CN111707830B - Rock激酶活性在辅助诊断肺损害中的应用 - Google Patents

Rock激酶活性在辅助诊断肺损害中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ROCK激酶活性在辅助诊断肺损害中的应用。本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用。所述产品的功能为诊断或辅助诊断肺损害。所述产品的功能为诊断或辅助诊断血管炎累及的肺损害。所述产品的功能为诊断或辅助诊断血管炎患者中的肺损害患者。本发明的发明人发现，血管炎患者中肺损害亚组患者较皮肤损害亚组患者ROCK激酶活性升高，提示ROCK激酶的活性程度可能与肺损害密切相关。本发明对于肺损害患者的辅助诊断，肺损害患者的辅助筛查，均具有重大的应用价值。

Description

ROCK激酶活性在辅助诊断肺损害中的应用
技术领域
本发明涉及ROCK激酶活性在辅助诊断肺损害中的应用。
背景技术
血管炎(Vasculitis)血管炎是一组以全身各血管的炎症和破坏为主要病理表现的自身免疫性疾病。血管炎症可导致血管破坏，故有时又称坏死性血管炎。血管炎包括的疾病很广泛，既可以是原发性血管炎，也可以伴随或继发于其他疾病。侵犯的血管以动脉为主，也可以同时累及动脉、静脉和毛细血管。可以小血管为主要侵犯对象，也可以是以较大血管为主的疾病。
血管炎累及的皮肤损害：血管炎的皮肤表现具有多形性特点，基本损害包括：红斑、丘疹、紫癜、结节、糜烂、溃疡、坏死等。
血管炎累及的肺损害：包括肺部结节、胸膜炎或胸腔积液、肺血管炎，严重者可出现弥漫性肺泡出血、肺动脉高压、肺栓塞等，终末期可出现肺间质纤维化。患者可出现呼吸困难、咳嗽、胸痛、憋喘等临床症状。
发明内容
本发明的目的是提供ROCK激酶活性在辅助诊断肺损害中的应用。
本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断肺损害。
本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为筛查或辅助筛查肺损害患者。
本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断血管炎累及的肺损害。
本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为筛查或辅助筛查血管炎累及的肺损害患者。
本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断血管炎患者中的肺损害患者。
本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为筛查或辅助筛查血管炎患者中的肺损害患者。
以上任一所述应用中，所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测P-MYPT1的物质和用于检测MYPT1的物质。
以上任一所述应用中，所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测人P-MYPT1的物质和用于检测人MYPT1的物质。
以上任一所述应用中，用于检测P-MYPT1的物质包括Phospho-MYPT1抗体。
以上任一所述应用中，用于检测P-MYPT1的物质还包括辣根酶标记羊抗兔IgG抗体。
以上任一所述应用中，用于检测P-MYPT1的物质还包括用于从外周血单个核细胞提取细胞总蛋白的物质。
以上任一所述应用中，用于检测P-MYPT1的物质还包括用于从外周血提取外周血单个核细胞的物质。
以上任一所述应用中，用于检测MYPT1的物质包括MYPT1抗体。
以上任一所述应用中，用于检测MYPT1的物质还包括辣根酶标记羊抗兔IgG抗体。
以上任一所述应用中，用于检测MYPT1的物质还包括用于从外周血单个核细胞提取细胞总蛋白的物质。
以上任一所述应用中，用于检测MYPT1的物质还包括用于从外周血提取外周血单个核细胞的物质。
以上任一所述应用中，所述产品为试剂盒。
本发明还保护一种产品，包括用于检测ROCK激酶活性的物质；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)：
(a)诊断或辅助诊断肺损害；
(b)筛查或辅助筛查肺损害患者；
(c)诊断或辅助诊断血管炎累及的肺损害；
(d)筛查或辅助筛查血管炎累及的肺损害患者；
(e)诊断或辅助诊断血管炎患者中的肺损害患者；
(f)筛查或辅助筛查血管炎患者中的肺损害患者。
所述产品中，所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测P-MYPT1的物质和用于检测MYPT1的物质。
以上任一所述应用中，所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测人P-MYPT1的物质和用于检测人MYPT1的物质。
所述产品中，用于检测P-MYPT1的物质包括Phospho-MYPT1抗体。
所述产品中，用于检测P-MYPT1的物质还包括辣根酶标记羊抗兔IgG抗体。
所述产品中，用于检测P-MYPT1的物质还包括用于从外周血单个核细胞提取细胞总蛋白的物质。
所述产品中，用于检测P-MYPT1的物质还包括用于从外周血提取外周血单个核细胞的物质。
所述产品中，用于检测MYPT1的物质包括MYPT1抗体。
所述产品中，用于检测MYPT1的物质还包括辣根酶标记羊抗兔IgG抗体。
所述产品中，用于检测MYPT1的物质还包括用于从外周血单个核细胞提取细胞总蛋白的物质。
所述产品中，用于检测MYPT1的物质还包括用于从外周血提取外周血单个核细胞的物质。
所述产品具体可为试剂盒。
所述产品的功能为(a)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性＞0.72，受试者为或候选为肺损害患者。
所述产品的功能为(b)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性＞0.72，受试者为或候选为肺损害患者。
所述产品的功能为(c)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性＞0.72，受试者为或候选为血管炎累及的肺损害患者。
所述产品的功能为(d)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性＞0.72，受试者为或候选为血管炎累及的肺损害患者。
所述产品的功能为(e)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性＞0.72，受试血管炎患者为或候选为肺损害患者。
所述产品的功能为(f)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性＞0.72，受试血管炎患者为或候选为肺损害患者。
所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：
(1)取受试者的外周静脉血，分离外周血单个核细胞。
(2)取外周血单个核细胞，提取细胞总蛋白。
(3)将细胞总蛋白进行Western-Blot，使P-MYPT1和MYPT1蛋白条带显影；
(4)分析Western-Blot显影图中蛋白条带的灰度值，获得P-MYPT1/MYPT1。
本发明还保护ROCK激酶活性作为标志物的应用，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)：
(Ⅰ)作为肺损害的标志物的应用；
(Ⅱ)作为血管炎累及的肺损害的标志物的应用；
(Ⅲ)作为血管炎患者中的肺损害患者的标志物的应用。
以上任一所述ROCK激酶活性为P-MYPT1/MYPT1。
以上任一所述ROCK激酶活性为P-MYPT1丰度/MYPT1丰度。
以上任一所述ROCK激酶活性为人P-MYPT1丰度/人MYPT1丰度。
以上任一所述ROCK激酶活性为外周血单个核细胞的细胞总蛋白中的P-MYPT1/MYPT1。
以上任一所述ROCK激酶活性为外周血单个核细胞的细胞总蛋白中的P-MYPT1丰度/MYPT1丰度。
本发明的发明人发现，血管炎患者中肺损害亚组患者较皮肤损害亚组患者ROCK激酶活性升高，提示ROCK激酶的活性程度可能与肺损害密切相关。本发明对于肺损害患者的辅助诊断，肺损害患者的辅助筛查，均具有重大的应用价值。
附图说明
图1为某一例正常组入组者、某一例皮肤损害亚组入组者、某一例肺损害亚组入组者的Western-Blot显影图。
图2为正常组、皮肤损害亚组、肺损害亚组的ROCK激酶活性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
正常组由95例健康人组成。健康人入组标准：选取同期于首都医科大学附属北京朝阳医院体检中心体检的健康志愿者95例；志愿者入组前需排除既往有肝肾疾病史、糖尿病或其他自身免疫性疾病病史以及肿瘤病史。
血管炎组由45例血管炎患者组成。血管炎组入组标准：2016年10月至2019年12月期间于首都医科大学附属北京朝阳医院就诊的初诊血管炎患者45例，所有患者均来自于首都医科大学附属北京朝阳医院皮肤科、风湿免疫科、呼吸科门诊及住院系统；所有患者均符合2012版CHCC命名体系，1990年美国风湿病学会(ACR)诊断标准、国际诊断标准以及典型临床及组织病理学表现；在入组前均需取得患者同意并签署知情同意书，同时需要收集患者信息及资料，如身高、体重、发病时间，诊疗经过，实验室以及影像学检查结果等。
血管炎组根据累计部位分成2个亚组：皮肤损害亚组(28例)、肺损害亚组(17例)。血管炎累及皮肤损害的诊断标准：符合血管炎诊断标准，并出现各疾病相应的皮肤受累表现和(或)皮肤组织病理检查符合血管炎改变，且无其他系统受累。血管炎累及肺损害的诊断标准：符合血管炎诊断标准，并符合以下肺部病变之一：肺部结节、胸膜炎或胸腔积液、肺血管炎、弥漫性肺泡出血、肺动脉高压、肺栓塞、间质性肺病，且无其他系统受累(所述其它系统不包括皮肤和肺)。
实施例1、ROCK激酶活性的检测
研究对象：正常组和血管炎组。
1、分别取各位入组者的外周静脉血，分离外周血单个核细胞(PBMCs)。
2、取步骤1得到的外周血单个核细胞，加入淋巴细胞裂解液，冰上孵育20min(每隔5min吹打一次)，然后4℃、12000r/min离心5min，吸取上清液，即为细胞总蛋白溶液。淋巴细胞裂解液：RIPA裂解液1ml、50×cocktail蛋白酶抑制剂20μl、PMSF 10μl、磷酸化酶抑制剂A液10μl、磷酸化酶抑制剂B液10μl。
3、取步骤2得到的细胞总蛋白溶液，利用BCA法检测蛋白浓度以确定上样量。
4、进行蛋白质印迹法(Western-Blot)，使PBMCs中P-MYPT1和MYPT1和β-Actin的蛋白条带显影。β-Actin为内参。
SDS-PAGE参数：8％分离胶，5％浓缩胶；初始电压为80V，当蛋白跑至浓缩胶-分离胶界面时，调整电压为120V，然后继续电泳约30min，直至观察到蛋白maker及蓝色蛋白条带跑至凝胶底部时关闭电源，停止电泳。
用于检测P-MYPT1：一抗为Phospho-MYPT1抗体，一抗工作浓度为1:1000倍稀释，美国Cell Signaling生物，货号为#4563；二抗为辣根酶标记羊抗兔IgG抗体，二抗工作浓度为1:1000倍稀释，北京中杉金桥生物技术公司，货号为ZB-2301。
用于检测MYPT1：一抗为MYPT1抗体，一抗工作浓度为1:1000倍稀释，美国CellSignaling生物，货号为#2634；二抗为辣根酶标记羊抗兔IgG抗体，二抗工作浓度为1:1000倍稀释，北京中杉金桥生物技术公司，货号为ZB-2301。
显影方式为ECL化学发光显影。
示例性的，某一例正常组入组者、某一例皮肤损害亚组入组者、某一例肺损害亚组入组者的Western-Blot显影图见图1。
5、利用Image J软件分析Western-Blot显影图中蛋白条带的灰度值，用P-MYPT1/MYPT1代表ROCK激酶活性。
正常组各位受试者的ROCK激酶活性见表1。
血管炎组各位受试者的ROCK激酶活性见表2。
正常组、皮肤损害亚组、肺损害亚组的ROCK激酶活性见表3和图2。
肺损害亚组、皮肤损害亚组均较正常组ROCK激酶活性明显升高(p<0.05)。
肺损害亚组较皮肤损害亚组ROCK激酶活性明显升高。
将ROCK激酶活性＞0.72作为诊断血管炎患者中肺损害的阈值，假阴性率为1/17，假阳性率为2/28。
表1
表2
表3
组别 Rock激酶活性
肺损害亚组 0.81±0.05
皮肤损害亚组 0.68±0.05
正常组 0.38±0.01

Claims (5)

1.用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断血管炎累及的肺损害。
2.用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为筛查或辅助筛查血管炎累及的肺损害患者。
3.用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断血管炎患者中血管炎累及的肺损害患者。
4.用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为筛查或辅助筛查血管炎患者中血管炎累及的肺损害患者。
5.如权利要求1至4中任一所述的应用，其特征在于：所述ROCK激酶活性为P-MYPT1丰度/MYPT1丰度。
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