CN111718296B - 靶向cd133的小分子化合物ly335979在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤和生物技术领域，涉及一种具有抗肿瘤作用的小分子化合物LY335979，其化学式为C₃₂H₃₁F₂N₃O₂.3HCl。所述化合物具有良好的抗癌活性，能抑制CD133阳性表达肿瘤细胞的增殖、自我更新能力以及迁移。本发明还在分子水平上阐明了该小分子化合物靶向CD133蛋白的作用机制，为设计和发展抑制CD133活性的药物及新型的以CD133为靶标的抗癌活性抑制剂奠定了良好的理论基础。

Description

靶向CD133的小分子化合物LY335979在制备抗肿瘤药物中的 应用

技术领域

本发明属于肿瘤和生物技术领域，涉及CD133抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤异常增殖、抵抗凋亡以及侵袭转移等生物学特性,给肿瘤治疗带来了巨大挑战。传统的治疗手段尚无法从根本上治疗恶性肿瘤,且多伴随明显毒副作用,给患者带来痛苦,影响患者生活质量。近年来,分子靶向治疗作为肿瘤治疗的新策略,以其特异性强,副作用小等治疗优势逐渐被推崇,许多分子靶向药物已获FDA批准投入临床,并取得了较好的临床疗效。分子靶向治疗策略的核心是靶点的确定,通过对肿瘤分子机制不断的深入研究,寻找精准靶点,是攻克肿瘤的关键所在。

CD133蛋白又名Prominin-1是一个五跨膜糖蛋白分子是近年来报道较多的肿瘤相关分子。自2004年Singh等发现CD133阳性的胶质瘤细胞为肿瘤起始细胞，CD133作为肿瘤干细胞标志物被广泛用于分选肝癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌等实体瘤干细胞。研究表明：CD133分子在近20种不同来源的恶性肿瘤中呈现异常表达,并且通过不同的形式参与肿瘤发生,增殖,分化,侵袭转移,凋亡抵抗以及代谢等多种生物学事件,而通过干涉、敲除、阻断等方式抑制CD133的异常表达后,可以逆转肿瘤的恶性表型。肿瘤中以CD133分子为细胞表面标志物的分选证明，CD133+细胞具有肿瘤干细胞特点，CD133+肿瘤细胞具有更强的自我更新能力、成瘤能力、放化疗抵抗能力和迁移能力等，在肿瘤的复发和转移中起重要作用，而肿瘤细胞的这些特点正是肿瘤难以治愈的主要原因。在脑胶质瘤的治疗中，放射治疗是非手术治疗中最有效的治疗方法。但病人的预后还是比较差，这其中涉及到肿瘤干细胞对放疗的抵抗，而肿瘤干细胞的分化和增殖能力使得少量细胞即能够重新形成肿瘤。以CD133作为脑肿瘤干细胞标志物的研究中发现，放疗后的小鼠模型的CD133+肿瘤细胞百分比是对照组的2-4倍，和CD133-的脑瘤细胞比较，CD133+脑瘤干细胞离子放射治疗后具有更强的放疗抵抗能力，说明CD133+肿瘤细胞具有放疗抵抗的能力，从而在放疗过后达到了富集的效果。CD133，作为一个被广泛应用于鉴定和分离肝癌等肿瘤干细胞的分子标志，在肿瘤干细胞的筛选和靶向性杀伤中具有重要作用，可以说CD133已经具备了肿瘤的药物靶点特性,然而目前以CD133的这一新靶点抗肿瘤的治疗药物还未见有相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供靶向CD133分子的小分子化合物，明确其抗肿瘤的生物学功能及相应的分子机制，以便进一步改造和优化。

本发明提供了一种靶向CD133的抗肿瘤小分子化合物ly335979及其在抗肿瘤中的应用，该化合物结构简单，具有良好的抗肿瘤活性。实验结果表明，该化合物具有良好的抗癌活性，能抑制CD133阳性表达肿瘤细胞的增殖，自我更新能力以及肿瘤细胞的迁移，在分子水平上也证明该小分子化合物具有较好的靶向CD133蛋白的作用。本发明在上述基础上完成。

本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的小分子化合物，所述的小分子化合物称为ly335979，其化学式为C₃₂H₃₁F₂N₃O₂.3HCl。

具体而言，所述的小分子化合物的结构如下：

本发明还提供了一种抗肿瘤试剂盒，其活性成分为小分子化合物ly335979。

另一方面，本发明提供了ly335979在制备抗肿瘤药物中的应用。

该小分子化合物可以作为抗肿瘤药物的活性成分，也可以与药学上可接受的辅料混合，用于制备抗肿瘤药物。

较好的，所述的抗肿瘤药物靶向CD133。例如，在本发明的一个优选例中，ly335979能够抑制CD133磷酸化。

ly335979具有较好的靶向CD133作用，能够与CD133相互作用，本发明所述的肿瘤可以是源自CD133阳性或者表达量增高的细胞。

所述的肿瘤类型可以为CD133异常表达所引起的各种恶性肿瘤。

所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞增殖和自我更新能力的药物。

所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞迁移的药物。

所述的抗肿瘤药物为化学式为C₃₂H₃₁F₂N₃O₂.3HCl的小分子化合物和药学上任意一种或几种辅料制成的药物。

所述的抗肿瘤药物的剂型包括含有ly335979小分子化合物的液体制剂、片剂、冲剂、软胶丸、软胶囊、缓释剂、滴丸和注射剂，其给药形式包括口服给药和注射给药。

本发明提供了一种具有抗肿瘤作用的小分子化合物LY335979，其化学式为C₃₂H₃₁F₂N₃O₂.3HCl。此化合物具有良好的抗癌活性，能抑制CD133阳性表达肿瘤细胞的增殖，自我更新能力以及肿瘤细胞的迁移。在分子水平上阐明了该小分子化合物靶向CD133蛋白的作用机制，为设计和发展抑制CD133活性的药物及新型的以CD133为靶标的抗癌活性抑制剂奠定了良好的理论基础。

附图说明

图1.为利用DARTS技术鉴定细胞裂解液中LY335979与CD133蛋白的相互作用。当小分子化合物LY335979加入细胞裂解液后，CD133蛋白的表达增多；并且随着LY335979浓度的增加，这种“保护”作用加强。说明小分子化合物LY335979其靶蛋白CD133结合，从而降低了它对蛋白酶的敏感性。

图2.为细胞培养形态图。10uMLY335979处理Huh7CD133+肝癌细胞48h后,细胞的密度明显降低，同时体积变小，出现了固缩现象。

图3.为CCK8增殖实验，在化合物处理24h，48h，72h进行CCK8检测。实验结果表明LY335979对CD133+表达的肿瘤细胞具有明显的抑制作用。

图4.为细胞迁移实验，对照组(DMSO)和实验组(10uMLy335979)处理Huh7CD133+肝癌细胞48h后细胞的迁移情况。实验结果表明，LY335979处理后，Huh7CD133+迁移的细胞明显减少。

图5.为细胞自我更新实验，对照组(DMSO)和实验组(10uMLy335979)处理肝癌细Huh7CD133+，Prf5CD133+后细胞自我更新能力的对比。A图为Huh7CD133+形成的细胞球的示意图，B图为Prf5CD133+形成的细胞球的示意图。C为软琼脂克隆实验示意图。LY335979处理后，细胞的自我更新能力明显降低。

图6.为Western杂交检测对照组(DMSO)和化合物处理组(10uMLy335979)Huh7CD133+细胞中P-CD133,CD133,Sox4,Naong蛋白表达的结果，检测GAPDH蛋白量作为内参。小分子化合物LY335979处理后，CD133的磷酸化水平明显降低，干性基因Sox4,Naong蛋白表达水平下调。研究结果表明小分子化合物LY335979抑制了CD133的磷酸化，进而抑制细胞的自我更新能力。

具体实施方式

本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明的实施并不仅限于此。

本实施例中未注明的具体条件和实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或者参照试剂生产商提供的条件实施。

实施例1利用DARTS技术分析Ly335979与CD133蛋白的相互作用

1)细胞收集与裂解将培养好的Huh7CD133+的肝癌细胞用预冷的PBS缓冲液洗2-3次，然后加入预冷的细胞裂解液(含有磷酸化酶和蛋白酶抑制剂)，用细胞刮铲将细胞轻轻刮下，置于预冷的离心管内上下颠倒混匀几次后至于冰上静置裂解10分钟。

2)细胞裂解液制备将预冷的细胞液于18,000×g低温高速离心10分钟，将上清转移至新的离心管，用BCA蛋白测定试剂盒测定裂解液的蛋白浓度，根据测定浓度，吸取适当裂解液，将裂解液4-6μg/μL，然后将裂解液平分为两份。

3)分子药物与裂解液孵育结合对照管中加入适当浓度的二甲基亚砜DMSO，药品管中加入不同浓度的LY335979(1mM,100μM,10μM)小分子化合物，混匀后于室温结合1小时，或低温过夜结合。

4)蛋白酶工作液制备事先配好蛋白酶pronse储存液(10mg/mL)，临用时用1×TNC稀释至适当浓度，根据蛋白酶与裂解液中总蛋白的比例如：1︰100加入适当浓度的蛋白酶。

5)蛋白酶水解根据实验需要，将每组样品分为3-6份，每份样品都留一半作为非酶解对照，按比例加入蛋白酶后，用计时器精确计时1-30分钟，30分钟后加入20倍的蛋白酶抑制剂或直接加入蛋白胶上样缓冲液终止反应，将反应管置于冰上或放入开水中煮沸。

6)结合蛋白的鉴定、可采用western blot等多种方法对结合蛋白进行检测或鉴定。

实施例2检测化合物处理后Huh7CD133+细胞的增殖情况

所使用的细胞株为上述为已建立的CD133稳定表达的肿瘤细胞株，利用CCK-8实验进行检测。具体操作如下：

1)先用0.25％胰酶消化单层培养的细胞，再用含10％胎牛血清的DMEM吹打使其形成单个细胞悬液。

2)每孔接种3×10³个细胞到96孔细胞培养板中，放入细胞培养箱中4h，每个样品做6个平行复孔，并加空白孔做为对照，加1uM化合物进行处理

3)细胞培养时间设为0h、24h、48h、72h。将10μl CCK-8溶液加入96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养2小时，终止培养。

4)在酶联免疫检测仪上选择450nm波长，测定吸光值，保存数据。绘制细胞生长曲线，分析实验结果。实验结果表明小分子化合物对CD133+的肝癌细胞的增殖能力具有显著抑制作用。

实施例3细胞成球能力检测

1)将上述培养的肝癌细胞用干细胞胰酶消化2分钟左右，2000rpm离心5分钟，弃上清。

2)用含有20ng/mL EGF(Chemicon)、20ng/mL FGF-2(Chemicon)、2μg/mLheparin(Sigma)、1:50的比例加入不含维生素A的B27(Gibco)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，吸去上清，用DMEM/F12培养基重复洗涤细胞2次，用细胞计数仪计算细胞数量。

3)按照每孔100个细胞的密度，将对照组和实验组的细胞等量分到低吸附的96孔板(Corning)，加1uM化合物进行处理，设立实验组和对照组。每孔细胞悬浮于100μl DMEM/F12培养基中，每组9个重复孔，共10个孔。

4)每3天补充30μl DMEM/F12培养基，培养2周后，在显微镜下拍照，统计形成细胞球的数量和直径，以直径大于100μm的细胞球作为有效的结果。如结果所示；化合物处理组细胞形成的细胞球直径明显比对照组小，细胞球数量也显著少于对照组，说明化合物LY335979能够抑制肿瘤细胞的自我更新。

实施例4软琼脂克隆实验

1)取适当生长状态的细胞，消化为单细胞悬液，使用细胞计数仪计数，用培液吹打成单细胞悬液备用。

2)准备浓度为1.2％和0.7％的低熔点琼脂糖溶液，高温高压灭菌后，保持在40℃使琼脂糖溶液不会凝固。

3)将1.2％的低熔点琼脂糖溶液与预热到40℃的2×DMEM培养基(含有20％的胎牛血清和2倍工作浓度的抗生素)以1:1混匀，铺入6孔板的底层，冷却凝固后即为底层平板。

4)按1:1比例混匀0.7％的琼脂糖与2×DMEM培养基(含2倍工作浓度抗生素和20％胎牛血清)，再向其中加入含有(1um化合物处理的3X10⁴个细胞量的细胞悬液，彻底混匀，加入已制备好的底层平板上，即为制备好的双琼脂层。待上层琼脂凝固后，转移入细胞培养箱中培养了16天，期间观察。

5)使用成像系统采集图像，计算细胞克隆数、克隆形成率。

结果显示，加入本发明的小分子化合物后，细胞克隆数和克隆形成率均较对照减少。

实施例5化合物处理后相关基因的表达水平用western杂交检测

1)根据实验目的制备不同浓度的分离胶SDS-PAGE分离胶，静置1h后分离胶凝固，制备5％的积层胶，插上合适的梳子待凝。

2)向电泳槽中加入1×SDS电泳缓冲液，内槽的缓冲液要没过加样孔，下槽没过电极，加入蛋白样品和蛋白质分子量标准Marker。接通装置电源，电压60V，当蛋白Marker进入分离胶后，把电压调至120V，继续电泳，当溴酚蓝到达分离胶的底部，停止电泳。

3)将胶浸于转移缓冲液中平衡10min，剪取适当大小的PVDF膜，用纯甲醇浸泡1min，再移入转移缓冲液浸泡，装配转移“三明治”：依次为海绵→3层滤纸→凝胶→PVDF膜→3层滤纸→海绵，加转移缓冲液，插上电极，选择恒流350mA。

4)封闭:转膜结束后，放入含10％BSA的TBST封闭缓冲液中，室温摇动2h或者4℃过夜。

5)免疫杂交:TBST漂洗膜3次，每次5-10min；用含10％BSA的TBST一抗，4℃过夜孵育；TBST漂洗膜3次，每次10-15min；用含10％BSA的TBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(稀释比1:10000)，室温孵育膜2h；TBST漂洗膜3次，每次20-25min。

6)显色曝光:根据信号的强弱适当调整曝光时间，扫描并保存实验结果。

结果表明，本发明的小分子化合物对于CD133具有较好的靶向性。

Claims (2)

1.如下式结构的小分子化合物LY335979在制备抗肝癌药物中的用途，所述的小分子化合物LY335979其化学式为C₃₂H₃₁F₂N₃O₂.3HCl，

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的小分子化合物LY335979通过抑制CD133的磷酸化，调控肝癌干细胞的干性指标Naong、Sox4的表达，调控肝癌的发生和发展。