CN111748521B - 一种增加脂肪源间充质干细胞葡萄糖摄取的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对葡萄糖摄取能力强的间充质干细胞的制备方法，属于细胞生物学领域。本发明的方法，是以间充质干细胞为原料，施加有强度的红、绿、黄三色光线照射10～30min。本发明还公开了一种适应前述方法的装置，其中包括发射红、绿、黄三色光线的光源。使用本发明的方法和装置，将能制备出对葡萄糖摄取能力强的间充质干细胞，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是来源于成体组织中的具有自我更新和多向分化能力的细胞，广泛存在于骨髓、骨骼肌、脐带、脂肪、皮肤等等组织器官。间充质干细胞在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。
在糖尿病治疗领域，第三军医大学新桥医院曾将2型糖尿病患者的自体骨髓间充质干细胞注射到患者脾动脉，手术后12个月后患者空腹血糖、餐后2小时血糖均较术前降低，糖化血红蛋白较术前显著降低，空腹C肽即餐后2小时C肽比术前明显升高，表明起到了一定治疗作用，产生作用的可能机制就包括MSC在胰腺微环境分化成了胰岛样细胞(姚金萍，自体骨髓间充质干细胞定向移植治疗2型糖尿病安全性及有效性的临床研究，第三军医大学硕士学位论文，2012；BEHROUS DAVANI等，Human islet-derived precursorcells aremesenchymal stromal cells that differentiae and mature to hormone-expressingcells in vivo.Stem Cells，2007，25(12)：3215-3222)。
众所周知，2型糖尿病患者的葡萄糖摄取功能不健全，其胰岛素刺激下的葡萄糖摄取受到损害。提高间充质干细胞的葡萄糖摄取能力(特别是在胰岛素刺激下的葡萄糖摄取能力)，可对2型糖尿病患者自体的源间充质干细胞进行体外干预，再应用到患者，可望进一步增强其在2型糖尿病治疗中的有效性。
LED(发光二极管，Light Emitting Diode)属于半导体固体发光器件，当半导体P-N结通以正向电流时，P区载流子发生复合，引起光子发射直接将电能转化为光能，目前已有红外、红、黄、绿、蓝、紫等各种发光二极管。LED具有冷光源、可调节波段、全固态、发光效率高、能耗低、功率小、单色性好、绿色环保、寿命长等特点，已被广泛应用于信号指示、装饰照明、液晶背光、通信等领域。近年来，随着LED光源技术巨大进步，LED在生物医学领域的应用越发广泛，主要用于医疗特殊灯具照明、疾病诊断、和医学治疗，其中在医学治疗领域，其临床上应用也越来越广泛，主要用于理疗、保健、美容等方面。
研究显示，LED光源辐射能够促进细胞生长。如，Whelan等利用688nm的LED辐射人正常上皮细胞，结果显示上皮细胞增殖速率较正常对照组增长55-71％；利用670nm的LED辐射小鼠成纤维细胞，结果显示小鼠成纤维细胞DNA合成速率较正常对照组增加10％-43％，并且随天数增加其增长趋势呈降低规律。李燕等利用650±17nm波长LED刺激人皮肤成纤维细胞，结果发现刺激600秒后细胞总数比对照组显著增多。
目前没有关于LED光源增强细胞对葡萄糖摄取的相关报道。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种增加脂肪源间充质干细胞葡萄糖摄取的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种增加间充质干细胞葡萄糖摄取的方法，它是以间充质干细胞为原料，施加有强度的红、绿、黄三色光线照射10～60min。
如前述的制备方法，所述红、绿、黄三色光线中，红光波长为620-625nm；和/或，绿光波长510-520nm；和/或，黄光波长585-590nm。
如前述的制备方法，所述红、绿、黄三色光线以LED为光源；和/或，光照时间为30min。
如前述的制备方法，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
如前述的制备方法，间充质干细胞在转动的透明容器中均匀地接受光照。
优选的，所述转动转速为30转/分钟。
如前述的制备方法，其特征在于：它还包括如下步骤：
在红、绿、黄三色光线照射后，加入终浓度为20～200mM的胰岛素；优选的，胰岛素终浓度为100mM。
一种用于增强间充质干细胞对葡萄糖摄取能力的装置，它包括外罩(1)和位于外罩内部的LED灯筒(2)，外罩(1)一侧有针筒入口(3)，LED灯筒(2)内部有容纳针筒的通道(7)，通道(7)的一端开口与针筒入口(3)正对，LED灯筒(2)内侧固定有LED光源；
LED光源包括：发射红光的LED光源，发射绿光的LED光源和发射黄光的LED光源。
如前述的装置，所述红光的波长为620-625nm；和/或，绿光的波长510-520nm；和/或，黄光的波长585-590nm。
如前述的装置，所述LED红光源电压1.9～2.5V，共10个；
和/或，所述LED绿光源电压3.0～3.2V，共10个；
和/或，所述LED黄光源电压1.9～2.2V，共10个。
如前述的装置，针筒入口(3)处安装有滚动轴承，滚动轴承的外环与针筒入口(3)的内壁配合，滚动轴承的内环伸出滚动轴承两端，底座上有电机，电机通过皮带与内环的一端连接；
和/或，所述外罩(1)与针筒入口(3)相对的另一侧有风扇(5)。
如前述的装置，外罩(1)内部有控制板，液晶显示屏(4)、LED光源和仪器启动键(10)与控制板电联接，外罩(1)上表面设有开启旋转控制键(11)和关闭旋转控制键(12)；
进一步的，外罩(1)上表面设有增加时间控制键(9)和减少时间控制键(8)，所述增加时间控制键(9)和减少时间控制键(8)与控制板电联接。
本发明的方法具有如下有益效果：
1)本发明的方法通过红、绿、黄三色光线照射间充质干细胞，可显著增强间充质干细胞摄入葡萄糖的能力；
2)本发明的方法结合红、绿、黄三色光线照射与胰岛素处理，可形成协同增效作用，大幅度提高间充质干细胞摄入葡萄糖的能力。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：本发明细胞治疗转化仪(用于增强MSC对葡萄糖摄取能力的装置)的外罩结构。
图2：本发明细胞治疗转化仪(用于增强MSC对葡萄糖摄取能力的装置)的灯筒结构。
图3：正常脂肪间充质干细胞葡萄糖摄取图。
图4：2型糖尿病脂肪间充质干细胞葡萄糖摄取图。
图1～2中：1-外罩、2-LED灯筒、3-针筒入口、4-液晶显示屏、5-风扇、6-灯座、7-通道、8-减少时间控制键、9-增加时间控制键、10-仪器启动键、11-开启旋转控制键、12-关闭旋转控制键。
具体实施方式
实施例1一种对葡萄糖摄取能力强的间充质干细胞的制备方法
本实施例以脂肪间充质干细胞为例，对本发明的方法进行具体描述。
1.脂肪间充质干细胞分离
(1)脱臼法处死小鼠，在用70％的乙醇消毒动物5-10分钟。解剖腹部皮肤，暴露皮下脂肪组织，用无菌镊子和剪刀取出皮下脂肪组织。
(2)将提取的组织放在一个6厘米的预先称重的培养皿中。用分析天平称取组织(Ng)。
(3)加入室温1×N ml(其中N是脂肪组织的重量，以克为单位)MSC分离培养基到含有脂肪组织的培养皿中。
(4)用无菌剪刀将脂肪组织切碎，直到形成精细的块状物，使用1毫升的带切断端过滤器，准确地将切碎的组织转移到15毫升离心管。
(5)向培养皿中加入2.5×N ml MSC分离培养基，清洗并转移将剩余的组织块放入相同的15毫升试管中。
(6)将制备好的胶原酶溶液0.5×N ml加入到含有切碎组织的试管中，在37℃恒温摇瓶中匀速搅拌40分钟，每分钟200转。用10毫升移液管将产生的细胞悬浮液上下吹动20-30次，直到均匀。
(7)22℃，370g，离心10分钟，弃去上清液，加入1ml间充质干细胞分离培养基，重悬细胞。弃去上清液，加入1ml，用1ml滤液重悬细胞，加入9ml间充质干细胞分离培养基，混合，22℃离心10分钟。
(8)再次重复步骤7。最后用1毫升间充质干细胞生长培养基中重悬细胞。
(9)用血细胞计计数分离细胞的总数。(这一阶段分离细胞的平均数量是可变的，但通常在5-15个左右)
(10)每个10厘米培养皿中播入500-700万个细胞，每个培养皿中加入间充质干细胞生长培养基，最终体积为10ml，在低氧条件下于37℃CO2培养箱中培养。
(11)培养传代，细胞大概生长5-7天，达到70-80％融合，间充质干细胞第一天和之后每3天更换一次。(这个阶段的细胞有一个稍微拉长的成纤维细胞样的形状)。
(12)倾斜培养皿，小心地从附着的塑料中吸取培养基用1×PBS清洗一次，在每个10厘米的培养皿中加入1毫升胰蛋白酶溶液，在37℃下分离细胞5-10分钟。
(13)将细胞转移到15毫升离心管中，加入5毫升间充质干细胞生长培养基，轻轻混合。在室温下370g离心7分钟。将细胞悬浮于1-2毫升间充质干细胞生长培养基中。
2.LED光照射处理
2.1光源参数
LED红光源波长620-625nm，电压1.9～2.5V；LED绿光源波长510-520nm，电压3.0～3.2V；LED黄光源波长585-590nm，电压1.9～2.2V。LED红光源、绿光源和黄光源分别设置10个。
2.2照射处理
将MSC装入透明针筒，使其同时接受LED红光源、绿光源和黄光源的照射，期间针筒轴向旋转，转速为30转/分钟，使LED光照射均匀。
光照时间30min，期间通过温控装置保持细胞处在适宜生活温度。
实施例2一种细胞治疗转化仪(用于增强MSC对葡萄糖摄取能力的装置)
1.细胞治疗转化仪的结构
如图1、2所示，本发明细胞治疗转化仪包括底座、外罩1和位于外罩内部的LED灯筒2，外罩1一侧有针筒入口3，外罩表面设有液晶显示屏4和仪器启动键10，LED灯筒2内部有容纳针筒的通道7，通道7的一端开口与针筒入口3正对，通道7侧面有LED光源，外罩1内部有控制板，液晶显示屏4、LED光源和仪器启动键10与控制板电联接，外罩1与底座固定连接；优选的，外罩1与针筒入口3相对的另一侧有风扇5，风扇5与控制板电联接，优选的，通道7与LED灯筒2内壁之间有一层玻璃罩。
针筒入口3处安装有滚动轴承，滚动轴承的外环与针筒入口3的内壁配合，滚动轴承的内环伸出滚动轴承的两端，底座上有电机，电机通过皮带与内环的一端连接，内环另一端设有螺孔，本实施方式中螺孔设有三个，螺孔中有螺丝，有螺纹孔的一端位于外罩1外侧；外罩1上表面设有开启旋转控制键11和关闭旋转控制键12，所述电机、开启旋转控制键11和关闭旋转控制键12与控制板电联接，
进一步的，外罩1上表面设有增加时间控制键9和减少时间控制键8，所述增加时间控制键9和减少时间控制键8与控制板电联接；优选的LED灯筒2顶部设有灯座6，LED光源设于灯座6上，所述灯座6平行设有三排，分别安装LED红光源、LED绿光源和LED黄光源，每排等间距设有10个灯座6，灯座的排向与通道7的轴线平行，优选的，LED红光源波长620-625nm，电压1.9～2.5V；LED绿光源波长510-520nm，电压3.0～3.2V；LED黄光源波长585-590nm，电压1.9～2.2V。外罩1和LED灯筒2的材质为医用无铅不锈钢；外罩1的外表面和内表面及LED灯筒2的外表面均喷涂烤漆，外罩1长17cm，宽14cm，高9.5cm。
2.细胞治疗转化仪的使用方法
将细胞悬液装入针筒，针筒通过针筒入口3进入通道7，旋紧螺孔中的螺丝，将针筒与滚动轴承的内环固定在一起，开启仪器启动键10，按下开启旋转控制键11，LED红光源、LED绿光源和LED黄光源组合对细胞进行刺激；内置的电机通过皮带带动滚动轴承的内环转动，进而带动针筒旋转，既可使得LED光照更均匀、充分，也可防止如血小板、PRP之类血细胞的聚集现象，保证细胞生长活性。通过减少时间控制键8或增加时间控制键9可减少或增加照射时间，风扇5可散热，当温度达到25度，风扇会自动启动，保证细胞于LED灯照射下温稳定低于37度；通过液晶显示屏4可显示时间和温度，通道7与LED灯筒2内壁之间的玻璃罩隔绝LED灯与所检测样品并可平衡LED灯的照射强度，通过控制板自动温度、光照时间，以及控制电机和风扇5的启动和关闭。
(1)取细胞，置于针筒中，然后将针筒放入通道(7)中；
(2)打开LED光源和仪器启动键(10)，光照10-60min，即可。
优选地，步骤(2)中，打开LED光源和仪器启动键的同时，打开开启旋转控制键，其中旋转的速率为30转/分钟。
实施例3一种对葡萄糖摄取能力强的间充质干细胞的制备方法(使用细胞治疗转化仪)
1.脂肪间充质干细胞分离
同实施例1。
2.LED光照射处理
使用实施例2所述细胞治疗转化仪进行LED光照处理，具体方法如实施例2的“细胞治疗转化仪的使用方法”部分所示，光照时间设置为30min。
以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。
实验例1对比LED光照射与不进行照射的脂肪间充质干细胞摄取葡萄糖的能力
1.方法
使用实施例1的方法，从健康小鼠和患有2型糖尿病小鼠体内分离得到正常脂肪间充质干细胞和2型糖尿病间充质干细胞，再将两种间充质干细胞分别分成4组：
对照组：不进行光照处理，不加胰岛素；
光照组：第一天使用实施例3的方法进行红、绿、黄三色光照处理30min，第二天不加胰岛素；
胰岛素组：第一天不进行处理，第二天在细胞培养环境中加入终浓度为100nM的胰岛素；
胰岛素+光照组：第一天使用实施例3的方法进行红、绿、黄三色光照处理30min，第二天在细胞培养环境中加入100nM的胰岛素。
再检测前述间充质干细胞的葡萄糖摄取能力，具体方法如下：
应用非放射性葡萄糖摄取分析试剂盒(Glucose Uptake-Glo Assay kit，Promega)。细胞在处理或不处理胰岛素(100nM)10分钟，加入2DG 10分钟后，再加入100μl2DG6P后在Luminometer读取，数据分析。
2.结果
图3显示了正常脂肪间充质干细胞的葡萄糖摄取能力，纵坐标用荧光发光值(Luminescence，RLU)来间接反映葡萄糖的摄取率，RLU值越高，摄取率越高。由图可知，与对照组比较，光照组和作为阳性对照的胰岛素组葡萄糖摄取均高于未处理对照组(*p＜0.05与对照组比较有统计学意义)。另外，胰岛素+光照组的RUL值高出对照组120％以上，而光照组和胰岛素组分别高出对照组约53％和33％。显然，光照与胰岛素在提升间充质干细胞的葡萄糖摄取能力上产生了协同增效作用。
图4显示了2型糖尿病脂肪间充质干细胞的葡萄糖摄取能力。情况在正常脂肪间充质干细胞中相似：与对照组比较，光照组和作为阳性对照的胰岛素组葡萄糖摄取均高于未处理对照组(*p＜0.05与对照组比较有统计学意义)。另外，胰岛素+光照组的RUL值高出对照组135％以上，而光照组和胰岛素组分别高出对照组约54％和23％；显然，光照与胰岛素在提升间充质干细胞的葡萄糖摄取能力上产生了协同增效作用。
结论：无论是对正常脂肪间充质干细胞，还是对2型糖尿病脂肪间充质干细胞，使用红、绿、黄三色光照处理后，其摄取葡萄糖的能力增强；另外，若将胰岛素和红、绿、黄三色光照联用，能够产生协同增效作用，极显著增强细胞对葡萄糖的摄取能力。
综上，本发明的方法和装置可以显著增加间充质干细胞对葡萄糖的摄取能力；在与胰岛素联合使用后，产生协同增效作用，增强效果大幅度提升。使用本发明的方法和装置，将能制备出对葡萄糖摄取能力强的间充质干细胞，应用前景良好。
Claims (4)
1.一种对葡萄糖摄取能力强的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于：它是以脂肪间充质干细胞为原料，施加有强度的红、绿、黄三色光线照射30min；
在红、绿、黄三色光线照射后，在细胞培养环境中加入终浓度为100mM的胰岛素；
红光波长为620-625nm；绿光波长为510-520nm；黄光波长为585-590nm。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述红、绿、黄三色光线以LED为光源。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：脂肪间充质干细胞在转动的透明容器中均匀地接受光照。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述转动转速为30转/分钟。
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Citations (6)
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|---|---|---|---|---|
| CN104350146A (zh) * | 2012-03-12 | 2015-02-11 | 新加坡国立大学 | 从间充质细胞制备棕色脂肪组织(bat) |
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| CN108624554A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-10-09 | 山东大学 | 一种非基因修饰光操控双向调节人脐带间充质干细胞增殖的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104350146A (zh) * | 2012-03-12 | 2015-02-11 | 新加坡国立大学 | 从间充质细胞制备棕色脂肪组织(bat) |
| CN105039303A (zh) * | 2015-08-20 | 2015-11-11 | 吴剑波 | 一种促进细胞激活和分化的方法 |
| CN204864578U (zh) * | 2015-08-20 | 2015-12-16 | 吴剑波 | 细胞治疗转化仪 |
| WO2019086597A1 (en) * | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Roemer & Heigl Gmbh | Extraction of stem cells from bone marrow niches |
| CN108392743A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-08-14 | 哈尔滨医科大学 | 具有610-650nm波长的LED-红光在缓解腰肌劳损症状中的应用 |
| CN108624554A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-10-09 | 山东大学 | 一种非基因修饰光操控双向调节人脐带间充质干细胞增殖的方法 |
Non-Patent Citations (1)
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| Xin Fan等.Prolonged Therapeutic Effects of Photoactivated Adipose-derived Stem Cells following Ischemic Injury.Acta Physiologica.2020,第230卷(第1期),第1-12页. * |
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