導波管及び集積センサを用いるバイオセンサ | |
| Ramos et al. | Enhanced chemiluminescence biosensor for the determination of phenolic compounds and hydrogen peroxide | |
| De Goede et al. | Al 2 O 3 microring resonators for the detection of a cancer biomarker in undiluted urine | |
| Wei et al. | Detection using a quantum dots/porous silicon optical biosensor based on digital fluorescence images | |
| Zhang et al. | Biological detection based on the transmitted light image from a porous silicon microcavity | |
| EP2224241B1 (en) | Carrier for use in measurement of analyte, and method for production thereof | |
| CN111781181A (zh) | 一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法 | |
| CN111781181B (zh) | 一种多孔硅布拉格反射镜生物传感器的检测方法 | |
| Osborn et al. | Mo 6 Cl 12-incorporated sol-gel for oxygen sensing applications | |
| JP2009128136A (ja) | 蛍光検出方法 | |
| Podbielska et al. | Sol-gels for optical sensors | |
| Hungerford et al. | Use of fluorescence to monitor the incorporation of horseradish peroxidase into a sol–gel derived medium | |
| Mishra et al. | Dengue NS1 detection used chemically modified porous silicon microcavity (psmc) | |
| Yang et al. | Digital image biological detection technology based on the porous silicon periodic crystals film | |
| Zhang et al. | Research on biological detection based on reflected light images of a porous silicon Bragg mirror | |
| CN116087160A (zh) | 一种多孔硅微腔生物传感器及其制备方法、赤霉素的荧光图像检测方法 | |
| CN111896498B (zh) | 一种多孔硅拼装式微腔生物传感器的应用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |