CN111718892A - 一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液及方法，属于家畜胚胎工程技术领域。提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液为在SOF培养液的基础上添加体积分数5‑10％的胎牛血清，并且添加如下微量元素：五水硫酸铜，七水硫酸锌，亚硒酸钠，一水硫酸锰，柠檬酸铁，钼酸铵，偏钒酸铵，六水硫酸镍，氯化亚锡。使用该培养液进行牛体外受精胚胎或牛体细胞核移植胚胎的培养可有效提高牛体外胚胎培养效率和质量。

Description

一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液及方法
技术领域
本发明涉及家畜胚胎工程技术领域，更具体的说是涉及一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液及方法。
背景技术
胚胎体外培养是家畜胚胎工程技术领域的重要环节，胚胎培养液是体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎在体外发育的基础环境，其对胚胎发育有着至关重要的影响；培养液组分搭配不当或营养成分不足，均会影响胚胎的发育。
目前常用的牛体外胚胎培养液有CR1aa、TCM-199和SOF等，这些培养液一般会配合血清或者血清白蛋白使用。一些微量元素，如锌、铁和硒在胚胎发育阶段具有重要的作用，其是许多酶的组成成分，也参与到一些代谢通路，从而整体调节生命活动。但目前很少有研究报道从微量元素的添加角度出发，来提升牛体外胚胎培养的培养效率和质量。并且在微量元素的添加过程中往往无法实现对牛体外胚胎培养效率和质量的有效提升，甚至还有可能对培养产生负面影响。
因此，如何在培养液中合理添加微量元素，以提高牛体外胚胎培养效率和质量是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液及方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液，
在SOF培养液的基础上添加体积分数5-10％的胎牛血清，并且添加如下微量元素：
五水硫酸铜，1.0-5.0μg/L；
七水硫酸锌，500.00-1000.00μg/L；
亚硒酸钠，10.0-30.0μg/L；
柠檬酸铁，800.00-1500.00μg/L；
一水硫酸锰，0.10-0.50μg/L；
钼酸铵，0.5-2.0μg/L；
偏钒酸铵，0.10-1.50μg/L；
六水硫酸镍NiSO4·6H2O，0.05-0.2μg/L；
氯化亚锡，0.05-0.2μg/L。
优选地，一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液，
在SOF培养液的基础上添加体积分数5％的胎牛血清，并且添加如下微量元素：
五水硫酸铜，1.6μg/L；
七水硫酸锌，863.00μg/L；
亚硒酸钠，17.3μg/L；
柠檬酸铁，1155.10μg/L；
一水硫酸锰，0.17μg/L；
钼酸铵，1.24μg/L；
偏钒酸铵，0.65μg/L；
六水硫酸镍，0.13μg/L；
氯化亚锡，0.12μg/L。
一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养方法，使用上述提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液进行牛体外受精胚胎或牛体细胞核移植胚胎的培养。
优选地，胚胎培养过程包括1细胞、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹胚和囊胚阶段的牛胚胎培养。
优选地，将完成受精的牛体外受精胚胎或已经激活处理完成的体细胞核移植胚胎放入上述提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液中，38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养6-7天。
优选地，每50μL提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液中放置胚胎10-20枚。
优选地，每隔24小时半量更换提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液，培养过程中无需饲养层共培养。
由上述技术方案可知，本发明通过在培养液中合理添加微量元素，可有效提高牛体外胚胎的桑椹胚和囊胚发育效率，并且提高囊胚细胞数、内细胞团数目和滋养层数目。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中所用微量元素药品均购置于sigma公司，胎牛血清为Gibco公司产品。
实施例1
1.制备微量元素浓储液
为了在培养胚胎工程中方便添加，将微量元素配制成1000×浓储液，具体包括：
五水硫酸铜，1.6mg/L；
七水硫酸锌，863.00mg/L；
亚硒酸钠，17.3mg/L；
柠檬酸铁，1155.10mg/L；
一水硫酸锰，0.17mg/L；
钼酸铵，1.24mg/L；
偏钒酸铵，0.65mg/L；
六水硫酸镍，0.13mg/L；
氯化亚锡，0.12mg/L。
配置时使各组分充分溶解，分装成50mL/瓶，用时室温溶解。
2.胚胎培养液的制备
以SOF培养液为基础添加体积分数为5％的胎牛血清，所用SOF培养液为自配溶液，配方如下：
并且添加步骤1中制备的微量元素浓储液使其终浓度为1×，制得培养液1。
实施例2
1.制备微量元素浓储液
为了在培养胚胎工程中方便添加，将微量元素配制成1000×浓储液，具体包括：
五水硫酸铜，1.0mg/L；
七水硫酸锌，500mg/L；
亚硒酸钠，10mg/L；
柠檬酸铁，800mg/L；
一水硫酸锰，0.10mg/L；
钼酸铵，0.5mg/L；
偏钒酸铵，0.1mg/L；
六水硫酸镍，0.05mg/L；
氯化亚锡，0.05mg/L。
配置时使各组分充分溶解，分装成50mL/瓶，用时室温溶解。
2.胚胎培养液的制备
以SOF培养液为基础添加体积分数为5％的胎牛血清，并且添加步骤1中制备的微量元素浓储液使其终浓度为1×，制得培养液2。
实施例3
1.制备微量元素浓储液
为了在培养胚胎工程中方便添加，将微量元素配制成1000×浓储液，具体包括：
五水硫酸铜，5.0mg/L；
七水硫酸锌，1000.00mg/L；
亚硒酸钠，30.0mg/L；
柠檬酸铁，1500.00mg/L；
一水硫酸锰，0.50mg/L；
钼酸铵，2.0mg/L；
偏钒酸铵，1.50mg/L；
六水硫酸镍0.2mg/L；
氯化亚锡，0.2mg/L。
配置时使各组分充分溶解，分装成50mL/瓶，用时室温溶解。
2.胚胎培养液的制备
以SOF培养液为基础添加体积分数为5％的胎牛血清，并且添加步骤1中制备的微量元素浓储液使其终浓度为1×，制得培养液3。
实施例4
使用实施例1、2和3制备的培养液1、2和3分别对牛体外受精胚胎牛体细胞核移植胚胎进行培养试验，试验结果如下：
(1)牛体外受精胚胎体外发育试验
体外受精操作完成的牛胚胎，换入培养液1、2或者3中，每50μL培养液1中放置胚胎约15枚，38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养7天，每隔24小时半量更换培养液，培养过程中无需饲养层共培养。同时以SOF+5％胎牛血清培养液作为对照，统计不同阶段胚胎发育率，同时对囊胚细胞数，内细胞团数目(ICM)和滋养层数目(TE)进行统计。胚胎发育率如表1所示；牛体外受精胚胎的囊胚细胞数、内细胞团数和滋养层细胞数统计如表2所示。
表1体外受精胚胎发育率统计
Figure BDA0002560678410000071
同一列不同字母代表显著差异(a,b,p<0.05；a,c,p<0.01)
表2牛体外受精胚胎囊胚质量统计
Figure BDA0002560678410000072
同一列不同字母代表显著差异(p<0.05)
(2)牛体细胞核移植胚胎的体外发育试验
将已经完成体外激活处理的牛体细胞核移植胚胎换入培养液1、2或3中，每50μL培养液1、2或3中放置胚胎约15枚，38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养7天，每隔24小时半量更换培养液1、2或3，培养过程中无需饲养层共培养。同时以SOF+5％胎牛血清培养液作为对照，统计不同阶段胚胎发育率，同时对囊胚细胞数，内细胞团数目(ICM)和滋养层数目(TE)进行统计。胚胎发育率如表3所示；牛体细胞核移植胚胎牛体外受精胚胎的囊胚细胞数、内细胞团数和滋养层细胞数统计如表4所示。
表3牛体细胞核移植胚胎发育率统计
Figure BDA0002560678410000081
同一列不同字母代表显著差异(p<0.05)
表4牛体细胞核移植胚胎囊胚质量统计
Figure BDA0002560678410000082
同一列不同字母代表显著差异(p<0.05)
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液，其特征在于，
在SOF培养液的基础上添加体积分数5-10％的胎牛血清，并且添加如下微量元素：
五水硫酸铜，1.0-5.0μg/L；
七水硫酸锌，500.00-1000.00μg/L；
亚硒酸钠，10.0-30.0μg/L；
柠檬酸铁，800.00-1500.00μg/L；
一水硫酸锰，0.10-0.50μg/L；
钼酸铵，0.5-2.0μg/L；
偏钒酸铵，0.10-1.50μg/L；
六水硫酸镍NiSO4·6H2O，0.05-0.2μg/L；
氯化亚锡，0.05-0.2μg/L。
2.根据权利要求1所述的一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液，其特征在于，
在SOF培养液的基础上添加体积分数5％的胎牛血清，并且添加如下微量元素：
五水硫酸铜，1.6μg/L；
七水硫酸锌，863.00μg/L；
亚硒酸钠，17.3μg/L；
柠檬酸铁，1155.10μg/L；
一水硫酸锰，0.17μg/L；
钼酸铵，1.24μg/L；
偏钒酸铵，0.65μg/L；
六水硫酸镍，0.13μg/L；
氯化亚锡，0.12μg/L。
3.一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养方法，其特征在于，
使用权利要求1或2所述提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液进行牛体外受精胚胎或牛体细胞核移植胚胎的培养。
4.根据权利要求3所述的一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养方法，其特征在于，
所述胚胎培养过程包括1细胞、2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹胚和囊胚阶段的牛胚胎培养。
5.根据权利要求3所述的一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养方法，其特征在于，
将完成受精的牛体外受精胚胎或已经激活处理完成的体细胞核移植胚胎放入权利要求1或2所述提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液中，38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养6-7天。
6.根据权利要求5所述的一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养方法，其特征在于，
每50μL所述提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液中放置胚胎10-20枚。
7.根据权利要求5所述的一种提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养方法，其特征在于，
每隔24小时半量更换所述提高牛体外胚胎培养效率和质量的培养液。
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