CN111686307A - 生物导电纳米纤维组织工程支架的制备方法 - Google Patents

生物导电纳米纤维组织工程支架的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物导电纳米纤维组织工程支架的制备方法。所述方法将碱基功能化肝素接枝于氨基化碳纳米管中，实现了碳纳米管的氢键交联，得到结构稳定的生物导电纳米纤维组织工程支架材料。本发明方法简单、操作易行，固化速度快且处理周期短，避免了化学交联剂的使用，保证包埋药物的生物活性，制得的支架能够实现细胞生长因子的控释，在药物控释、组织工程与再生医学方面有应用前景。

Description

生物导电纳米纤维组织工程支架的制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种生物导电纳米纤维组织工程支架的制备方法。
背景技术
组织工程支架作为细胞生长的模板，刺激细胞的增殖和浸润，并支持新生组织的形成，控制组织的结构，是决定组织构建成败的关键之一。现有的支架材料主要包括三类：天然高分子材料如胶原、壳聚糖等，合成高分子材料如聚氨酯、聚乳酸等，无机材料如羟基磷灰石、生物玻璃等。这三类材料在组织工程研究中应用较为广泛，但应用过程中亦暴露出各自的一些问题。其中，天然高分子材料通常机械性能不够理想，电学性能不良；合成高分子材料亲水性及力学性能较差，或材料结构促细胞增殖能力欠佳；而无机材料硬度过高，脆性过大。这些缺点致使单一材料制备的组织工程支架不能达到应用要求。因此，复合支架的研究日益受到学者们的重视。
碳纳米管是由一层或者多层石墨片层按照一定螺旋角卷曲而成的直径为纳米量级的无缝管，按结构分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管。由于其独特的结构，碳纳米管作为支架材料应用时显示出显著的优越性：由六边形碳原子网格围成中空管体的碳纳米管的三维多孔结构提高了面积/体积比，进而在同体积前提下增大了可供细胞附着的表面积；互联的多孔网状结构为营养物质与代谢废物的交换提供了通道；碳纳米管可以通过改变管径、管长、螺旋结构卷曲度等参数改变其导电性，促进细胞间信号的传导，甚至引起某些细胞的生理变化；碳纳米管的近红外荧光特性使其在近红外区域有荧光信号，而在这个区域细胞本底荧光较小，不会产生干扰，有利于研究者观察支架中细胞的生长状况；碳纳米管补强作用显著，在复合材料中加入碳纳米管后，材料的强度可以发生数量级的改变。但是，碳纳米管作为单纯支架材料存在应用缺点，其轴向强度、韧性和弹性模量均远高于人体骨组织，与人体组织不匹配，培养出来的再生骨组织植入人体后将很难正常行使功能。此外，碳纳米管还有一定的毒性副作用，可引发免疫反应；同时，碳纳米管在体内难于降解排出，可能长期存留诱发炎症反应。通过与其他材料的复合应用，碳纳米管的上述缺点有望克服。
文献1(化工新型材料，2016，44(2)：216～218)利用静电纺丝技术，在聚乳酸溶液中加入多壁碳纳米管，制备出一种具有导电功能的复合型纤维，提高了聚乳酸纤维膜的力学和导电性能，并用于心肌细胞培养。结果表明，含3％碳纳米管的复合支架具有最佳的综合性能，能够确保心肌细胞的动作电位迅速准确地通过纤维支架进行传导。心肌细胞在支架纤维上展示出较好的粘附性和生长能力，能在8天的体外培养中持续表达心肌特征蛋白。
文献2(中华显微外科杂志，2011，34(4)：301～304)中采用溶液共混、冷冻干燥技术，将多壁碳纳米管、纳米羟基磷灰石、壳聚糖三种材料复合，制备出一种三组分的复合支架。多壁碳纳米管的加入可明显提高支架的断裂强度，而对支架的孔隙率影响较小。该碳纳米管/纳米羟基磷灰石/壳聚糖三组分复合支架具有较好的机械性能，合适的孔径大小。细胞相容性实验结果显示，兔骨髓间充质干细胞在复合支架上可以黏附、增殖，表现出了优异的促进细胞增殖能力。
文献3(青岛大学医学院学报，2014，50(2)：105～108)报道了一种复合碳纳米管骨组织工程支架，这种支架是将富含血小板血浆融入碳纳米管内而制成，同时复合骨髓基质干细胞。将富含血小板血浆融入碳纳米管支架中，使支架具备促进骨修复的大量细胞因子，能促进间充质干细胞的增殖和分化，使其具有良好的骨缺损修复能力，并能使成骨细胞可完全符合人体生物力学性能排列生长。在植入初期，较高浓度的血浆对骨髓基质干细胞增殖起促进作用，对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化起到抑制作用，随着血浆的降解其促进增殖作用逐渐减弱，对分化的抑制作用减弱，大量骨髓基质干细胞可向成骨细胞分化，从而促进骨缺损区的成骨细胞生成。
文献4(吉林大学学报，2008，38(4)：844～847)首先采用气相氧化法及液相氧化法制备了带有羧基的多壁碳纳米管；然后在超声波辅助下，通过原位合成法将纳米羟基磷灰石包覆在改性碳纳米管上；最后与聚乳酸熔融共混，制备出一种纳米骨修复材料。改性的碳纳米管与纳米羟基磷灰石有较好的相容性，复合后对羟基磷灰石的性能无明显影响，且制备的改性纳米骨材料的亲水性得到了改善。随着改性碳纳米管的增加，材料的力学性能先提高后下降，当其质量分数为0.5时达最高点。而随着改性碳纳米管/纳米羟基磷灰石粒子的增加，复合材料的断裂强度呈现由快到慢的下降趋势。
上述碳纳米管复合支架材料的制备方法存在以下缺陷：
(1)碳纳米管参与复合材料的研究局限于二者的机械共混，或简单的表面处理，难以与基体形成稳定的结合，无法保证材料结构和性能的稳定性；
(2)制备的纳米支架材料难以结合细胞生长因子，或载药量小、易失活、缓释性能差，导致在人体内应用效果不佳，难以完全达到干细胞骨分化的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物导电纳米纤维组织工程支架的制备方法，该方法采用化学接枝与分子自主装技术，通过碱基对氢键作用，实现纳米纤维的无毒交联，保证材料的使用安全性，该支架结合药物传递与电学刺激作用，能够实现定向诱导干细胞分化。
实现本发明目的的技术解决方案为：
生物导电纳米纤维组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，在肝素溶液中分别滴加胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，搅拌反应后用乙酸乙酯萃取，蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
步骤2，将氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分散于水中，分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，室温搅拌反应后透析，氨基化碳纳米管分别与胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素的质量比为1：1.2～3，冻干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
步骤3，分别在胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液中加入骨形态发生蛋白，等体积混合交联形成支架材料。
步骤1中，所述的肝素溶液的质量浓度为0.6～2％g/mL，胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液的质量浓度为0.1～0.2％g/mL，胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液的体积为肝素溶液的1/5～1/2，反应温度为50℃～80℃，搅拌时间为12～24小时。
步骤2中，所述的氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为等质量，氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量浓度均为0.4～2％g/mL，搅拌反应时间为12～24小时。
步骤3中，所述的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液的质量浓度为0.5～3％g/mL，加入骨形态发生蛋白的浓度是50～200ng/mL。
本发明与现有技术相比，其显著优点是：
(1)纳米纤维材料经过碱基对氢键作用交联而得，交联过程中不与细胞生长因子发生化学反应，同时引入了肝素分子，有效保持细胞生长因子的生物活性；
(2)对碳纳米管进行表面处理及化学接枝改性，分散性好，材料结构和性能稳定，载药量大、包封率高，并具有良好的缓释性能，满足细胞生长因子的传递要求；
(3)避免使用了有毒化学交联剂，杜绝了纳米纤维材料中的毒性残留，保证了材料的安全性，本发明方法具有制备温度低和处理周期短等优点，适合商业化生产。
附图说明
图1是本发明的生物导电纳米纤维组织工程支架材料的制备示意图。
图2是实施例1制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的扫描电子显微图。
图3是实施例1制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的纤维直径分布图。
图4是实施例1制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的导电曲线。
图5是实施例1制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的体外失重曲线。
图6是实施例1制得的生物导电纳米纤维组织工程中细胞生长因子从支架累计释放的曲线。
图7是实施例1制得的生物导电纳米纤维组织工程支架对人体脂肪干细胞定向骨分化的扫描电子显微图。
图8为实施例2制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的体外失重曲线。
图9为实施例3制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的体外失重曲线。
图10为实施例4制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的体外失重曲线。
图11为实施例5制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的体外失重曲线。
图12为实施例6制得的生物导电纳米纤维组织工程支架的体外失重曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
本发明实施例中采用的试剂：肝素、胸腺嘧啶、腺嘌呤、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，购于美国Sigma公司；骨形态发生蛋白(BMP-2)、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，购于美国R&D Systems公司；乙酸乙酯，分析纯，南京化学试剂有限公司；盐酸、氨水，分析纯，上海化学试剂厂。氯化钠、氯化钾，分析纯，上海试剂三厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，分析纯，杭州化学试剂有限公司。
形貌观察：将干燥后的导电纳米纤维组织工程支架在扫描电子显微镜(JSM-6330F，JEOL)上观察微观形貌，同时测量纤维直径。
支架失重及药物释放：将支架置于37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在不同时间点取出称重并吸取磷酸盐缓冲液，按照酶联免疫吸附测定试剂盒标准操作流程执行定量分析。所用磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取分析纯氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸氢二钠2.9克、磷酸二氢钾0.2克，溶于1000毫升蒸馏水中。下述实施例中的质量浓度的单位均为g/mL，即1％系指1g物质溶于100mL溶剂(例如水)中。
实施例1
(1)配制质量浓度为0.6％的肝素溶液，分别滴加质量浓度为0.1％的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/5，在50℃搅拌反应12小时，用氨水将反应液调至中性后用乙酸乙酯萃取，最后蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
(2)将等量氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐同时分散于水中，得到质量浓度为0.4％的反应溶液，然后分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，质量浓度为碳纳米管的1.2倍，室温搅拌反应12小时，透析冻干后分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
(3)分别配制质量浓度为3％的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液，随后加入50ng/mL的骨形态发生蛋白，最后等体积混合交联形成支架材料。
作为对照，按上述步骤，但不添加碳纳米管制备肝素支架。
制得的纳米支架的形貌见图2，纤维直径分布见图3，结果显示纳米纤维直径分布均匀，平均直径为80nm，表明碱基氢键交联的材料具有稳定的结构。图4为纳米支架的导电曲线，可看出材料的导电性能与碳纳米管浓度正相关，其导电率与电压呈线性关系。图5为纳米支架的体外失重曲线，说明材料的结构比较稳定，显著优于不含碳纳米管的肝素支架。图6为骨形态发生蛋白从纳米支架中的释放行为，结果显示3周内骨形态发生蛋白累积释放量约为23％，具有良好的缓释性能，表明材料中的肝素组分能有效结合骨形态发生蛋白，酶联免疫结果同时显示蛋白药物的生物活性良好。图7是支架对人体脂肪干细胞定向骨分化的扫描电子显微图。培养14天后，成功地将人体脂肪干细胞分化为多角形态的骨细胞，证实了该纳米导电纤维支架材料的有效性。
实施例2
(1)配制质量浓度为2％的肝素溶液，分别滴加质量浓度为0.2％的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/2，在80℃搅拌反应24小时，用氨水将反应液调至中性后用乙酸乙酯萃取，最后蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
(2)将等量氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐同时分散于水中，得到质量浓度为2％的反应溶液，然后分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，质量浓度为碳纳米管的3倍，室温搅拌反应24小时，透析冻干后分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
(3)分别配制质量浓度为0.5％的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液，随后加入200ng/mL的骨形态发生蛋白，最后等体积混合交联形成支架材料。图8为该纳米支架的体外失重曲线，说明材料的结构比较稳定，显著优于不含碳纳米管的肝素支架。
实施例3
(1)配制质量浓度为0.8％的肝素溶液，分别滴加质量浓度为0.15％的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/3，在60℃搅拌反应18小时，用氨水将反应液调至中性后用乙酸乙酯萃取，最后蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
(2)将等量氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐同时分散于水中，得到质量浓度为0.6％的反应溶液，然后分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，质量浓度为碳纳米管的2倍，室温搅拌反应18小时，透析冻干后分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
(3)分别配制质量浓度为1％的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液，随后加入100ng/mL的骨形态发生蛋白，最后等体积混合交联形成支架材料。图9为该纳米支架的体外失重曲线，说明材料的结构比较稳定，显著优于不含碳纳米管的肝素支架。
实施例4
(1)配制质量浓度为1％的肝素溶液，分别滴加质量浓度为0.2％的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/4，在70℃搅拌反应16小时，用氨水将反应液调至中性后用乙酸乙酯萃取，最后蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
(2)将等量氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐同时分散于水中，得到质量浓度为0.8％的反应溶液，然后分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，质量浓度为碳纳米管的1.5倍，室温搅拌反应16小时，透析冻干后分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
(3)分别配制质量浓度为1％的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液，随后加入150ng/mL的骨形态发生蛋白，最后等体积混合交联形成支架材料。图10为该纳米支架的体外失重曲线，说明材料的结构比较稳定。
实施例5
(1)配制质量浓度为1.5％的肝素溶液，分别滴加质量浓度为0.1％的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/5，在80℃搅拌反应20小时，用氨水将反应液调至中性后用乙酸乙酯萃取，最后蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
(2)将等量氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐同时分散于水中，得到质量浓度为1％的反应溶液，然后分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，质量浓度为碳纳米管的2倍，室温搅拌反应20小时，透析冻干后分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
(3)分别配制质量浓度为1.5％的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液，随后加入180ng/mL的骨形态发生蛋白，最后等体积混合交联形成支架材料。图11为该纳米支架的体外失重曲线，说明材料的结构比较稳定。
实施例6
(1)配制质量浓度为1.8％的肝素溶液，分别滴加质量浓度为0.18％的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/2，在80℃搅拌反应24小时，用氨水将反应液调至中性后用乙酸乙酯萃取，最后蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
(2)将等量氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐同时分散于水中，得到质量浓度为1.8％的反应溶液，然后分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，质量浓度为碳纳米管的2.5倍，室温搅拌反应24小时，透析冻干后分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
(3)分别配制质量浓度为2％的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液，随后加入200ng/mL的骨形态发生蛋白，最后等体积混合交联形成支架材料。图12为该纳米支架的体外失重曲线，说明材料的结构比较稳定。
采用本发明发至制备三维支架材料，胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素的质量需为氨基化碳纳米管的质量的1.2～3倍。否则溶液无法实现有效交联，形成不了支架。
对比例1
(1)配制质量浓度为1％的肝素溶液，分别滴加质量浓度为0.2％的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/5，在50℃搅拌反应12小时，用氨水将反应液调至中性后用乙酸乙酯萃取，最后蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
(2)将等量氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐同时分散于水中，得到质量浓度为2％的反应溶液，然后分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，质量浓度为碳纳米管的0.8倍，室温搅拌反应24小时，透析冻干后分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
(3)分别配制质量浓度为3％的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液，随后加入200ng/mL的骨形态发生蛋白，最后等体积混合，未见形成支架。
对比例2
(1)配制质量浓度为2％的肝素溶液，分别滴加质量浓度为0.1％的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/2，在80℃搅拌反应24小时，用氨水将反应液调至中性后用乙酸乙酯萃取，最后蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
(2)将等量氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐同时分散于水中，得到质量浓度为0.4％的反应溶液，然后分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，质量浓度为碳纳米管的4倍，室温搅拌反应24小时，透析冻干后分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
(3)分别配制质量浓度为0.5％的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液，随后加入50ng/mL的骨形态发生蛋白，最后等体积混合，未见交联。
对比例3
本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的是氨基化碳纳米管的浓度为0.2％。结果未见形成支架。
对比例4
本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的是氨基化碳纳米管的浓度为4％。碳纳米管浓度过高，容易形成团聚和沉淀，也不利于形成支架，未见形成支架。

Claims (10)

1.生物导电纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在肝素溶液中分别滴加胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液，搅拌反应后用乙酸乙酯萃取，蒸干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素；
步骤2，将氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分散于水中，分别添加胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素，室温搅拌反应后透析，氨基化碳纳米管分别与胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素的质量比为1：1.2～3，冻干分别得到胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物；
步骤3，分别在胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液中加入骨形态发生蛋白，等体积混合交联形成支架材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的肝素溶液的质量浓度为0.6～2％g/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液的质量浓度为0.1～0.2％g/mL。
4.根据权利要求1至3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的胸腺嘧啶和腺嘌呤盐酸溶液的体积为肝素溶液的1/5～1/2。
5.根据权利要求1至3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，反应温度为50℃～80℃，搅拌时间为12～24小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述的氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为等质量。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，氨基化碳纳米管和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量浓度均为0.4～2％g/mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，搅拌反应时间为12～24小时。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述的胸腺嘧啶和腺嘌呤功能化肝素/碳纳米管复合物水溶液的质量浓度为0.5～3％g/mL。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，加入骨形态发生蛋白的浓度是50～200ng/mL。
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