CN111744056A - 贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料及其制备方法和应用，属于医用植入材料技术领域。该贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料可以提高支架的生物诱导活性，从而更好地模仿软骨组织外基质环境，进而提高软骨修复效果。

Description

贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料及其制备方法和应用
技术领域
本公开涉及医用植入材料技术领域，尤其涉及一种贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料及其制备方法和应用。
背景技术
关节软骨是人体运动系统骨关节中非常重要的组织。关节软骨没有血液供应、无淋巴回流、无神经分布，损伤后难以自身修复，其修复障碍直接影响患者运动功能，并可导致严重骨关节炎和关节病废，从而对普通人群的工作、生活以及运动员运动生涯造成损害。据统计，美国每年约有4300万软骨损伤患者，而在我国每年的发病人数约为6500万例，且呈逐年增长趋势，从1990年到2010年的20年间，软骨缺损发病率年增长率为45％。
目前国际上对于关节软骨损伤治疗仍未达到很好的修复效果。关节软骨损伤修复与重建治疗仍是国际上运动医学与骨科界最为关注和亟待解决的重大问题。
所述背景技术部分公开的上述信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此它可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本公开的目的在于提供一种贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料及其制备方法和应用，提高软骨修复的效果。
为实现上述发明目的，本公开采用如下技术方案：
根据本公开的第一个方面，提供一种贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料。
在本公开的一种示例性实施例中，其是由贻贝蛋白与脱细胞软骨材料交联而成。
在本公开的一种示例性实施例中，贻贝蛋白修饰基团与脱细胞软骨材料的质量比为(0.007～7)：100。
在本公开的一种示例性实施例中，贻贝蛋白修饰基团与脱细胞软骨材料的质量比为(0.07～6.4):100。
根据本公开的第二个方面，提供一种上述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的制备方法，包括：
制备包括贻贝蛋白、脱细胞软骨材料和交联剂的反应液；
将制备的反应液在15～35℃下反应8～36小时；
将反应后的反应液过滤并保留固体滤出物；
将所获得的固体滤出物进行纯化。
在本公开的一种示例性实施例中，在所述反应液中，贻贝蛋白与脱细胞软骨材料的质量比为(0.0001～0.1)：1。
在本公开的一种示例性实施例中，在所述反应液中，贻贝蛋白与脱细胞软骨材料的质量比为(0.001～0.1)：1。
在本公开的一种示例性实施例中，所述交联剂为二醛、甲醛、京尼平和缩合剂中的一种或多种。
在本公开的一种示例性实施例中，所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚铵和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
根据本公开的第三个方面，提供一种上述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料在制备软骨修复材料中的应用。
在本公开的一种示例性实施例中，所述软骨修复材料为软骨修复支架或可注射软骨修复组合物。
本公开提供的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料及其制备方法和应用，贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料可以提高支架的生物诱导活性，从而更好地模仿软骨组织外基质环境，进而提高软骨修复效果。
具体实施方式
现在更全面地描述示例实施例。然而，示例实施例能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施例使得本公开将更加全面和完整，并将示例实施例的构思全面地传达给本领域的技术人员。所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施例中。在下面的描述中，提供许多具体细节从而给出对本公开的实施例的充分理解。
本公开提供一种贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料。该贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料可以提高支架的生物诱导活性，从而更好地模仿软骨组织外基质环境，进而提高软骨修复效果。
贻贝蛋白是一种具有生物活性的蛋白，具有耐腐蚀、强度高、抑菌止痒、促进组织愈合、生物相容性好的特点。本公开发现，利用贻贝蛋白修饰脱细胞软骨材料，使得脱细胞软骨材料具有较高的生物活性、组织修复能力和在湿性条件下良好的粘性。当贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料被植入软骨缺损处时，贻贝蛋白将从脱细胞软骨材料中缓慢释放到周围组织中去，既能够促进周围软骨细胞的增殖，又能够诱导骨髓源性间充质干细胞、滑膜源性间充质干细胞、软骨祖细胞向软骨方向分化，最终获得在组织学、形态学、生物力学等方面接近天然软骨的软骨组织，使缺损软骨得到修复。
脱细胞软骨材料可以为软骨脱细胞基质(acellular matrix，ACM)。脱细胞基质指异体组织经细胞灭活处理后，制备成无活体细胞存在的细胞外基质(ECM)成分和结构。因其无抗原性，以及有良好的生物相容性，可以作为组织工程支架材料。将软骨组织中的细胞脱除作为细胞支架，可以解决排斥反应的问题，成为具有良好生物相容性的组织工程支架材料。脱细胞软骨材料中含有三维纳米细胞外基质结构，有利于软骨细胞的爬行、生长和分化。同时其含有丰富的生物活性物质，能够为细胞的繁殖和分化提供良好的微环境。
因此，本公开的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料在体内生理条件或湿性的环境下具有良好的粘性，因此医生在用关节镜进行关节软骨修复时无需再将患者关节腔中的关节液先行排出，能够确保在正常关节镜条件下进行软骨修复手术，软骨修复材料能够很好地保留在软骨损伤部位，不被关节腔中的关节液冲离软骨缺损部位或冲散，克服了现有软骨修复材料在湿性条件下无法粘附在软骨缺损部位的缺点。同时，贻贝蛋白自身也具有良好的软骨修复能力，将其与脱细胞软骨材料共同作用于软骨缺损部位，起到协同修复的作用。
可选地，贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料可以由贻贝蛋白与脱细胞软骨材料交联而成。
可选地，在贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料中，贻贝蛋白修饰基团的质量比为(0.007～7)：100。进一步地，在贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料中，贻贝蛋白修饰基团的质量比为(0.07～6.4):100。其中，贻贝蛋白修饰基团的质量比，指的是，修饰于脱细胞软骨材料中的贻贝蛋白质量与贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的质量的比值。
本公开还提供了一种贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的制备方法，该制备方法包括：
制备包括贻贝蛋白、脱细胞软骨材料和交联剂的反应液；
将制备的反应液在15～35℃下反应8～36小时。
可以理解的是，本领域技术人员可以根据反应液的浓度和交联剂的活性等，选择恰当的反应温度和反应时间。
其中，脱细胞软骨材料可以为粉末材料，也可以为预成型材料，本公开对此不做特殊的限定。通过物理或化学的方法对人源或动物源性的软骨进行脱细胞、去病毒等的处理，可以获得脱细胞软骨材料。
可选的，在所述反应液中，贻贝蛋白与脱细胞软骨材料的质量比为(0.0001～0.1)：1。进一步地，在所述反应液中，贻贝蛋白与脱细胞软骨材料的质量比为(0.001～0.1)：1。可以理解的是，反应液中的贻贝蛋白可以完全修饰到脱细胞软骨材料上，也可以部分修饰到脱细胞软骨材料上，本公开对此不做特殊的限定。
可选的，所述交联剂为二醛(如戊二醛)、甲醛、京尼平和缩合剂中的一种或多种。该交联剂可以利用贻贝蛋白和脱细胞软骨材料上的氨基、羧基、羟基、巯基或者其他活性基团实现交联。
所述缩合剂用于使得氨基与羧基反应生成酰胺，或则使得羟基与羧基反应生成酯。举例而言，缩合剂可以为EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚铵)、DCC或DIC等。在一实施方式中，缩合剂中还可以包括稳定剂，以使得贻贝蛋白和脱细胞软骨材料上的活性基团先生成稳定剂生成活性中间体，以提高缩合反应速度或者抑制贻贝蛋白中氨基酸残基的消旋。
举例而言，缩合剂可以为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚铵和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
可选的，可以先制备贻贝蛋白的磷酸缓冲盐溶液，制备缩合剂的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液；然后，将脱细胞软骨材料、贻贝蛋白的磷酸缓冲盐溶液和缩合剂的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液混合，获得反应液。
可选的，贻贝蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，贻贝蛋白的浓度可以为1～2000mg/L。进一步地，贻贝蛋白的磷酸缓冲盐溶液中，贻贝蛋白的浓度可以为50～2000mg/L。
可选的，所述制备方法还包括：
将反应后的反应液过滤并保留滤饼；
将所获得的滤饼通过透析进行纯化。
可选的，纯化后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料，可以通过冻干的方法进行干燥，进而形成贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的冻干产物。
本公开还提供了贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料在制备软骨修复材料中的应用。可选地，所制备的软骨修复材料可以包括但不限于软骨修复支架和可注射软骨修复组合物。
本公开还提供了一种软骨修复支架，包括贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料。可以理解的是，该软骨修复支架可以由贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料组成，也可以由贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料和其他材料组成。
软骨修复支架可以利用预成型的脱细胞软骨材料制备。例如，可以先将脱细胞软骨材料制备成所需的形状，然后在成型的脱细胞软骨材料上修饰贻贝蛋白。
软骨修复支架也可以先制备贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料，然后在进行成型。举例而言，软骨修复支架的制备方法可以包括：
将粉末状的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料配置成混悬液；
将所述混悬液通过冷冻干燥法制备所述软骨修复支架。
可选的，所述混悬液中，贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的质量比为3％～20％。
可选的，软骨修复支架的孔隙率为50％～95％。
本公开还提供一种可注射软骨修复组合物，包括水凝胶和混悬于所述水凝胶中的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料。
可选的，水凝胶可以为温敏型水凝胶或者光敏型水凝胶。
可选的，所述光敏型水凝胶为含有蓝光引发剂的甲基丙烯酸酯化明胶。
可选的，所述温敏型水凝胶为含有β-甘油磷酸钠和壳聚糖的水凝胶。
下面，以数个实施例，对本公开提供的技术方案做进一步的解释和说明。
实施例1
用pH＝7.2的PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)制备50mg/L的贻贝蛋白溶液；
用pH＝4.5的MES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液)配制EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚铵)溶液；
用pH＝4.5的MES缓冲液配制NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液；
将1g粉末状的脱细胞软骨材料和50mg/L的贻贝蛋白溶液2mL充分混合；
然后向混合物中逐滴加入含有40μg EDC的MES溶液0.1mL，并加入含有60μg NHS的MES溶液0.1mL，充分搅拌，获得反应液。
将反应液在室温条件下充分反应12hr。
然后将反应后的反应液过滤，并保留固体；
将所获得的固体放入透析袋(截留分子量为5000)中透析3天，每隔12hr换一次水，直至未反应的物质和交联副产物全部被透析干净，获得清洗后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料；
将清洗后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料进行冷冻干燥备用。
实施例2
用pH＝7.2的PBS溶液配制500mg/L的贻贝蛋白溶液；
用pH＝4.5的MES缓冲液配制EDC溶液；
用pH＝4.5的MES缓冲液配制NHS溶液；
将1g粉末状的脱细胞软骨材料和500mg/L贻贝蛋白溶液2mL充分混合，
然后向混合物中逐滴加入含有400μg EDC的MES溶液1mL，并加入含有600μg NHS的MES溶液1mL，充分搅拌，获得反应液；
将反应液在室温条件下充分反应12hr。
然后将反应后的反应液过滤，并保留固体；
将所得固体放入透析袋(截留分子量为5000)中透析3天，每隔12hr换一次水，直至未反应的物质和交联副产物全部被透析干净，获得清洗后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料；
将清洗后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料进行冷冻干燥备用。
实施例3
用pH＝7.2的PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)制备2g/L的贻贝蛋白溶液；
用pH＝4.5的MES缓冲液配制EDC溶液；
用pH＝4.5的MES缓冲液配制NHS溶液；
将1g粉末状的脱细胞软骨材料和2g/L的贻贝蛋白溶液50mL充分混合；
然后向混合物中逐滴加入含有40mg EDC的MES溶液100mL，并加入含有60mg NHS的MES溶液100ml，充分搅拌，获得反应液。
将反应液在室温条件下充分反应12hr。
然后将反应后的反应液过滤，并保留固体；
将所获得的固体放入透析袋(截留分子量为5000)中透析3天，每隔12hr换一次水，直至未反应的物质和交联副产物全部被透析干净，获得清洗后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料；
将清洗后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料进行冷冻干燥备用。
实施例4
将实施例2所获得的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的冻干粉和甲基丙烯酸酯化明胶(Gelma)溶液复合，获得光敏可注射软骨修复材料。其中，该Gelma溶液中添加有浓度为5％的蓝光引发剂(LAP)，该可注射软骨修复材料在被注射到软骨缺损部位后，能够通过流动充满到整个需要填充的缺损部位(包括不规则的软骨缺损)，在蓝光(波长405nm)的照射下，该可注射软骨修复材料迅速在体内固化，与周围软骨缺损组织紧密贴合。
实施例5
将0.1g实施例3所获得的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料与2wt％壳聚糖溶液混合，混合后的体积为1mL，获得混合液；
向混合液中逐滴滴入50wt％β-甘油磷酸钠溶液，至混合物中β-甘油磷酸钠溶液的最终浓度为8wt％，获得温敏可注射软骨修复材料。
实施例6
用pH＝7.2的PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)制备500mg/L的贻贝蛋白溶液；
用pH＝4.5的MES缓冲液配制EDC溶液；
用pH＝4.5的MES缓冲液配制NHS溶液；
将1g预成型的脱细胞软骨材料和500mg/L的贻贝蛋白溶液2mL充分混合；
然后向混合物中逐滴加入含有400μg EDC的MES溶液1mL，并加入含有600μg NHS的MES溶液1mL，充分搅拌，获得反应液；
将反应液在室温条件下充分反应12hr。
然后将反应后的反应液过滤，并保留固体；
将所获得的固体放入透析袋(截留分子量为5000)中透析3天，每隔12hr换一次水，直至未反应的物质和交联副产物全部被透析干净，获得清洗后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料；
将清洗后的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料进行冷冻干燥备用，获得预成型的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料，预成型的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料可以作为软骨修复支架使用。
实施例7
将实施例1所制备的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的冻干粉，制备成质量比为3％、10％和20％的软骨修复材料悬液，采用冷冻干燥法制备软骨修复支架。扫面电镜显示软骨修复支架被孔径相互连通。压汞法测试三维支架的结果表明，含有贻贝蛋白的脱细胞软骨三维修复支架的孔隙率从分别为92％、78％和55％。结果表明，可以通过调节软骨修复材料悬液中贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的浓度，进而调节所制备的修复支架的孔隙率，调整修复支架的力学性能等性能。
实施例8
将实施例1所制备的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的冻干粉，制备成质量比为3％-20％的软骨修复材料悬液，采用冷冻干燥法制备软骨修复支架。根据GB/T16886.5，采用MTT法分析软骨修复支架浸提液毒性，结果显示支架的细胞毒性不大于1级。
实施例9
将实施例2所制备的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的冻干粉，制备成质量比为3％-20％的软骨修复材料悬液，采用冷冻干燥法制备软骨修复支架。根据GB/T16886.5，采用MTT法分析软骨修复支架浸提液毒性，结果显示支架的细胞毒性不大于1级。
实施例10
倒置相差显微镜和SEM观察BMSCs在软骨修复材料上的生长
在24孔培养板上，每块板的A1、B1、C1、D1孔各放1块贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料(用实施例3方法制备并通过冷冻干燥成型)，每块板的A2、B2、C2、D2孔各放1块未经贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料。各孔同时加入相同培养基，将密度为5×106个/mL BMSCs 40μL接种于24孔培养板的各脱细胞软骨材料上，CO2培养箱中培养4hr，再分别加1.2mL L-DMEM培养基培养，每3天换液一次。倒置相差显微镜观察其生长变化。在培养第2天及第7天各取出部分材料，用2.5％戊二醛固定30min，干燥后于扫描电子显微镜下观察细胞在材料上粘附、增殖情况。
由于材料透光性差，倒置相差显微镜无法直接观察细胞在脱细胞软骨材料表面生长情况，但观察到脱细胞软骨材料周围有大量细胞粘附培养板底。
联合培养第2天，通过SEM可见脱细胞软骨材料孔隙内大量BMSCs生长,BMSCs基本铺满材料表面，多数细胞呈长梭形，培养第7天的脱细胞软骨材料上细胞明显增多，细胞呈长梭形，随材料表面特征成一定方向排列。细胞表面有多个细长突起，细胞突起交互连接呈网状，有的与其它胞体相连。和未经贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料相比，贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料上和材料周围有更多的BMSCs的粘附和增殖，证明贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料具有更好生物相容性，更适宜做软骨修复材料。
实施例11
对贻贝蛋白进行异硫氰酸荧光素(FITC)标定，然后分别用实施例1、2和3的方法制备贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料。用荧光光度仪测定反应后过滤液的荧光光度，从而推算出未交联的贻贝蛋白的质量，进而推算出已交联的贻贝蛋白质量以及贻贝蛋白修饰基团在复合软骨支架中所占的质量比。在此试验中，贻贝蛋白在支架材料中的质量比分别为约0.007％、0.069％和6.36％。
应可理解的是，本公开不将其应用限制到本说明书提出的部件的详细结构和布置方式。本公开能够具有其他实施方式，并且能够以多种方式实现并且执行。前述变形形式和修改形式落在本公开的范围内。应可理解的是，本说明书公开和限定的本公开延伸到文中提到或明显的两个或两个以上单独特征的所有可替代组合。所有这些不同的组合构成本公开的多个可替代方面。本说明书所述的实施方式说明了已知用于实现本公开的最佳方式，并且将使本领域技术人员能够利用本公开。

Claims (11)

1.一种贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料。
2.根据权利要求1所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料，其特征在于，其是由贻贝蛋白与脱细胞软骨材料交联而成。
3.根据权利要求1所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料，其特征在于，贻贝蛋白修饰基团与脱细胞软骨材料的质量比为(0.007～7)：100。
4.根据权利要求3所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料，其特征在于，贻贝蛋白修饰基团与脱细胞软骨材料的质量比为(0.07～6.4):100。
5.权利要求1～4任一项所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，包括：
制备包括贻贝蛋白、脱细胞软骨材料和交联剂的反应液；
将制备的反应液在15～35℃下反应8～36小时；
将反应后的反应液过滤并保留固体滤出物；
将所获得的固体滤出物进行纯化。
6.根据权利要求5所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，在所述反应液中，贻贝蛋白与脱细胞软骨材料的质量比为(0.0001～0.1)：1。
7.根据权利要求6所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，在所述反应液中，贻贝蛋白与脱细胞软骨材料的质量比为(0.001～0.1)：1。
8.根据权利要求5所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，所述交联剂为二醛、甲醛、京尼平和缩合剂中的一种或多种。
9.根据权利要求5所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料的制备方法，其特征在于，所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚铵和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
10.权利要求1～4任一项所述的贻贝蛋白修饰的脱细胞软骨材料在制备软骨修复材料中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述软骨修复材料为软骨修复支架或可注射软骨修复组合物。
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