CN111766354A - 一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法 - Google Patents

一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111766354A
CN111766354A CN202010257281.4A CN202010257281A CN111766354A CN 111766354 A CN111766354 A CN 111766354A CN 202010257281 A CN202010257281 A CN 202010257281A CN 111766354 A CN111766354 A CN 111766354A
Authority
CN
China
Prior art keywords
meat
zebra fish
group
safety
control group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010257281.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111766354B (zh
Inventor
戴明珠
俞航萍
陆夏逸
李红群
沈锡明
李春启
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Xinhuan Detection Technology Co ltd
HANGZHOU HUNTER BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
Nanjing Xinhuan Detection Technology Co ltd
HANGZHOU HUNTER BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Xinhuan Detection Technology Co ltd, HANGZHOU HUNTER BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical Nanjing Xinhuan Detection Technology Co ltd
Publication of CN111766354A publication Critical patent/CN111766354A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111766354B publication Critical patent/CN111766354B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/12—Meat; Fish
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法，先用仿生消化、提取前处理肉制品得到肉样提取液，再通过确定肉样提取液的处理时间为24h、肉样提取液的处理浓度为1.4～5.6mg/mL来构建斑马鱼模型，并评价肉制品的安全性。本发明构建的斑马鱼模型及肉制品安全性评价的方法，检测准确度高，检测方法科学合理，造模周期短使得检测成本大大降低，为向广大民众、企业、政府普及推广该检测方法提供了现实可行性。

Description

一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法
技术领域
本发明涉及肉制品安全性评价的技术领域，具体涉及一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法。
背景技术
肉制品是人们日常生活中必不可缺的消费性食品，如鸡、鸭、鱼、猪、牛、羊等动物的肉制品，大多来源于养殖。随着居民对日制品需求量的与日俱增，受经济利益驱使，养殖业中兽药(包括抗生素及其半合成品、化学合成药物及其他添加剂)滥用的现象也愈演愈烈，导致兽药在动物源食品中的残留含量超标；有些不法养殖商，甚至用各种掺假手段制造“合成肉”来谋取暴利，“合成肉”的口感近似甚至优于养殖动物的肉制品，但由于不明物质的大肆添加，使得食用的危险性更高。种种怪象，导致肉制品的食品安全问题日趋尖锐，对食品安全的检测呼声也愈加强烈。
根据《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验部分》，目前食品安全检测的项目主要分为三大类：一类是药残留(包括农药、兽药、饲料添加剂、食品添加剂等在内)，一类是重金属，另外一类是致病性寄生虫、微生物、生物毒素。当前的食品安全检测项目基本上都是理化检验和生化检验，检测指标机械化、与生物体关联性差，有着不可忽视的缺陷：1)由于多种化学品之间的相互作用也可能使得残留量低于标准值的化学品对人体产生危害，所以有害物质的残留量在标准值以下是否就对人体绝对安全，存在不确定性。2)现有的检测体系只检测列入检测标准的已知有害物质，无法检测未列入检测标准或未知的有害物质，我们无法判断和预防食品中毒性不明物质可能带来的危害。
此外，国家相关标准滞后更新，也是造成现有的肉制品检测发展受限的主要原因所在。2002年农业部公告第235号《动物性食品中兽药最大残留限量》标准，时隔18年后，才确定将于2020年4月1日起实施的《食品安全国家标准——食品中兽药最大残留限量》，对食品中的兽药残留品种进行了补充完善。即将实施的食品安全国家标准中，动物性食品中最大残留限量规定的兽药有104种；允许用于食品动物、但不需要制定残留限量的兽药有154种；允许作治疗用、但不得在动物性食品中检出的兽药有9种。与2002年农业部公告第235号的标准相比，新标准规定的兽药品种增加76种、增幅39.8％，残留豁免品种增加66种、增幅75％，残留限量增加643项、增幅41.5％，改善了当前评价动物性食品“限量标准不全”的问题。
基于上述市场现状和检测技术现状，如何开发出一种能够准确评价肉制品安全性的方法，是现有的检测技术痛点。而建立更具拓展性、开放性和预测性的生物学检测手段，作为传统的化学手段检测肉制品安全性的补充完善，形成更高一级肉制品安全防线，意义重大。
申请人经检索发现，现有的文献研究多基于化学成分、微生物指标来判断肉制品的安全性，如公开号为CN 106442494A的中国发明专利，公开了一种肉制品中组胺快速检测方法，通过对肉制品中的组胺含量进行测定，来判断待测样品中的组胺是否过量，引起炎症反应。又如公开号为CN 101196463A的中国发明专利，公开了一种动物源性成分的鉴别方法，通过提取待鉴别动物源性样品DNA，PCR检测和凝胶电泳，来鉴别动物源性样品的成分。又如田建军等学者发表的文献《应用Illumina MiSeq测序技术比较风干肉中细菌多样性和微生物安全性》中，采用Illumina MiSeq高通量测序技术，分析风干肉制品中细菌16S rRNAV4区基因序列，进而比较不同风干肉微生物的群落结构组成及多样性差异，以判断肉类产品中的微生物指标是否合规。前述专利或文献存在共性的技术不足之处：
1)无法检测不同化学物质对人体的协同毒性。不同化学品由于理化性质不知，相互作用时能否产生协同增效，抑或协同减效，存在不确定性；导致判断待测样品协同毒性的难度更大于单一有毒物质的毒性。
2)无法检测不明添加物，只能检测已知的化学物质。倘若有已知化学物质的类似物、衍生物及其在人体内的代谢产物等作为不明添加物，则很难检测。
3)有毒物质种类繁多，从时间、人力、物力等成本因素考虑，无法面面俱到，做到全检。
斑马鱼与人类基因同源性高达85％，由于基因组与蛋白质组与人类具有很高的相似性，因此疾病的发病机制和信号传导通路等方面与人类基本近似，且生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似。与其他实验动物相比，斑马鱼还具有胚胎及幼鱼身体透明(可在体直接用肉眼和解剖显微镜观察各器官的发育过程)、体积小(可用微孔板分析)、发育周期短、体外受精、繁殖能力强、单次产卵数较高等特点(Zon LI,Peterson RT.In vivo drugdiscovery in the zebrafish[J].Drug Discovery,2005,4:35-44.)。模式生物斑马鱼近年来已成为研究人类疾病模型之一，既具有体外实验快速、高效、低廉、用药量小等优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高、可观察多个器官等优点，在化合物安全性评价中得到广泛应用(Barros T P,Alderton W K,et al.Zebrafish:An emerging technologyfor in vivo pharmacological assessment to identify potential safetyliabilities in early drug discovery[J].British Journal of Pharmacology,2008,154:1400-1413.)。
因此，申请人考虑采用斑马鱼模型，进行整体生物学评价，通过观察斑马鱼的体内状态，来判断肉制品的安全性，肉制品既可以包含单个已知或未知的化学成分，也可以包含多个已知或未知的化学成分组成的混合物。
经检索文献，发现目前应用斑马鱼模型进行安全性评价的，评价对象都是药品、化妆品，鲜见评价肉制品。而且，用斑马鱼评价药品或化妆品的安全性，其评价标准是依据经济合作与发展组织(简称：经合组织，OECD)规定的鱼类急性毒性试验标准(Test GuidelineNO.203：Fish,Acute Toxicity Testing.2019)。众所周知，由于药品、化妆品中所含的物质成分、理化性质都迥异于肉制品，故OECD标准中所述的检测方法能否套用于检测肉制品的安全性，存在不确定性。
综上所述，如何提供一种适宜的用斑马鱼评价肉制品安全性的方法，为人们放心食用肉制品提供安全保障，为供货商放心生产的肉制品提供质控保障，为监管机构放心监督肉制品在生产、流通环节的安全问题提供技术保障，是本领域技术人员尚未解决的技术难题；对于用生物学手段检测肉制品的检测标准的设立，也是一大技术挑战。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种全新的用斑马鱼评价肉制品安全性的方法，能够科学、准确的评价肉制品能否安全食用，为广大消费者、供货商、监管机构提供技术便利，解决了上述现有技术存在的不足。
为此，本发明采取了以下技术方案：
一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法，先用仿生消化、提取前处理肉制品得到肉样提取液，再通过确定肉样提取液的处理时间为24h、肉样提取液的处理浓度为1.4～5.6mg/mL来构建斑马鱼模型，并评价肉制品的安全性。
优选的，一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法，包括如下步骤：
(1)肉制品的前处理
取均质化的肉制品样品，加入按比例调配好的模拟胃液，涡旋，调节溶液pH至酸性环境，再涡旋、超声处理后，恒温条件下仿生消化；
在仿生消化后的肉样溶液中加入乙腈，高速离心，取上清液，氮吹至干；定容，调节溶液pH至中性环境，得肉样提取液，备存；
(2)确定肉样提取液的处理时间
取野生型AB品系斑马鱼胚胎置于微孔板中，设如下实验组：正常对照组和肉样组，其中肉样组中，每孔以水溶方式加入同一成分、同一浓度的肉样提取液；正常对照组中，每孔加入与肉样组等体积的养鱼用水；处理一定时间后，观察各实验组的斑马鱼胚胎死亡情况，计算死亡率；并结合水质中pH、硬度和NO2-的检测情况，判断并确定适宜的肉样提取液的处理时间；
其中，肉样提取液的最佳处理时间为24h；
(3)确定肉样提取液的处理浓度
取野生型AB品系斑马鱼胚胎置于微孔板中，设如下实验组：正常对照组和肉样组，其中肉样组中，每孔以水溶方式加入同一成分、不同浓度的肉样提取液；正常对照组中，每孔加入与肉样组等体积的养鱼用水；处理24h后，观察各实验组的斑马鱼胚胎死亡情况，计算死亡率，判断并确定适宜的肉样提取液的处理浓度；
其中，肉样提取液的最佳处理浓度为1.4～5.6mg/mL；
(4)评价肉制品的安全性
取野生型AB品系斑马鱼胚胎置于微孔板中，每孔中以水溶方式加入同一成分、浓度分别为1.4、2.8、5.6mg/mL的肉样提取液，设如下实验组：正常对照组、溶剂对照组、阴性对照组和肉样组，处理24h后，观察各实验组的斑马鱼胚胎死亡情况，计算死亡率，判断、评价肉制品的安全性。
优选的，步骤(1)中，模拟胃液按如下成分及比例调配：每10ml配好的胃液中，含有氯化钠5.18g/1000ml、氯化钾0.49g/1000ml、胃蛋白酶3g/1000ml。
优选的，步骤(1)中，均质化的肉制品与乙腈的比例为1:2(w/v)。
优选的，步骤(1)中，仿生消化时的溶液pH为2.0±0.2，加入乙腈提取后的溶液pH为7.0±0.2。
优选的，步骤(4)中，各实验组具体为：
正常对照组，每孔中以水溶方式加入3ml标准稀释水，不做任何处理；
溶剂对照组，用超纯水进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h；
阴性对照组，用无抗肉进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h；
肉样组，用市售肉制品进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h。
本发明还建立了一种用如前所述的肉制品安全性评价方法，对市售肉制品进行安全性评价的检测标准，具体为：在肉样提取液为2.8mg/mL条件下，按步骤(4)方法处理斑马鱼24h后，如斑马鱼胚胎的死亡率≤10％时，则认定为绝对安全；如斑马鱼胚胎的死亡率为10～50％时，则认定为安全；如斑马鱼胚胎的死亡率≥50％时，则认定为不安全。
与现有技术相比，本发明提供的一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法，有益效果如下：
1、本发明提供的肉制品安全性评价方法，与传统的肉制品检测相比，增加了“先体外仿生消化，后乙腈提取”的处理步骤，动态模拟人体胃环境，使得测评结果更趋于真实环境，为判断人用肉制品的安全提供客观依据。
2、本发明通过肉样提取液的处理时间选择、肉样提取液的处理浓度选择、安全性评价的检测标准限设置、均质化的肉制品与乙腈的比例选择等影响因素的考察，成功构建了可评价肉制品安全性的斑马鱼模型，检测准确度高，检测方法科学合理，造模周期短使得检测成本大大降低，为向广大民众、企业、政府普及推广该检测方法提供了现实可行性。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1确定前处理阶段肉制品与乙腈的含量体积比
1、实验目的
本实验中，仅改变肉制品与乙腈的含量体积比，其余实验条件不变，来探究不同的肉制品与乙腈的含量体积比(设为1:1、1:1.5和1:2)对溶解氧的影响，以确定最佳的肉制品与乙腈的含量体积比。
2、实验器材
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；6孔板(Fisher Scientific，China)。
3、实验方法
取市售无抗肉(“无抗肉”系指在养殖过程中不使用任何化学药物、抗生素、人工合成激素，纯自然养殖的动物源食品)，用均质机均匀打碎，均质30s后，再取5g均质肉，加入10ml配好的模拟胃液(含氯化钠5.18g/1000ml、氯化钾0.49g/1000ml、胃蛋白酶3g/1000ml)，涡旋30s后，用50％HCl水溶液调节pH至2.0±0.2。调节好pH后，再涡旋30s，超声处理5min，置于39℃的烘箱中仿生消化2h。
在仿生消化后的肉样溶液中加入体积分别为5ml、7.5ml、10ml乙腈溶液，于4000r/min下高速离心5min，取上清液1ml，氮吹至干。再用0.5ml的超纯水定容保存，超声10min后，用2mol/L NaOH溶液调节pH至7.0±0.2，得肉样提取液，测溶解氧。
4、实验结果与结论分析
当均质后的肉制品与乙腈的含量体积比为1:2(w/v)时，制得的肉样提取液中的溶解氧为80％空气饱和值，符合测试要求；而体积比为1:1(w/v)、1:1.5(w/v)时的溶解氧分别为45％、55％空气饱和值，低于OECD规定的“不低于60％空气饱和值”标准，不符合要求。
综上，确定在前处理阶段，最佳的肉制品与乙腈的含量体积比为1:2。
实施例2确定肉样提取液的处理时间
1、实验目的
本实验中，仅改变肉样提取液的处理时间，其余实验条件不变，来探究不同的处理时间(设为6h、24h和48h)对斑马鱼死亡率、检测水质的影响，以确定最佳的肉样提取液处理时间。
2、实验器材
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；6孔板(Fisher Scientific，China)。
3、实验方法
1)前处理
取肉制品用均质机均匀打碎，均质30s后，再取5g均质肉，加入10ml配好的模拟胃液(含氯化钠5.18g/1000ml、氯化钾0.49g/1000ml、胃蛋白酶3g/1000ml)，涡旋30s后，用50％HCl水溶液调节pH至2.0±0.2。调节好pH后，再涡旋30s，超声处理5min，置于39℃的烘箱中仿生消化2h。
在仿生消化后的肉样溶液中加入10ml乙腈溶液(相当于肉制品与乙腈的含量体积比为1:2，下同)，于4000r/min下高速离心5min，取上清液1ml，氮吹至干。再用0.5ml的超纯水定容保存，超声10min后，用2mol/L NaOH溶液调节pH至7.0±0.2，得肉样提取液，4℃下保存。
2)确定肉样提取液的处理时间
随机挑选发育正常且均为受精后4-128细胞期阶段的野生型AB品系斑马鱼胚胎于微孔板中，每孔(每实验组)30尾。设如下实验组：正常对照组和肉样组(肉制品来源不同)，其中肉样组中，每孔均以水溶方式加入3ml的步骤1)所得的肉样提取液，假定肉样提取液的浓度为一定值(5.6mg/mL)，每孔容量为3mL；正常对照组中，每孔加入与肉样组等体积(3ml)的养鱼用水。
分别于处理6h、24h、48h时，在显微镜下观察和记录每个实验组30尾斑马鱼胚胎是否出现卵凝结、无心跳、体节未形成、尾部未分离情况。如果胚胎出现卵凝结、无心跳、体节未形成或尾部未分离，则判断为死亡胚胎，计算斑马鱼胚胎的死亡率，判断适宜的肉样提取液的处理时间。
4、实验结果与结论分析
实验数据结果，见表1。
表1不同时间点肉样死亡率汇总表(n＝30)
Figure BDA0002437848870000071
从表1中可知：
①当处理时间为6h时，所有肉样组的斑马鱼均未出现任何异常，也未出现任何死亡。
②当处理时间为24h、48h时，肉样组2和肉样组3的死亡率<50％，肉样组1和肉样组4的死亡率≥50％，表明处理时间为24～48h时，所计算的斑马鱼死亡率指标，具有检测意义。
进一步，其余实验条件不变，考察处理时间为24h和48h对检测水质的影响，以确定最佳的肉样提取液处理时间。
【实验方法】肉制品的前处理参照本实施例的步骤1)，得肉样提取液；斑马鱼的处理步骤同本实施例的步骤2)，对各实验组分别处理24h、48h后，检测各实验组水质中的pH、硬度和NO2-情况，判断并确定适宜的肉样的处理时间。
随机挑选发育正常且均为受精后4-128细胞期阶段的野生型AB品系斑马鱼胚胎于微孔板中，每孔(每实验组)30尾。设如下实验组：正常对照组和肉样组，其中肉样组中，每孔均以水溶方式加入相同体积的仿生消化后的肉样提取液，每种肉样提取液均统一设置为5.6mg/mL浓度，每孔容量为3mL；正常对照组中，每孔加入等体积(3ml)的养鱼用水。
分别于处理24、48h后，检测各实验孔中水质中pH、硬度和NO2-情况，判断并最终确定最佳的肉样提取液的处理时间。
【实验结果与结论分析】实验数据结果，见表2。
表2水质检测表
Figure BDA0002437848870000072
从表2中可知：处理24h时，水质均保持在斑马鱼可耐受的正常范围内，说明整个实验过程中实验组的水质无明显变化；处理48h后，NO2-含量明显偏高，已超出正常范围，表明肉样处理48后会对实验组的水质产生影响，影响检测。
综上，在考虑斑马鱼胚胎的死亡率、水质监测情况均须符合测试要求的基础上，最终确定最佳的肉样提取液的处理时间为24h。
实施例3确定肉样提取液的处理浓度
1、实验目的
本实验中，在处理时间为24h的基础上，仅改变肉样提取液的处理浓度，其余实验条件不变，来探究不同的处理浓度(设为0.7mg/mL、1.4mg/mL、2.8mg/mL、5.6mg/mL和11.2mg/mL)对斑马鱼死亡率的影响，以确定最佳的肉样提取液处理浓度。
2、实验器材
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；6孔板(Fisher Scientific，China)。
3、实验方法
1)前处理
取肉制品用均质机均匀打碎，均质30s后，再取5g均质肉，加入10ml配好的模拟胃液(含氯化钠5.18g/1000ml、氯化钾0.49g/1000ml、胃蛋白酶3g/1000ml)，涡旋30s后，用50％HCl水溶液调节pH至2.0±0.2。调节好pH后，再涡旋30s，超声处理5min，置于39℃的烘箱中仿生消化2h。
在仿生消化后的肉样溶液中加入10ml乙腈溶液，于4000r/min下高速离心5min，取上清液1ml，氮吹至干。再用0.5ml的超纯水定容保存，超声10min后，用2mol/L NaOH溶液调节pH至7.0±0.2，得肉样提取液，4℃下保存。
2)确定肉样提取液的处理浓度
随机挑选发育正常且均为受精后4-128细胞期阶段的野生型AB品系斑马鱼胚胎于微孔板中，每孔(每实验组)30尾。设如下实验组：正常对照组和不同品牌来源的肉样组(来源于品牌A、品牌B、品牌C)，其中肉样组中，每孔均以水溶方式加入3ml的步骤1)所得的肉样提取液，肉样提取液的浓度设为0.7mg/mL、1.4mg/mL、2.8mg/mL、5.6mg/mL和11.2mg/mL，每孔容量为3mL；正常对照组中，每孔加入与肉样组等体积(3ml)的养鱼用水。
处理24h后，在显微镜下观察和记录每个实验组30尾斑马鱼胚胎是否出现卵凝结、无心跳、体节未形成、尾部未分离情况。如果胚胎出现卵凝结、无心跳、体节未形成或尾部未分离，则判断为死亡胚胎，计算斑马鱼胚胎的死亡率，判断并确定最佳的肉样提取液的处理浓度。
4、实验结果与结论分析
实验数据结果，见表3。
表3各浓度组斑马鱼胚胎死亡率汇总表(n＝30)
Figure BDA0002437848870000091
从表3中可知：
肉样提取液的浓度为0.7和1.4mg/mL时，品牌A、B、C均不会出现死亡；浓度为2.8mg/mL时，品牌A、B、C的死亡率均<50％；浓度为5.6mg/mL时，品牌样A、B、C的死亡率均≥50％；浓度为11.2mg/mL时，品牌A、B、C均100％死亡。
综上，当肉样提取液的处理浓度为1.4～5.6mg/mL时，所计算的斑马鱼死亡率指标，具有检测意义。故，按低、中、高浓度设置肉样提取液的处理浓度，依次对应为1.4mg/mL、2.8mg/mL和5.6mg/mL。
实施例4确定肉制品安全性评价的检测标准限
1、实验目的
本实验中，在处理时间为24h的基础上，其余实验条件不变，来探究不同的市售肉制品在处理浓度为低(1.4mg/mL)、中(2.8mg/mL)、高剂量(5.6mg/mL)时的斑马鱼死亡率指标差异，以确定肉制品安全性评价的检测标准限。
2、实验器材
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；6孔板(Fisher Scientific，China)。
3、实验方法
1)前处理
取市售肉制品(无抗肉、普通肉制品)用均质机均匀打碎，均质30s后，再取5g均质肉，加入10ml配好的模拟胃液(含氯化钠5.18g/1000ml、氯化钾0.49g/1000ml、胃蛋白酶3g/1000ml)，涡旋30s后，用50％HCl水溶液调节pH至2.0±0.2。调节好pH后，再涡旋30s，超声处理5min，置于39℃的烘箱中仿生消化2h。
在仿生消化后的肉样溶液中加入10ml乙腈溶液，于4000r/min下高速离心5min，取上清液1ml，氮吹至干。再用0.5ml的超纯水定容保存，超声10min后，用2mol/L NaOH溶液调节pH至7.0±0.2，得肉样提取液，4℃下保存。
2)确定肉制品安全性评价的检测标准限
随机挑选发育正常且均为受精后4-128细胞期阶段的野生型AB品系斑马鱼胚胎于微孔板中，每孔(每实验组)30尾。设如下实验组：正常对照组、溶剂对照组、阴性对照组和肉样组，处理24h后，在显微镜下观察和记录每个实验组30尾斑马鱼胚胎是否出现卵凝结、无心跳、体节未形成、尾部未分离和畸形情况。如果胚胎出现卵凝结、无心跳、体节未形成或尾部未分离，则判断为死亡胚胎，计算死亡率后，判断肉样生物全性检测安全限。
其中溶剂对照组、阴性对照组、肉样组中浓度均设为1.4、2.8和5.6mg/mL，每孔容量为3mL；正常对照组中，每孔加入等体积(3ml)的养鱼用水。
其中：
正常对照组，每孔中以水溶方式加入3ml标准稀释水，不做任何处理；
溶剂对照组，用超纯水进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h；
阴性对照组，用市售无抗肉进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h；
肉样组，用市售肉制品(即19030601-1、19030601-2、19030601-3)进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h。
4、实验结果与结论分析
实验数据结果，见表4。
表4各浓度组斑马鱼胚胎死亡率汇总表(n＝30)
Figure BDA0002437848870000101
Figure BDA0002437848870000111
从表4中可知：
①从溶剂对照组、阴性对照组的数据来看，处理浓度为1.4mg/mL和2.8mg/mL时均未出现异常，斑马鱼未出现死亡；处理浓度为5.6mg/mL时，斑马鱼胚胎的死亡率为3.3％(1/30尾)，仍符合OECD标准的测试要求，也符合无抗肉的特性。
③从肉样组的数据来看，不同的市售肉制品安全性表现却差异巨大。当处理浓度为2.8mg/mL时，19030601-1组、19030601-2组、19030601-3组的死亡率分别对应为6.7％、16.7％、50％，能够明显区分出不同的安全性评级；而当处理浓度为5.6mg/mL时，19030601-1组、19030601-2组、19030601-3组的死亡率分别对应为96.7％、63.3％、86.7％，均大于50％，无法区分出安全性评级；故，确定肉制品安全性评价的检测限为2.8mg/M。
另，根据表4中所述OECD标准，以死亡率为指标，确定肉制品安全性评价的检测标准限为：在肉样提取液的处理浓度为2.8mg/mL条件下，处理斑马鱼24h后，如斑马鱼胚胎的死亡率≤10％时，则认定为绝对安全；如斑马鱼胚胎的死亡率为10％～50％时，则认定为安全；如斑马鱼胚胎的死亡率≥50％时，则认定为不安全。
由此可知，肉样组19030601-1的肉制品安全性评级为绝对安全，肉样组19030601-2的肉制品安全性评级为安全，肉样组19030601-3的肉制品安全性评级为不安全。
实施例5市售肉制品的安全性评价应用例
在前述实施例1～4的基础上，运用本发明构建的用斑马鱼模型评价肉制品安全性的方法，实际应用于检测市面上不同来源、宣称食用安全的“放心肉”。
取市售购得的来源于不同品牌、且经化学检测后有“合格”戳印的鸡胸肉，按实施例4步骤1)所述的前处理方法处理鸡胸肉，得到肉样提取液；按实施例4步骤2)所述的方法处理斑马鱼，观察处理浓度分别为1.4mg/mL、2.8mg/mL和5.6mg/mL时斑马鱼的胚胎是否出现卵凝结、无心跳、体节未形成、尾部未分离和畸形情况。如果胚胎出现卵凝结、无心跳、体节未形成或尾部未分离，则判断为死亡胚胎，计算死亡率后，判断并评价市售肉制品的安全性。
实验数据结果，见表5。
表5市售肉样对生物安全性评价(n＝30)
Figure BDA0002437848870000121
从表5中可知，
①阴性对照组选用的是无抗肉，处理浓度为1.4mg/mL、2.8mg/mL和5.6mg/mL时斑马鱼的胚胎死亡率均为0，表明无抗肉是绝对安全的。
②品牌D、品牌E、品牌F组均为市售不同来源的肉制品，当处理浓度为2.8mg/mL时三组斑马鱼胚胎的死亡率为0％、30％和50％，表明品牌D和E这两组肉制品均可放心食用，且品牌D组肉制品评级为“绝对安全”，品牌E组肉制品评级为“安全”，但品牌F组肉制品存在安全性风险，不建议食用。
③从品牌D组肉制品的数据来看，与阴性对照组相同，表明品牌D组肉制品，来源于纯天然养殖的鸡。

Claims (8)

1.一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法，其特征在于：先用仿生消化、提取前处理肉制品得到肉样提取液，再通过确定肉样提取液的处理时间为24h、肉样提取液的处理浓度为1.4～5.6mg/mL来构建斑马鱼模型，并评价肉制品的安全性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)肉制品的前处理
取均质化的肉制品样品，加入按比例调配好的模拟胃液，涡旋，调节溶液pH至酸性环境，再涡旋、超声处理后，恒温条件下仿生消化；
在仿生消化后的肉样溶液中加入乙腈，高速离心，取上清液，氮吹至干；定容，调节溶液pH至中性环境，得肉样提取液，备存；
(2)确定肉样提取液的处理时间
取野生型AB品系斑马鱼胚胎置于微孔板中，设如下实验组：正常对照组和肉样组，其中肉样组中，每孔以水溶方式加入同一成分、同一浓度的肉样提取液；正常对照组中，每孔加入与肉样组等体积的养鱼用水；处理一定时间后，观察各实验组的斑马鱼胚胎死亡情况，计算死亡率；并结合水质中pH、硬度和NO2-的检测情况，判断并确定适宜的肉样提取液的处理时间；
所述肉样提取液的最佳处理时间为24h；
(3)确定肉样提取液的处理浓度
取野生型AB品系斑马鱼胚胎置于微孔板中，设如下实验组：正常对照组和肉样组，其中肉样组中，每孔以水溶方式加入同一成分、不同浓度的肉样提取液；正常对照组中，每孔加入与肉样组等体积的养鱼用水；处理24h后，观察各实验组的斑马鱼胚胎死亡情况，计算死亡率，判断并确定适宜的肉样提取液的处理浓度；
所述肉样提取液的最佳处理浓度为1.4～5.6mg/mL；
(4)评价肉制品的安全性
取野生型AB品系斑马鱼胚胎置于微孔板中，每孔中以水溶方式加入同一成分、浓度分别为1.4、2.8、5.6mg/mL的肉样提取液，设如下实验组：正常对照组、溶剂对照组、阴性对照组和肉样组，处理24h后，观察各实验组的斑马鱼胚胎死亡情况，计算死亡率，判断、评价肉制品的安全性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，模拟胃液按如下成分及比例调配：每10ml配好的胃液中，含有氯化钠5.18g/1000ml、氯化钾0.49g/1000ml、胃蛋白酶3g/1000ml。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，均质化的肉制品与乙腈的比例为1:2(w/v)。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，仿生消化时的溶液pH为2.0±0.2，加入乙腈提取后的溶液pH为7.0±0.2。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，各实验组具体为：
正常对照组，每孔中以水溶方式加入3ml标准稀释水，不做任何处理；
溶剂对照组，用超纯水进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h；
阴性对照组，用无抗肉进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h；
肉样组，用市售肉制品进行前处理，每孔中以水溶方式加入3mL，处理24h。
7.一种如权利要求1～6任一项所述的方法在构建肉制品安全性评价标准中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肉制品安全性的评价标准为：在肉样提取液为2.8mg/mL条件下，按步骤(4)方法处理斑马鱼24h后，
如斑马鱼的死亡率≤10％时，则认定为绝对安全；
如斑马鱼的死亡率为10～50％时，则认定为安全；
如斑马鱼的死亡率≥50％时，则认定为不安全。
CN202010257281.4A 2020-03-22 2020-04-03 一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法 Active CN111766354B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010204721 2020-03-22
CN202010204721X 2020-03-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111766354A true CN111766354A (zh) 2020-10-13
CN111766354B CN111766354B (zh) 2022-04-26

Family

ID=72719372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010257281.4A Active CN111766354B (zh) 2020-03-22 2020-04-03 一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111766354B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112858592A (zh) * 2021-02-01 2021-05-28 广州鲁比生物科技有限公司 一种应用斑马鱼鱼胚进行化妆品温和刺激性评价的方法
CN115222290A (zh) * 2022-08-09 2022-10-21 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种水生态系统中金属针对水生物危害的评价方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060115895A1 (en) * 2002-12-02 2006-06-01 Paul Goldsmith Fish disease models and uses thereof
WO2007054735A1 (en) * 2005-11-14 2007-05-18 Summit Corporation Plc. Quantification method for toxic and teratologic compounds in zebrafish embryos
CN102023207A (zh) * 2010-11-17 2011-04-20 彭恩泽 在整体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法及其应用
CN102899385A (zh) * 2012-11-13 2013-01-30 中国医学科学院药用植物研究所 斑马鱼用于测试安全物质的安全性的用途和方法
CN103301480A (zh) * 2013-05-15 2013-09-18 杭州环特生物科技有限公司 建立斑马鱼肠蠕动模型及筛选促胃肠动力药物的方法
CN103301479A (zh) * 2013-05-07 2013-09-18 南京工业大学 一种模式动物斑马鱼鱼苗评价药物急性毒性的方法
CN104165975A (zh) * 2014-09-25 2014-11-26 重庆市食品药品检验所 一种用斑马鱼对药物功效的评价方法
EA201600545A1 (ru) * 2015-07-21 2017-01-30 Акционерное Общество "Казахский Агротехнический Университет Имени С. Сейфуллина" Способ определения нитратов в мясе и мясопродуктах
CN106442960A (zh) * 2016-11-03 2017-02-22 杭州环特生物科技股份有限公司 用斑马鱼鳔损伤炎症模型评价肺损伤治疗剂与诱导剂的方法
CN106645673A (zh) * 2017-02-28 2017-05-10 山东省科学院生物研究所 一种利用斑马鱼评价化合物急性毒性的装置及其工作方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060115895A1 (en) * 2002-12-02 2006-06-01 Paul Goldsmith Fish disease models and uses thereof
WO2007054735A1 (en) * 2005-11-14 2007-05-18 Summit Corporation Plc. Quantification method for toxic and teratologic compounds in zebrafish embryos
CN102023207A (zh) * 2010-11-17 2011-04-20 彭恩泽 在整体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法及其应用
CN102899385A (zh) * 2012-11-13 2013-01-30 中国医学科学院药用植物研究所 斑马鱼用于测试安全物质的安全性的用途和方法
CN103301479A (zh) * 2013-05-07 2013-09-18 南京工业大学 一种模式动物斑马鱼鱼苗评价药物急性毒性的方法
CN103301480A (zh) * 2013-05-15 2013-09-18 杭州环特生物科技有限公司 建立斑马鱼肠蠕动模型及筛选促胃肠动力药物的方法
CN104165975A (zh) * 2014-09-25 2014-11-26 重庆市食品药品检验所 一种用斑马鱼对药物功效的评价方法
EA201600545A1 (ru) * 2015-07-21 2017-01-30 Акционерное Общество "Казахский Агротехнический Университет Имени С. Сейфуллина" Способ определения нитратов в мясе и мясопродуктах
CN106442960A (zh) * 2016-11-03 2017-02-22 杭州环特生物科技股份有限公司 用斑马鱼鳔损伤炎症模型评价肺损伤治疗剂与诱导剂的方法
CN106645673A (zh) * 2017-02-28 2017-05-10 山东省科学院生物研究所 一种利用斑马鱼评价化合物急性毒性的装置及其工作方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SY MOHAMAD, S.F. ET AL.: "Proximate composition, minerals contents, functional properties of Mastura variety jackfruit (Artocarpus heterophyllus) seeds and lethal effects of its crude extract on zebrafish (Danio rerio) embryos", 《 FOOD RESEARCH》 *
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 等: "《中华人民共和国国家标准》", 30 December 2011 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112858592A (zh) * 2021-02-01 2021-05-28 广州鲁比生物科技有限公司 一种应用斑马鱼鱼胚进行化妆品温和刺激性评价的方法
CN115222290A (zh) * 2022-08-09 2022-10-21 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种水生态系统中金属针对水生物危害的评价方法
CN115222290B (zh) * 2022-08-09 2023-10-31 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种水生态系统中金属针对水生物危害的评价方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111766354B (zh) 2022-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huys et al. Search for beneficial bacterial strains for turbot (Scophthalmus maximus L.) larviculture
Asselman et al. Global cytosine methylation in Daphnia magna depends on genotype, environment, and their interaction
Belik et al. Morpho-functional state of the liver of the rats fed the rations with meat of the pigs grown with antimicrobials.
CN111766354B (zh) 一种用斑马鱼评价肉制品安全性的方法
Werner et al. Slaughter performance of four different turkey strains, with special focus on the muscle fiber structure and the meat quality of the breast muscle
Westerman et al. THE RNA-DNA RATIO: MEASUREMENT OF NUCLEIC ACIDS IN LARVAL SCL4ENOPS OCELL4TUS
CN105176997B (zh) 一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
Choi et al. Growth, carcass, fiber type, and meat quality characteristics in Large White pigs with different live weights
Hwang et al. Differences in muscle fiber characteristics and meat quality by muscle type and age of Korean native black goat
Bicskei et al. Comparing the transcriptomes of embryos from domesticated and wild Atlantic salmon (Salmo salar L.) stocks and examining factors that influence heritability of gene expression
Zhang et al. Effect of low voltage electrostatic field combined with partial freezing on the quality and microbial community of large yellow croaker
CN111551679A (zh) 一种快速检测现场餐饮安全性的方法
Brillant et al. Postingestive sorting of living and heat-killed Chlorella within the sea scallop, Placopecten magellanicus (Gmelin)
CN101889633A (zh) 盐酸吡格列酮在禽畜饲料添加剂中的应用
Vácha et al. Texture profile analyses in tench (Tinca tinca L., 1758) from extensive and intensive culture
Basti et al. Biochemical reference intervals for the resting state in the adult lobster Homarus americanus
Eisapour et al. Digestive tract regeneration in the posteriorly eviscerating sea cucumber Holothuria parva (Holothuroidea, Echinodermata)
Skewes et al. Muscle fibre characteristics, enzyme activity and meat colour of wild boar (Sus scrofa s. L.) muscle with 2n= 36 compared to those of phenotypically similar crossbreeds (2n= 37 and 2n= 38)
Whitefield et al. Composition of phytodetrital food resources affects reproductive success in the deposit-feeding sea cucumber, Parastichopus californicus (Stimpson 1857)
Oliveira et al. The effect of feeder system and diet on welfare, performance and meat quality, of growing-finishing Iberian× Duroc pigs under high environmental temperatures
Arnaudova et al. Selected hematological indices of freshwater fish from Studen Kladenetsh Reservoir
CN111549108B (zh) 一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道微生物组成、功能差异分析方法
CN107190010A (zh) 一组与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体及其应用
DEHELEAN et al. Ochratoxin a: a toxicologic evaluation using in vitro and in vivo bioassays.
Chrenek et al. Meat quality of transgenic rabbit

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant