CN111683667A - 用于减少或关停非人哺乳动物中的泌乳的方法及其试剂 - Google Patents
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Abstract
本公开总体上涉及用于减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的方法和试剂。具体而言，本公开涉及在非人哺乳动物受试者中通过乳房内输注向所述受试者施用激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂而减少或关停泌乳的方法。在一些实例中，本公开的方法和试剂可以用于预防非人哺乳动物受试者诸如奶牛中的乳腺炎。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2017年9月12日提交的美国临时第62/557,280 号的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及用于减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的方法和试剂。具体而言，本公开涉及在非人哺乳动物受试者中通过乳房内输注向所述受试者施用激活OAS2信号传导途径或诱导 OAS2表达的剂而减少或关停泌乳的方法。在一些实例中，本公开的方法和试剂可以用于预防非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。
背景技术
乳腺炎(乳腺或乳房炎症)是一种常见的严重问题，尤其是在乳品业中。对牛乳腺炎的易感性可能是以通过几种类型的损伤和身体创伤、化学刺激或与断奶期间乳房充盈相关的炎症而产生，并且因细菌性病原体引入而引起的乳房内细菌感染而迅速进展。乳腺炎具有高患病率(高达50％)并且由各种革兰氏阳性细菌诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或乳房链球菌(Streptococcus uberis)，革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，和支原体(诸如牛支原体(M.bovis)引起。
乳腺炎造成乳汁中的组成变化，包括体细胞计数(SCC)增加。来自正常(未感染的)母牛的乳汁通常含有低于200,000个体细胞/ml。在 SCC升高时，高于300,000个体细胞/ml是异常的并且是牛乳房炎症的指征。乳汁中存在的体细胞的类型主要变成白细胞，从而向乳汁中增加了许多蛋白水解酶和脂肪分解酶。另外，比平常有更多的血清渗漏到乳汁中。因乳腺炎产生的乳制品质量缺陷是由于乳蛋白和脂肪的酶促分解所致。酪蛋白(高营养品质的主要乳蛋白)下降而低品质的乳清蛋白增加，这对乳制品品质，诸如干酪产量、风味和质量产生不利影响。在来自患有临床或亚临床乳腺炎的母牛中由于蛋白水解酶的存在可发生乳汁中蛋白质分解。乳腺炎期间纤溶酶使蛋白水解活性增加超过2倍。取乳之前，纤溶酶和源自体细胞的酶可对牛乳房内的酪蛋白造成破坏。在加工和储存来自受感染母牛的乳汁期间，乳蛋白的劣化也可能继续。乳汁中其它组成变化包括钾和钙水平的降低。
乳腺炎是乳品业中代价最高的单一疾病，并且导致美国乳品业每年损失约20亿美元或导致美国总产乳量损失11％。代价包括产乳量减少、丢弃乳汁、更换母牛、药物治疗、人工和兽医服务。
目前，乳腺炎用抗生素、消炎药和催产素来治疗。然而，这些治疗往往很耗时(有时连续几次的乳房内施加)、昂贵且并非完全有效。
与其治疗乳腺炎，倒不如优选降低乳腺炎的发病率或预防乳腺炎。虽然乳腺炎的发病率可以通过使用(例如)挤奶前乳头杀菌浸液而降低，但是没有一种产品是预防乳腺炎普遍有效的。因而，在乳品业中需要更多且更有效的预防性产品和实践来降低乳腺炎的发病率。
发明内容
使用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变和对泌乳衰竭的正向遗传筛选，本发明人建立了小鼠系，其中杂合母鼠显示出泌乳差的部分外显率，产生无法茁壮成长的同窝仔，并且纯合母鼠经历泌乳完全失败，提供了显性遗传模式。本发明人也能够在OAS2催化结构域的保守区域中鉴定OAS2的非同义突变(I405N)，该突变在突变小鼠中引起泌乳衰竭和乳汁淤滞。
在表征小鼠泌乳衰竭模型的进一步实验中，发明人证明OAS2突变引起OAS2驱动的信号传导的激活，以防止在产后期完全激活泌乳。可以经由来自妊娠中期的Stat1激活检测突变的作用，并且乳腺上皮移植物显示该作用是乳腺细胞自主的，因为只在乳腺上皮细胞中需要该突变以发挥作用。发明人发现刺激OAS2途径可以产生持续的干扰素响应和降低的STAT5激活，这是在产后期期间激活乳汁分泌必不可少的。在此基础上，发明人得出的结论是，OAS2途径参与泌乳衰竭和乳汁淤滞的发病，并且OAS2激活剂因此可以用于减少或关停泌乳。
为了测试这一点，发明人进行了动物实验，其中通过乳房内输注向泌乳小鼠的乳腺施用代表性的OAS2激活剂，即病毒模拟物，聚 (I:C)。通过这样做，发明人能够首次证实，OAS2激活剂在通过经由乳头和主乳腺导管/乳窦向泌乳动物施用时可以用于减少或关停泌乳。重要的是，OAS2激活剂的施用导致产乳停止，乳腺上皮细胞过早退化和乳腺组织重建，使得腺泡结构压缩。重要的是，由于输注 OAS2激活剂已停止产乳的乳腺区域可以在后续妊娠后恢复并且变得完全能够泌乳，因此证明OAS2激活剂的作用不是永久性的。
鉴于乳腺炎在乳品业中的重要性，发明人在一群奶牛中进行了类似的实验，并且能够证实将聚I:C乳房内输注到荷斯坦奶牛(Holstein dairy cow)乳房中引起瞬时免疫刺激和抑制泌乳，而没有不良副作用。
因此，本公开提供了一种减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的方法，所述方法包括向所述受试者的乳腺施用在所述受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂。
在一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂是干扰素或干扰素诱导剂。例如，所述方法可包括向所述受试者的乳腺施用干扰素。例如，所述方法可包括向所述受试者的乳腺施用干扰素诱导剂。
在一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的干扰素诱导剂是toll样受体(TLR)激动剂。例如，所述TLR激动剂可以选自由以下组成的组：聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚(I:C))或其衍生物，所述衍生物选自聚I:聚C(12)U和用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-ICLC)；聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A:U)、细菌脂多糖(LPS)；单磷酰脂质A(MPL)；CpG二核苷酸(CpG-ODN)；细菌鞭毛蛋白；和前纤维蛋白。在一个特定实例，在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是聚(I:C)或其衍生物，例如所述衍生物选自聚I:聚C(12)U和用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-ICLC)。在一个实例中，在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是聚(I:C)。TLR激动剂可以以至少约 1mg的剂量施用至乳腺。例如，TLR激动剂可以以至少约1mg至约50mg的剂量施用至乳腺。例如，TLR激动剂可以以至少约1mg至约 10mg的剂量施用至乳腺。在一个特定实例中，TLR激动剂是聚(I:C)，其以约1mg至约50mg的剂量施用至乳腺。在另一个实例中，将聚(I:C) 以约1mg至约10mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约 1mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约2mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约3mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约4mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约 5mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约6mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约7mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约8mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约 9mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约10mg的剂量施用至乳腺。在另一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的干扰素诱导剂是干扰素基因(STING、TMEM173)的刺激物或 STING激动剂。
在另一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的干扰素诱导剂是RNA酶L或RNA酶L激活剂。
在一个实例中，在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2 表达的剂以足以减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的量施用。
根据本文所述的任何实例，将剂施用至非人哺乳动物受试者的乳腺是通过乳房内输注，例如，直接导管内输注至主乳窦或输乳管中来进行。
在一个实例中，所述方法包括向非人哺乳动物受试者施用单剂量的所述剂，从而减少或关停泌乳。
在另一个实例中，所述方法包括施用重复剂量的所述剂，直至减少或关停泌乳。例如，可以每天向非人哺乳动物受试者施用所述剂，直至减少或关停泌乳。例如，可以每两天向非人哺乳动物受试者施用所述剂，直至减少或关停泌乳。例如，可以每三天向非人哺乳动物受试者施用所述剂，直至减少或关停泌乳。例如，可以每周向非人哺乳动物受试者施用所述剂，直至减少或关停泌乳。
在一个实例中，例如通过进行如本文所述的方法减少或关停泌乳，预防非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。根据该实例，在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂能够在不施用抗微生物剂的情况下预防非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。因此，在一个实例中，本公开的方法不包括向非人哺乳动物受试者施用抗微生物剂。也就是说，所述方法可以包括向非人哺乳动物受试者施用激活 OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂而不包括施用抗微生物剂。在一个实例中，本公开的方法基本上由以下步骤组成：通过乳房内输注向非人哺乳动物受试者的乳腺施用在受试者的乳腺中激活 OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂。
在替代实例中，本公开的方法还包括例如通过乳房内输注向非人哺乳动物受试者施用抗微生物剂，以预防受试者乳腺中的微生物感染。根据该实例，在乳腺中施用抗微生物剂作为抵抗微生物感染(例如细菌感染)的预防剂或防御剂，而施用激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是为了减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳。在一个实例中，抗微生物剂和在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂可以单独地(例如依序)施用。在另一个实例中，抗微生物剂可以与在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂一起(例如，在同一制剂中)施用。
在一个实例中，本公开的方法不包括向非人哺乳动物受试者施用关停或减少泌乳的附加剂。
在另一个实例中，本公开的方法还包括向非人哺乳动物受试者施用关停或减少泌乳的另一剂。在一个实例中，关停或减少泌乳的所述另一剂和在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂可以单独地(例如依序)施用。在另一个实例中，关停或减少泌乳的所述另一剂可以与在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂一起(例如，在同一制剂中)施用。
在一个实例中，可以对其进行本公开的方法的非人哺乳动物受试者是家畜动物，例如用于生产供人类消耗的乳汁的反刍动物。例如，非人哺乳动物受试者可以是奶牛。
在一个实例中，可以对其进行本公开的方法的非人哺乳动物受试者是是伴侣动物。例如，所述伴侣动物可以选自由猫、狗、马、啮齿动物和兔组成的组。
在一个实例中，可以对其进行本公开的方法的非人哺乳动物受试者是役用动物。例如，所述役用动物可以选自由马、狗、骡、驴、骆驼、公牛和猪组成的组。
在一个实例中，可以对其进行本公开的方法的非人哺乳动物受试者是运动动物。例如，所述运动动物可以是马或狗。
在前述实例中的任何一个或多个中，对其进行本公开的方法的非人哺乳动物受试者处于泌乳期，但未患乳腺炎。
可替代地，对其进行本公开的方法的非人哺乳动物受试者处于泌乳期且患有乳腺炎。根据该实例，本公开的方法关停或减少患有乳腺炎的非人哺乳动物受试者中的泌乳。
本公开还提供了一种预防泌乳而未患乳腺炎的非人哺乳动物受试者中的乳腺炎的方法，其包括通过进行如本文所述的减少或关停泌乳的方法，减少或关停所述非人哺乳动物受试者中的泌乳。
本公开还提供了一种乳房内兽用组合物，其包含在非人哺乳动物受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂和药学上可接受的赋形剂或载体，其中所述剂以足以减少或关停所述非人哺乳动物受试者中的泌乳的量存在。
在乳房内兽用组合物的一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂是干扰素或干扰素诱导剂。在一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂是干扰素。在一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂是干扰素诱导剂。
在乳房内兽用组合物的一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的干扰素诱导剂是TLR激动剂。例如，所述TLR激动剂可以选自由以下组成的组：聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚(I:C))或其衍生物，所述衍生物选自聚I:聚C(12)U和用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-ICLC)；聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A:U)、细菌脂多糖(LPS)；单磷酰脂质A(MPL)；CpG二核苷酸(CpG-ODN)；细菌鞭毛蛋白；和前纤维蛋白。在一个特定实例，在乳腺中激活OAS2 信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是聚(I:C)或其衍生物，例如所述衍生物选自聚I:聚C(12)U和用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-ICLC)。在一个实例中，在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是聚(I:C)。TLR激动剂可以以至少约1mg的剂量施用至乳腺。例如，TLR激动剂可以以至少约1mg至约50mg的剂量施用至乳腺。例如，TLR激动剂可以以至少约1mg 至约10mg的剂量施用至乳腺。在一个特定实例中，TLR激动剂是聚 (I:C)，将其以约1mg至约50mg的剂量施用至乳腺。在另一个实例中，将聚(I:C)以约1mg至约10mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C) 以约1mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约2mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约3mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约4mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C) 以约5mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约6mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约7mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约8mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C) 以约9mg的剂量施用至乳腺。例如，可以将聚(I:C)以约10mg的剂量施用至乳腺。
在乳房内兽用组合物的一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的干扰素诱导剂是干扰素基因(STING)的刺激物或 STING激动剂。
在乳房内兽用组合物的另一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的干扰素诱导剂是RNA酶L或RNA酶L激活剂。
在乳房内兽用组合物的一个实例中，在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂以足以减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的量存在。例如，在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂以足以在不存在任何其它活性成分(例如抗微生物剂)的情况下减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的量存在。
在一个实例中，乳房内兽用组合物基本上由激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂组成。在一个实例中，乳房内兽用组合物不含有另外的活性成分，例如抗微生物剂。
在一个实例中，乳房内兽用制剂还可包含例如适于乳房内输注的抗微生物剂，以预防施用该制剂的受试者的乳腺中的微生物感染。根据该实例，制剂中包括抗微生物剂作为抵抗乳腺中微生物感染(例如细菌感染)的预防剂或防御剂，而制剂中包括激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是为了减少或关停施用该制剂的非人哺乳动物受试者中的泌乳。
在另一个实例中，兽用制剂还包含关停或减少泌乳的另一剂，即除了在非人哺乳动物受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂以外。在一个实例中，所述另一剂是血清素-选择性再摄取抑制剂(SSRI)。
本公开还提供了用于例如根据本文所述的方法，减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的本公开的乳房内兽用组合物。
本公开还提供了例如根据本文所述的方法，用于预防未患乳腺炎的泌乳非人哺乳动物受试者中的乳腺炎的本公开的乳房内兽用组合物。
在一个实例中，乳房内兽用组合物是用于在不存在抗微生物剂的情况下预防非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。
本公开还提供了激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂在制备用于减少或关停有需要的非人哺乳动物受试者中的泌乳的药物中的用途。
本公开还提供了激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂在制备用于预防未患乳腺炎的非人哺乳动物受试者中的乳腺炎的药物中的用途。
本文描述了激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的示例性剂并且除非另外特别说明，否则应视为加以必要的变通适用于本公开的任何其它实例。
本公开还提供了一种用于减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的药盒，所述药盒包括：
(i)如本文所述的乳房内兽用组合物；和
(ii)通过乳房内输注(例如，根据本文所述的方法)向非人哺乳动物受试者施用所述乳房内兽用组合物的说明书。
在一个实例中，所述药盒是用于预防未患乳腺炎的非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。
在另一个实例中，所述药盒是用于减少或关停需要干乳的患有乳腺炎的非人哺乳动物中的泌乳。
附图说明
图1示出了通过幼崽体重增加或存活率(插图)评估的野生型 (wt/wt)、杂合突变体(wt/mt)和纯合突变体(mt/mt)母鼠的泌乳性能。误差条示出每种基因型4-5窝各7只幼崽的平均值的标准误差。wt/wt n＝35，wt/mt n＝28且mt/mt n＝28只幼崽。
图2说明了OAS2中ENU诱导的SNP突变，该突变导致异亮氨酸变为天冬酰胺。
图3说明了(A)OAS2中产生氨基酸变化的SNP突变，(B)在包括古细菌(Archaea)在内的非常多样性的物种中含有该突变的区域的保守性，以及(C)该突变相对于OAS2酶活性位点的位置。
图4说明了野生型小鼠乳腺中在乳腺发育的各个阶段通过定量 PCR测量的OAS2和RNA酶L表达的模式。
图5提供了野生型小鼠乳腺中OAS2的免疫组织化学分析。
图6说明了在乳腺发育的关键阶段的乳腺表型。(A)第四腹股沟乳腺的全形包埋组织学分析，显示了成熟的未交配小鼠(8-10周龄)中的导管发育以及野生型小鼠(wt/wt)或纯合突变体小鼠(mt/mt)中交配后12.5天(dpc)、18.5dpc和产后2天(2dpp)的小叶泡发育。(B)相应的苏木精-伊红组织化学分析。(C)使用针对小鼠全乳产生的抗体对乳蛋白表达进行的相应免疫组织化学分析。(D)使用抗小鼠乳抗体和角蛋白18上样对照获得的乳蛋白的相应蛋白质印迹。分子大小与所示乳蛋白的既定大小一起示出。乳铁蛋白(LF)，血清白蛋白(SA)，酪蛋白α、κ、β、γ和ε，乳清酸性蛋白(wap)和α-乳白蛋白(aLac)。
图7提供：(A和B)第四腹股沟乳腺的全形包埋组织学分析，分别显示了wt/wt或mt/mt小鼠产后2天(dpp)的小叶泡发育；(C和D) 相应的苏木精-伊红组织化学分析；以及(E和F)对乳蛋白表达进行的相应免疫组织化学分析。
图8是wt/wt和mt/mt小鼠产后2天(dpp)乳腺中表达的乳蛋白的蛋白质印迹。分子大小与所示乳蛋白的既定大小一起示出。乳铁蛋白 (LF)，血清白蛋白(SA)，酪蛋白α、κ、β、γ和ε，乳清酸性蛋白(wap) 和α-乳白蛋白(lac)。
图9呈现以下内容：(A)在wt/wt或mt/mt小鼠中通过qPCR进行的Wap mRNA定量；(B)通过qPCR进行的β-酪蛋白(β-Cas)mRNA 定量；(C)通过裂解的半胱天冬酶3的免疫组织化学分析对上皮细胞死亡的定量，结果是阳性染色上皮细胞的数量占每个视野上皮细胞总数的百分比；(D)通过表示为占每个视野上皮细胞总数的百分比的掺入BrdU对上皮细胞扩增的定量；(E和F)对wt/wt或mt/mt小鼠产后 2天(dpp)的磷酸化(P)Stat1表达的免疫组织化学分析；(G)通过免疫组织化学分析对wt/wt或mt/mt小鼠中P-Stat1表达的定量，结果是阳性染色上皮细胞的数量占总上皮面积的百分比；(H)通过免疫组织化学分析对wt/wt或mt/mt乳腺移植物中P-Stat1表达的定量，结果是阳性染色上皮细胞的数量占总上皮面积的百分比；(A-B和G)每个时间点 wt/wt n＝4-5只小鼠，mt/mt n＝3-5只小鼠，(H)每个时间点wt/wt n＝3-5 只小鼠，mt/mt n＝2-5只。给出了学生t检验p值，误差条是平均值的标准误差。
图10说明了OAS2突变对乳腺中基因表达总体模式的影响。纯合OAS2突变体(mt)或野生型(wt)动物的整个小鼠乳腺使用 Affymetrix MTA阵列来剖析。按照limma t-统计量对差异基因表达排序，并将这用作基因集富集分析的输入，以鉴定功能标签。使用Cytoscape的富集-图谱插件目测结果。每个节点表示一个基因集并且包含这些集合中的一些的前缘的基因的表达显示为t-统计量的热图。标记指示群集的基因集的功能。将mt动物与wt动物在2dpp(节点中心颜色)或18dpc(节点边缘颜色)的基因表达进行比较。
图11提供了用于鉴定功能表达标签的自组织映射：(A)小鼠乳腺中通过突变体或野生型OAS2表达诱导的基因表达变化，分为6种模式；和(B)上图的每种基因表达模式中唯一包含的相应官能团。每种类别(DAVID、MolSig DB标志集合、转录因子集合(TFT)、我们的退化和泌乳概况集合和MolSig DB途径集合)中的前5种功能显示为通过DAVID富集得分或来自超几何检验的BH校正p值评分。
图12是说明在泌乳期间通过导管内注射在乳房内输注聚(I:C)以激活OAS2信号传导途径并减少或关停泌乳的过程的示意图。(A)说明向小鼠上皮内施用聚(I:C)的实验时间表的示意图。(B)向小鼠腹股沟乳腺上皮内施用聚(I:C)的照片图示说明。dpc：交配后的天数，dpp：产后天数，箭标：注射部位，箭头：乳头。
图13说明乳房内输注聚(I:C)引起中性粒细胞聚集、腺泡萎陷、泌乳衰竭和过早退化。通过观察第4乳头周围皮肤下的近侧区域目测聚(I:C)的注射，当与同一乳腺的远侧区域比较时，近侧区域缺乏白色的乳汁充盈区(图A-C左手侧)图A-C右手侧的显微照片描绘了使用兔抗体进行的DAB+免疫组织化学分析，所述兔抗体是在注射了聚 (I:C)(左侧(L)乳腺)或媒介物对照(右侧(R)乳腺)的小鼠的腹股沟乳头近侧或远侧乳腺中针对小鼠乳汁产生的并且是在注射和强制退化后48小时(上图)、72小时(中图)或7天(下图)收集的。第3(轴向)内源性乳腺用作对照。
图14说明乳房内输注聚(I:C)引起中性粒细胞聚集、腺泡萎陷、泌乳衰竭和过早退化。显微照片描绘了使用兔抗体进行的DAB+免疫组织化学分析，所述兔抗体是在注射了在10μl和20μl体积的无菌 PBS中的单剂250ng或500ng聚(I:C)(左侧(L)乳腺)或媒介物对照(右侧(R)乳腺)的小鼠乳腺的腹股沟乳头近侧区域中针对小鼠乳汁产生的，在注射和强制退化后72小时收集的。
图15说明乳房内输注聚(I:C)引起磷酸化Stat1(p-Stat1)增加、磷酸化Stat5(p-Stat5)减少、中性粒细胞聚集、腺泡萎陷和泌乳衰竭。显微照片描绘了使用抗体进行的DAB+免疫组织化学分析，所述抗体是在注射了聚(I:C)(左侧(L)乳腺)或媒介物对照(右侧(R)乳腺)的小鼠乳腺的腹股沟乳头近侧区域中针对磷酸化Stat1、磷酸化Stat5和小鼠乳汁产生的，在注射和强制退化后48小时收集的。
图16说明了乳房内输注聚(I:C)对第一次妊娠的影响在第二次妊娠时完全恢复。显微照片描绘了在注射了聚(I:C)(左侧(L)乳腺)或媒介物对照(右侧(R)乳腺)的小鼠乳腺的腹股沟乳头近侧或远侧的乳腺中，在泌乳6天(6dpp，上图)或退化6天(6di，下图)时收集的乳汁(深褐色染色)。
图17说明了乳房内输注聚(I:C)对荷斯坦奶牛乳汁中的体细胞计数(SCC)的影响。在箭头所标记的天数，通过乳头导管以指定剂量输注聚I:C。在输注前2天和输注后4天测量A.M.乳汁中的SCC。
图18说明了向荷斯坦奶牛乳房中输注聚I:C对产乳率的影响。数据显示泌乳后期MPR的下降趋势，其中由聚I:C输注引起对MPR 的额外抑制。在第5和第6处理时间(剂量分别为1mg和10mg)存在非常显著的处理效果。
具体实施方式
概述
在本说明书全篇，除非另外特别说明或上下文另有要求，提及单个步骤、特征、物质组成、一组步骤或一组特征或物质组成应被理解为涵盖那些步骤、特征、物质组成、多组步骤或多组特征或物质组成中的一个和多个(即，一者或多者)。
本领域技术人员将理解的是，本公开易于作出除具体描述的那些以外的变型和修改。应当理解，本公开包括所有此类变型和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何和所有的组合或任何两个或更多个所述步骤或特征。
本公开在范围上不受本文所述具体实例的限制，具体实例仅用于举例说明的目的。功能等效的产品、组合物和方法显然在本发明的范围之内。
除非另外明确说明，否则本文中本公开的任何实例都应被理解为加以必要的变通适用于本公开的任何其它实例。
除非另外明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应当理解为具有如本领域中(例如，细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)的普通技术人员通常所理解的相同含义。
除非另有说明，否则重组DNA、重组蛋白、细胞培养和本公开中利用的免疫学技术是本领域技术人员所熟知的标准程序。此类技术在诸如以下来源的整个文献中进行了描述和解释：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J. Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989),T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:APractical Approach,第1和2卷,IRL Press(1991),D.M. Glover和B.D.Hames(编辑),DNACloning:A Practical Approach,第 1-4卷,IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988，包括到目前为止的所有更新),Ed Harlow和 David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988)，以及J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括到目前为止的所有更新)。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含 (comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含有(comprising)”的变型将被理解为暗示纳入所陈述的步骤或要素或整体或一组步骤或要素或整体，但不排除任何其它步骤或要素或整体或其它组的要素或整体。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应该用于提供两种含义或任一含义的明确支持。
如本文所用的术语“约”是指指定值的+/-10％的范围。
选定的定义
如本文所用，在泌乳背景中的术语“减少(reduce、reducing)”或类似术语应当理解为意指从施用了激活OAS2信号传导途径或诱导 OAS2表达的剂，或包含所述剂的乳房内兽用组合物的泌乳非人哺乳动物产生的乳汁，相对于泌乳非人哺乳动物未施用所述剂或乳房内兽用组合物时产生体积减少。
如本文所用，术语“关停泌乳”、“干乳”或类似术语，是指泌乳非人哺乳动物停止产乳。
如本文所用，术语“乳腺炎”是指由于物理损伤，化学品、病毒、真菌、寄生虫的引入，或最常见地，细菌侵入及其毒素引起的乳腺、胸部或乳房的炎症。“乳腺炎”用于描述所有形式的此类炎症，包括亚临床和临床乳腺炎，临床乳腺炎包括轻度、重度和慢性乳腺炎。
在亚临床乳腺炎中，既未检测到胸部或乳房肿胀，也未观察到乳汁异常。这种类型的乳腺炎通常称为“亚临床型”。在家畜动物，尤其是奶牛中，特殊筛查检验，包括加州乳腺炎检验(California Mastitis Test，CMT)，基于体细胞计数估计的威斯康辛州乳腺炎检验(Wisconsin Mastitis Test，WMT)和过氧化氢酶检验，将显示在亚临床乳腺炎的情况下乳汁组成的变化。临床乳腺炎可以是轻度的或急性的，并且其特征在于乳汁中存在白细胞。轻度临床乳腺炎涉及乳汁外观的变化，包括存在薄片或凝块，水样乳或乳的其它非寻常形式。轻度临床乳腺炎可能伴有其它症状，包括胸部或乳房发热、敏感或肿胀。
重度临床乳腺炎涉及令泌乳受试者相当痛苦的胸部或乳房发热、敏感或坚硬的症状。重度临床乳腺炎的发病突然并且泌乳受试者可能生病，显示出发烧、速脉、抑郁、虚弱和食欲不振的体征。当受试者的整个泌乳系统受到影响时，该病症称为急性系统性乳腺炎。重度症状也可能伴有停止产乳。
因此，在一个实例中，如本文所用的术语“预防乳腺炎(prevent mastitis、prevents mastitis、preventing mastitis)”或类似术语，应指本公开的方法在处于泌乳期并且此时无乳腺炎或乳房组织炎症的症状的非人哺乳动物受试者中实施本公开的方法以预防或避免乳腺炎发展。根据另一个实例，如本文所用的术语“预防乳腺炎”或类似术语，应指在处于泌乳期并且此时患有亚临床或轻度乳腺炎的非人哺乳动物受试者中实施本公开的方法。根据这后一个实例中，本公开的方法可以预防亚临床或轻度乳腺炎进展为临床乳腺炎。
如本文所用，术语“非人哺乳动物受试者”应在其最广泛的范围内理解为包括处于泌乳期并且对其而言希望减少或关停泌乳(也称为“干乳”)，例如以预防乳腺炎，减轻疲劳和/或为幼畜断奶的任何非人哺乳动物。对其而言本公开的方法、乳房内兽用组合物和药盒可能有用的示例性非人哺乳动物受试者在本文中有描述并且包括，例如家畜物种、伴侣动物、役用动物和运动动物。
如本文所用，术语“干扰素诱导剂”或类似术语将理解为意指在受试者中诱导或刺激干扰素蛋白表达和/或诱导干扰素反应的剂。
活性成分
本公开提供了一种减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的方法，其包括向所述非人哺乳动物受试者的乳腺施用在所述受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂。
本公开还提供了包含激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂以用于本公开的方法中的乳房内兽用组合物，以及包括所述乳房内兽用组合物的药盒。
在一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂是干扰素或干扰素诱导剂。例如，所述方法可包括向所述受试者的乳腺施用干扰素。例如，所述方法可包括向所述受试者的乳腺施用干扰素诱导剂。
在一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是toll样受体(TLR)激动剂。TLR激动剂可以是由TLR家族中的一种识别的任何配体。TLR对于哺乳动物的先天免疫反应至关重要。TLR 是跨膜糖蛋白，其在白细胞和粘膜表面的上皮细胞中表达，并且其包括胞外、跨膜和胞内信号传导结构域。胞外结构域具有富亮氨酸重复模块并且负责结合被病原体广泛共享的不同配体，统称为病原体相关分子模式(PAMP)。当与所述配体结合时发生TLR信号传导途径的激活，初始步骤是细胞膜上配体诱导的TLR二聚化(Jin和Lee；(2008)Immunity,29:182-191)。存在两种主要类型的TLR：驻留在细胞内区室中(在核内体膜中)并且可以由病毒和细菌核酸激活的那些TLR，例如TLR3、TLR7、TLR8和TLR9；以及在细胞表面上表达的并且可以由细菌、真菌和原生生物的外膜组分激活的那些TLR，例如TLR1、 TLR2、TLR4、TLR5和TLR6。当TLR受激动性化合物激活时信号传导途径被触发，最终产生促炎介质，诸如趋化因子、细胞因子和细胞粘附分子，从而产生干扰素反应和对OAS2水平的上调(Kaiwa和 Akira,(2007)Trend.Mol.Med.13:460-469)。
在一个实例中，可用于本公开的方法、乳房内兽用组合物或药盒中的TLR激动剂由TLR3识别并且是病毒或合成的双链RNA，诸如聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A:U)、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚(I:C))或聚(I:C) 的衍生物，所述衍生物选自聚I:聚C(12)U和用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-ICLC)。在一个实例中，TLR激动剂是聚(I:C)。在一个实例中，TLR激动剂是聚I:聚C(12)U。在一个实例中，TLR激动剂是聚ICLC。在一个实例中，TLR激动剂是聚 A:U。TLR3的其它激动剂是本领域中已知的，并且考虑用于本公开的方法和乳房内兽用组合物中。
在另一个实例中，可用于本公开的方法、乳房内兽用组合物或药盒中的TLR激动剂是由TLR2与TLR1或TLR6的复合物识别的脂蛋白或脂肽衍生物，诸如保留了全长脂蛋白的大部分免疫刺激活性的合成三酰化脂肽PAM3CSK4(Jin和Lee；同上)；二酰化脂蛋白衍生物，诸如成纤维细胞刺激脂肽-1(FSL-1)即Pam2CGDPKHPKSF(源自唾液支原体(Mycoplasmasalivarium))，以及来自发酵支原体(M.fermentans) 的巨噬细胞激活脂肽-2(MALP-2)，即S-[2,3-棕榈酰氧基-(2R)-丙基]- 半胱氨酰基-SNNDESNISFKEK，酵母的酵母聚糖(β-葡聚糖)和脂磷壁酸。TLR2、TLR1和/或TLR6的其它激动剂是本领域中已知的，并且考虑用于本公开的方法和乳房内兽用组合物中。
在另一个实例中，可用于本公开的方法、乳房内兽用组合物或药盒中的TLR激动剂是TLR4激动剂，其是来自天然或突变的革兰氏阴性细菌菌株的脂多糖(LPS)制剂。可替代地，TLR4激动剂可以是称为脂质A或单磷酰脂质A(MPLA)的LPS疏水性组分。可替代地， TLR4激动剂可以是如Gaekwad等人(2010)J.Biol.Chem. 285:29375-29386)所述的LPS合成衍生物，诸如来自脑膜炎奈瑟菌(N. meningitides)的脂质A或Kdo-脂质A以及来自大肠杆菌(E.coli)的脂质A或Kdo2-脂质A。在一个实例中，所述TLR4激动剂是大肠杆菌的LPS或Kdo2-脂质A(Re-LPS)。Kdo2-脂质A相比于LPS的优点在于，在其生产和更明确的天然产物方面可再现，并且它在用于刺激动物细胞的低浓度下可以通过ESI/MS检测到。TLR4的其它激动剂是本领域中已知的，并且考虑用于本公开的方法和乳房内兽用组合物中。
在另一个实例中，可用于本公开的方法、乳房内兽用组合物或药盒中的TLR激动剂是来自带有鞭毛的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的，被TLR5识别的鞭毛蛋白。TLR5的其它激动剂是本领域中已知的，并且考虑用于本公开的方法和乳房内兽用组合物中。
在另一个实例中，可用于本公开的方法、乳房内兽用组合物或药盒中的TLR激动剂被TRL7和TLR8识别。在一个实例中，TRL7和 /或TLR8的激动剂是单链RNA。在另一个实例中，TRL7和/或TLR8 的激动剂是合成的小分子激动剂，诸如咪唑并喹啉(例如，瑞喹莫德 -R848)、咪喹莫特或噻唑并喹啉(例如，CL075)。TRL7和/或8的其它激动剂是本领域中已知的，并且考虑用于本公开的方法和乳房内兽用组合物中。
在另一个实例中，可用于本公开的方法、乳房内兽用组合物或药盒中的TLR激动剂被TLR9识别。在一个实例中，TLR9的激动剂是微生物DNA或由其衍生的合成寡核苷酸，优选硫代磷酸酯(PS)和磷酸二酯(PO)寡核苷酸，例如CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。TLR9识别的合适的CpG ODN是本领域中已知的，并且考虑用于本公开的方法和乳房内兽用组合物中。
在另一个实例中，可用于本公开的方法、乳房内兽用组合物或药盒中的TLR激动剂被TLR11识别。在一个实例中，TLR11的激动剂是细菌鞭毛蛋白或前纤维蛋白或肽。
在一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是干扰素基因(STING)的刺激物或STING激动剂。例如，激活OAS2 信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂可以是STING蛋白。可替代地，或另外，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂可以是STING激动剂，其中许多是本领域中已知的。例如，用于激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的示例性STING激动剂可以是SB 11285，如Challa等人，(2017)Journal ofClinical Oncology 35(15):增刊.e14616中所述，其内容通过引用并入本文。在另一个实例中，STING激动剂可以是5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)，如 Guo等人，(2015)Antimicrobial Agents for Chemotherapy, 59(2):1273-1281中所述，其内容通过引用并入本文。其它STING激动剂是本领域已知的，并且考虑用于本文。
在一个实例中，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是RNA酶L或RNA酶L激活剂。例如，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂可以是RNA酶L。可替代地，或另外，激活 OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂可以是RNA酶L激活剂，其中许多是本领域中已知的。例如，RNA酶L激活剂可以是如Thakur 等人，(2007)PNAS,104(23):9585-9590中所述的RNA酶L激活剂，其内容通过引用并入本文。在另一个实例中，RNA酶L激活剂可以是2’5’寡腺苷酸，如Cole等人，(1997)Journal of Biological Chemistry, 272:19187-19192中所述，其内容通过引用并入本文。其它RNA酶L 激活剂是本领域已知的，并且考虑用于本文。
兽用组合物
根据本公开，提供了一种乳房内兽用组合物，其包含在非人哺乳动物受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂和药学上可接受的赋形剂或载体，其中所述剂以足以减少或关停所述非人哺乳动物受试者中的泌乳的量存在。因此，所述组合物将适于施用到泌乳的非人哺乳动物受试者的乳头管口或输乳管中。
所述药学上可接受的赋形剂或载体必须选择为无毒的、药学上可接受的，与活性成分(即，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂)相容的，并且具有粘度以便容许乳房内施用，同时控制剂的释放特征。
根据一般惯例，用于乳房内施用的根据本公开的兽用组合物包括活性成分(即，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂)在可由水性或油性基质制成的合适载体中的悬浮液或溶液。在一个实例中，所述载体是盐水。在另一个实例中，所述载体是油性基质。在另一个实例中，所述载体是盐水。
可用于兽用组合物的油性基质的油通常是天然的，例如植物的、半合成或合成的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。可以使用的植物油例如，芝麻油、橄榄油、棉籽油、蓖麻油、花生油或椰子油。根据本公开的制剂中的药学上可接受的载体可包含油性基质和任选一种或多种添加剂，诸如增稠剂、干燥剂和抗氧化剂。合适的药物赋形剂是本领域已知的。此类用于乳房内制剂的载体的药物赋形剂，例如在 "Gennaro,Remington:The Science andPractice of Pharmacy"(第20版， 2000)中有描述，其通过引用并入本文。
传统增稠剂是例如，硬脂酸铝、二氧化硅，或脂肪酸酯诸如单硬脂酸甘油酯。增稠剂的合适量在0至30重量％的范围内。
干燥剂包括例如，硅酸盐、活性粘土、硅胶和分子筛。特别优选的是硅铝酸钠。可以使用的干燥剂的合适量在0至15重量％的范围内，优选0-10％。
合适的抗氧化剂是例如丁羟甲苯或羟基茴香醚。抗氧化剂通常以 0至10重量％的范围存在。
其它添加剂也可以以较小的比例存在于载体中。
乳房内兽用组合物的剂量体积可以根据要施用该组合物的受试者而变化。然而，在一个优选实例中，该体积足以填充要施用该组合物的乳腺导管。
在一个实例中，兽用制剂还可包含例如适于乳房内输注的抗微生物剂，以预防施用该制剂的受试者乳腺中的微生物感染。根据该实例，制剂中包括抗微生物剂作为抵抗乳腺中微生物感染(例如细菌感染)的预防剂或防御剂，而制剂中包括激活OAS2信号传导途径或诱导 OAS2表达的剂是为了减少或关停施用该制剂的非人哺乳动物受试者中的泌乳。如本文所用，“抗微生物剂”是杀菌性的抗微生物剂。考虑适于通过乳房内输注施用的任何抗微生物剂用于本公开的兽用制剂中。此类抗微生物剂是本领域中已知且本文所考虑到的。
在另一个实例中，兽用制剂还可包含关停或减少泌乳的另一剂，即除了在非人哺乳动物受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂以外。考虑将关停或减少泌乳的任何剂用于本公开的兽用制剂中。例如，关停或减少泌乳的另一剂可以是能够在受试者中增加血清素活性的剂，例如美国专利公开号20150196507(其内容通过引用整体并入本文)中描述的血清素-选择性再摄取抑制剂 (SSRI)。其它剂将是本领域技术人员已知的并且考虑用于本文。
施用方法
如本文所述，本公开提供了一种减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的方法，其包括向所述受试者的乳腺施用在所述受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂。本文描述了在受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的合适剂并且除非另外特别说明，否则应视为加以必要的变通适用于本公开的任何其它实例。
激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂可以以本文所述的乳房内兽用组合物的形式施用。因此，所述剂可以通过乳房内或导管内输注施用至非人哺乳动物受试者的乳腺。
在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂将以足以减少或关停受试者中的泌乳的量施用给非人哺乳动物受试者。足以减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的剂实际剂量将取决于用于在受试者中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂的选择，正在治疗的施用该剂的非人哺乳动物，和/或泌乳阶段(即，泌乳早期、中期和晚期)。那些因素的确定完全在本领域技术人员的技术范围内。根据其中要施用给非人哺乳动物受试者的剂是聚(I:C)的方法的实例，以在约0.1μg/kg至约15μg/kg范围内的剂量施用该剂。在一个实例中，该方法包括以约1μg/kg至约10μg/kg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。在一个实例中，该方法包括以约1.5μg/kg至约8.5μg/kg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。在一个实例中，该方法包括以约1.5μg/kg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。在一个实例中，该方法包括以约3.0μg/kg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。在一个实例中，该方法包括以约5.0μg/kg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。在一个实例中，该方法包括以约7.0μg/kg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。在一个实例中，该方法包括以约8.5μg/kg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。
在一个实例中，该方法包括以约1mg至约50mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。在另一个实例中，可以以约1mg至约10mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约1mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约2mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约3mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约4mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约5mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约6mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约7mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约8mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约9mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。例如，可以以约 10mg的剂量，通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者施用聚(I:C)。然而超过10mg的剂量也可以采用并且是本文考虑到的。
在一个实例中，所述方法包括以单剂量施用激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂，从而减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳。根据该实例，单剂量将含有减少或关停受试者中的泌乳的足够量的剂。优选地，单剂量将具有足以填充要施用该组合物的乳腺导管的体积。
可替代地，或另外，所述方法包括施用重复剂量的激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂，直至非人哺乳动物受试者中泌乳减少或关停。在一个实例中，所述方法可以包括每天向非人哺乳动物受试者施用所述剂，直至泌乳减少或关停。在一个实例中，所述方法可以包括每两天向非人哺乳动物受试者施用所述剂，直至泌乳减少或关停。在一个实例中，所述方法可以包括每三天向非人哺乳动物受试者施用所述剂，直至泌乳减少或关停。在一个实例中，所述方法可以包括每周向非人哺乳动物受试者施用一次所述剂，直至泌乳减少或关停。
在前述每个实例中，通过进行如本文所述的方法来减少或关停泌乳可预防处于泌乳期的非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。优选地，施用激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂或包含该剂的乳房内兽用组合物的受试者未患乳腺炎。
在一个实例中，本公开的方法能够在未向非人哺乳动物受试者施用抗微生物剂的情况下预防乳腺炎。如本文所用，“抗微生物剂”是杀菌性的抗微生物剂。在一个实例中，本公开的方法是在未向非人哺乳动物受试者施用抗微生物剂的情况下进行的。根据该实例，本公开的方法基本上由以下步骤组成：通过乳房内或导管内输注向非人哺乳动物受试者的乳腺施用在受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂。
在替代实例中，本公开的方法还包括例如通过乳房内输注向非人哺乳动物受试者施用抗微生物剂，以预防受试者乳腺中的微生物感染。根据该实例，在乳腺中施用抗微生物剂作为抵抗微生物感染(例如细菌感染)的预防剂或防御剂，而施用激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂是为了减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳。在一个实例中，抗微生物剂和在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂可以单独地(例如依序)施用。在另一个实例中，抗微生物剂可以与在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂一起(例如，在同一兽用制剂中)施用。考虑适于通过乳房内输注施用的任何抗微生物剂用于本公开的方法或兽用制剂中。此类抗微生物剂是本领域中已知且本文所考虑到的。
在另一个实例中，本公开的方法还可包括向非人哺乳动物受试者施用关停或减少泌乳的另一剂。在一个实例中，关停或减少泌乳的所述另一剂和在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂可以单独地(例如依序)施用。在另一个实例中，关停或减少泌乳的所述另一剂可以与在乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂一起(例如，在同一制剂中)施用。考虑将关停或减少泌乳的任何剂用于本公开的方法或兽用制剂中。例如，关停或减少泌乳的另一剂可以是能够在受试者中增加血清素活性的剂，例如美国专利公开号 20150196507(其内容通过引用整体并入本文)中描述的血清素-选择性再摄取抑制剂(SSRI)。其它剂将是本领域技术人员已知的并且考虑用于本文。
如本文所述，激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂，和包含所述剂的乳房内兽用组合物，可以施用给来自任何非人哺乳动物物种的需要‘干乳’或需要减少泌乳，例如以预防乳腺炎，减轻疲劳和/或为幼畜断奶的泌乳受试者。在一个实例中，本公开的方法、乳房内兽用组合物和/或药盒对其而言有用的非人哺乳动物受试者是选自由以下组成的组的家畜物种：牛、水牛、牦牛、骆驼、绵羊、山羊、猪、马、鹿和驴。在一个实例中，牲畜物种是用于生产供人类消耗的乳汁的反刍动物物种，其选自由牛、水牛、牦牛、骆驼、绵羊和山羊组成的组。在另一个实例中，本公开的方法、乳房内兽用组合物和/ 或药盒对其而言有用的非人哺乳动物受试者是选自由以下组成的组的伴侣动物：猫、狗、马、啮齿动物和兔。在另一个实例中，本公开的方法、乳房内兽用组合物和/或药盒对其而言有用的非人哺乳动物受试者是选自由以下组成的组的役用动物：马、狗、骡、驴、骆驼、公牛和猪。在另一个实例中，本公开的方法、乳房内兽用组合物和/ 或药盒对其而言有用的非人哺乳动物受试者是选自马和狗的运动动物。
药盒
本公开还提供了呈药盒形式的激活OAS2信号传导途径或诱导 OAS2表达的剂，或包含该剂的乳房内兽用组合物。药盒可以包括容器。药盒通常含有如本文所述的激活OAS2信号传导途径或诱导 OAS2表达的剂，或包含该剂的乳房内兽用组合物，及其施用(例如，通过乳房内输注)的说明书。在一些实例中，药盒含有多个剂量的剂或包含该剂的乳房内兽用组合物。在一些实例中，药盒包括包装在用于递送的输注套管内的如本文所述的激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂或包含该剂的乳房内兽用组合物。例如，每个剂量可以容纳在单独的输注套管内。
在一个实例中，药盒可以包括抗微生物剂。在一个实例中，抗微生物剂与激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂或包括该剂的组合物单独包装，例如包装在单独的容器中。在另一个实例中，抗微生物剂与激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂包装在一起，例如包装在同一容器中。
在一个实例中，药盒可以包括关停或减少泌乳的另一剂。在一个实例中，关停或减少泌乳的所述另一剂与激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂或包含该剂的组合物单独包装，例如包装在单独的容器中。在另一个实例中，关停或减少泌乳的所述另一剂与激活 OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂包装在一起，例如包装在同一容器中。
实施例
实施例1.产生泌乳衰竭的突变体小鼠系
1.OAS2突变体小鼠系的产生
使用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变和对泌乳衰竭的筛选，建立了小鼠系，其中杂合(wt/mt)母鼠显示出泌乳差的部分外显率，产生无法茁壮成长的同窝仔(图1)，并且纯合(mt/mt)母鼠经历泌乳完全失败 (图1)，提供了显性遗传模式。
1.1小鼠
所有小鼠均饲养在澳大利亚表型组学设施中心(Australian PhenomicsFacility)和加文研究所(Garvan Institute)的特定无病原体条件下，所有动物程序均通过澳大利亚国立大学(Australian National University)或加文/圣文森特动物伦理和实验委员会(Garvan/St Vincent’s Animal Ethics and Experimentation Committees)批准。所有动物均随意采食和饮水，在22℃和80％相对湿度下进行12小时日/夜循环来饲养。
ENU诱变和谱系构建如先前所述进行(Lo等人，2012)。
对于泌乳衰竭的量化，将同窝仔标准化为每只母鼠7只幼崽。每天在同一时间将幼崽作为一个组进行称重。为小鼠注射溶于H2O中的BrdU(每克体重100μg BrdU)，2小时后通过CO2窒息法处死，并收集乳腺。将乳腺全形包埋并用明矾卡红染色或在液氮中速冻用于mRNA和蛋白质分析。
1.2作图和测序
在用一组约130个多态性标记在C57Bl/6和CBA/CaJ小鼠之间筛选一群15只受影响的F1小鼠和一群15只未受影响的F1小鼠，所述多态性标记以10-20Mb的间隔跨越基因组。由www.well.ox.ac.uk/mouse/INBREDS/上可用的一组确证SNP设计等位基因特异性SNP引物。使用Amplifluor试剂盒(Chemicon)，按照生产商的说明书进行SNP基因分型。在受影响和未受影响的个体小鼠中，使用设计用于扩增在连锁间隔范围内的B6 x CBA/CaJ SNP的Amplifluor标记进行确认和精细作图。在初始图谱间隔范围内以大约 1-2Mb的距离设计标记。从与CBA/CaJ回交的许多连续小鼠组群中筛选250多只小鼠，以将该区域缩小至3Mb间隔。使用连锁区域为纯合的受影响小鼠进行候选基因的测序以定位因果ENU碱基取代。为候选基因设计引物以扩增所有外显子+/-15bp以覆盖剪接点。使用 Sanger测序法通过将受影响个体的序列与C57Bl/6小鼠参考基因组进行比较来鉴定因果突变。在第二受影响的个体和C57Bl/6野生型小鼠中确认了突变。
1.3 Nimblegen序列捕获
用gsMapper程序(这是454软件套件的一部分)进行作图。将两个样品(由Jersey_F4IC140和Jersey_pool定义)针对5号染色体上小鼠基因组的全部区域作图。用作参考的序列来自genbank build37/UCSC mm9。然后，进一步分析集中于映射到目标区域上的读段：5号染色体上的118710087-123738720。
变异分析检测到至少2个读段不同于参考序列或在特定位置比对的其它读段的位置。报道了SNP、插入-缺失配对、多同聚体插入或缺失区域以及单碱基过多识别(overcall)和过低识别(under call)。此外，为了鉴定和报告差异，必须存在至少两个非重复读段，其(1)显示出差异，(2)在差异的两侧具有至少5个碱基，并且(3)在读段中具有一些其它分离的序列差异。如果变异满足以下规则，则将变异分类为高置信度：
1.必须存在至少3个具有差异的非重复读段。
2.必须存在显示出差异的正向和反向读段，除非存在有至少5 个质量评分超过20(或者如果差异涉及五聚体(5-mer)或更高聚体，则超过30)的读段。
3.如果差异是单碱基过多识别或过低识别，则具有该差异的读段必须形成测序读段的共有序列(即，在该位置，整体共有序列必须与参考不同)。
1.4基因型分析
多态性标记的PCR基因分型及其与泌乳衰竭的共同遗传使突变缩窄至染色体5介于rs3662655和rs2020515之间的4Mb区域。预期 4Mb中有4-8个ENU突变，并且提出的策略是在发现外显子突变时依次对外显子组进行测序，然后用实验方法确证。测序揭示OAS2中 T到A的碱基变化，从而导致OAS2催化结构域的保守区域(图3)中的非保守异亮氨酸取代为天冬酰胺氨基酸(I405N；图2)。在wt/wt动物中，OAS2以相对低的水平表达直到泌乳建立，此时OAS2 mRNA 的水平增加20倍，随后在早期退化期间下降(图4)。还使用免疫组织化学方法，观察到乳腺上皮细胞中OAS2水平的相应变化(图5)。
在单个G1雌性中发现OAS2突变，且通过与CBA CaJ雄性繁殖以及幼崽的交叉养育来确认表型的遗传力。
1.5OAS2突变体小鼠系维持和基因分型。
在鉴定因果病突变后，使用以下引物进行基因分型：
正向-野生型：GCTCTTCCTAAAGCAGAT(SEQ ID NO:1)
正向-突变体：GCTCTTCCTAAAGCAGAA(SEQ ID NO:2)
常见反向：GGTGTCAGAATTCAAGAAGCAGAC(SEQ ID NO: 3)
通过使杂合雄性(wt/mt)与wt/wt雌性繁殖来维持OAS2突变体集落。为了产生纯合实验动物，使wt/mt雄性与wt/mt雌性繁殖，并在 1dpp取出它们的后代，并在对照母体上养育。
从而建立了小鼠系，其中杂合(wt/mt)母鼠显示出泌乳差的部分外显率，产生无法茁壮成长的同窝仔(图1)，并且纯合(mt/mt)母鼠经历泌乳完全失败(图1)，提供了显性遗传模式。
实施例2.OAS2突变体小鼠系的表征
2.1方法
2.1.1组织病理学和器官病理分析
由墨尔本大学(University of Melbourne)澳大利亚表型组学网络 (APN)组织病理学和器官病理学服务中心进行Jersey品系的组织学和病理学的完整分析。宏观和微观镜检查由mt/mt和wt/wt同胞组成的八周和31周的雌性同胞配对。对乳腺组织、卵巢、输卵管、双角子宫、子宫颈、膀胱、肝/胆囊、盲肠、结肠、脾/胰腺、肠系膜淋巴结、胃、十二指肠、空肠、回肠、肾/肾上腺、唾液腺/淋巴结、胸腺、肺、心脏、皮肤、眼、脑、脊髓、骨骼肌、骨骼组织/后肢进行宏观和微观检查。
2.1.2 OAS2突变体小鼠乳蛋白中的表达
对OAS2突变体小鼠系中表达的乳蛋白的mRNA进行定量PCR。简言之，使用Trizol试剂(小鼠组织；Gibco/Invitrogen Vic)或RNeasy 提取试剂盒(细胞团块；Qiagen)，根据制造商的说明书从乳腺组织分离总RNA。在20μl反应中使用1μg RNA通过逆转录产生单链cDNA，并用H2O(Promega)进行1:5稀释。使用基于Taqman探针的系统在 ABI 7900HT上按照制造商的说明书(Applied Biosystems)进行定量 PCR。
表1.用于定量PCR的Taqman探针。
| 基因 | 探针 | 物种 |
| OAS2 | Mm00460961_m1 | 小鼠 |
| OAS2-2 | Mm01202789_m1 | 小鼠 |
| Wap | Mm00839913_m1 | 小鼠 |
| β酪蛋白 | Mm0089664_m1 | 小鼠 |
| RNA酶L | Hs00221692_m1 | 人 |
| IRF7 | Hs01014809_g1 | 人 |
| GapDH | Hs02758991_g1 | 人 |
| GapDH | Mm99999915_g1 | 小鼠 |
2.1.3乳腺全形包埋和免疫组织化学分析
从wt/wt和mt/mt小鼠中收获小鼠乳腺，并在4％缓冲的福尔马林中固定4小时。更换3-4次丙酮对腺体进行脱脂，然后进行脱水并且如前所述在明矾卡红中进行染色(Bradbury等人，1995)。然后将腺体在一系列分级醇中进行脱水并包埋在石蜡中用于切片。将切片用苏木精和伊红染色以进行常规组织化学分析或使用免疫组织化学法用以下抗原的抗体进行染色。
表2用于免疫组织化学分析的抗体、浓度和抗原修复条件。
除非另有说明，否则所有试剂来自Dako。使用DAB+液体底物色原系统(K3467)进行目测。
2.1.4.转录谱分析
将wt/wt或mt/mt小鼠进行定时交配，在妊娠第18天或产后2 天(2dpp)收集乳腺，并在液N2中速冻。使用Trizol试剂(Gibco/Invitr ogen,Vic)分离总RNA，并在2100Bioanalyzer(Agilent)上进行测量。然后在拉曼乔蒂基因组学中心(UNSW,SydneyAustralia)，按照生产商的说明书(Affymetrix Ca,USA)，标记来自小鼠乳腺的总RNA并与小鼠转录组阵列(MTA)1.0杂交。对于每个实验分组，所有小鼠样品以生物一式三份制备。微阵列数据可以从GEO:GSE69397 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？ token＝ohkleoespjotzoh&acc＝GSE69397免费获得。
使用Affymetrix表达控制台进行质量控制。使用Affymetrix Power Tools apt-probeset-summarize软件(1.16.1版)的稳健多片平均法(使用-a rma选项)进行归一化和探针组汇总。然后从HTA 2.0阵列中提取具有正式HGNC符号的转录物集群，得到23532个基因转录物集群。使用Limma(Smyth,2004)，经由GenePattern中的limmaGP工具评估实验组间的差异性表达。使用基因集富集分析(GSEA)(Subramanian等人，2005)在limma适度t统计数据的排序列表上，通过与来自MSigDB v4.0(Liberzon等人，2011)的6947个基因集和源自文献的定制基因集的组合集的每个成对比较，鉴定功能上相关的基因集。使用ensembl 数据库将小鼠基因-符号映射到其人直系同源物。使用Cytoscape (Shannon等人，2003)的富集图谱插件(Merico、Isserlin、Stueker、Emili 和Bader，2010)构建和目测所得的基因标签调控网络，其保守性参数： p＝0.001；q＝0.05；重叠s＝0.5。
2.1.5使用自组织映射生成集群
使用Benjamini-Hochberg调节的p-值阈值为0.05的limma F检验统计(Smyth，2004)鉴定小鼠表达阵列中四个实验组(wt/wt 2dpc、wt/wt 2dpp、mt/mt 2dpc、mt/mt2dpp)之间差异性表达的转录物。这样产生 660个显著的转录物集群。
使用由6个节点组成的自组织映射(SOM)鉴定基因集群。将每个转录物集群的log2归一化基因表达值的z分数用作biopython SOM算法实现的输入(Cock等人2009)。使用的somcluster()参数为：迭代＝50,000；nx＝2，ny＝3，inittau＝0.02，dist＝欧式距离(Euclidean)。
2.1.6 DAVID功能注释聚类
使用来自BioDBNet数据库的db2db()功能(Mudunuri、Che、Yi 和Stephens，2009)将基因-符号转换成Ensembl基因ID，以便输入到 DAVID(Jr等人，2003)中。使用来自DAVID网络服务接口的 getTermClusterReport()功能(Jiao等人，2012)进行DAVID功能注释聚类，使用以下参数：重叠＝3，初始种子＝3，最终种子＝3，连接＝0.5，κ＝50。
使用的DAVID数据库：(BBID、GOTERM_CC_FAT、BIOCART A、GOTERM_MF_FAT、SMART、COG_ONTOLOGY、SP_PIR_KE YWORDS、KEGG_PATHWAY、INTERPRO、UP_SEQ_FEATURE、 OMIM_DISEASE、GOTERM_BP_FAT、PIR_SUPERFAMILY)
2.1.7标签基因集的功能富集
使用超几何检验来计算在每个SOM集群中鉴定的基因之间以及 MSigDB基因集合(Subramanian等人，2005)与自定义功能标签基因集之间的基因重叠水平。使用如在MSigDB网站上描述的45956的背景设置编号。为每个集计算Benjamini-Hochberg(BH)校正的p值，并且将BH＜0.05的阈值视为显著富集。使用ensembl数据库将小鼠基因- 符号映射到其人直系同源物。
2.1.8聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹
在具有12％NuPAGE SDS聚丙烯酰胺凝胶(Life Technologies)的每个孔中上样10μg还原蛋白并使用电泳进行分离。将蛋白质转移至 Immun Blot PVDF(Biorad)并针对小鼠OAS2(M-105，sc99098 Santa-Cruz)、RNA酶L(H-300，sc25798 Santa Cruz)、E-钙粘蛋白(610182BD Biosciences)和β-肌动蛋白(AC-74，A5316，Santa Cruz) 进行蛋白质印迹分析。
2.2
OAS2突变体小鼠系的表征
2.2.1乳腺生物学
青春期乳腺导管网络的发育和妊娠期小叶泡单元的发育在mt/mt 母鼠中是正常的(图6A和B)。通过免疫组织化学或蛋白质印迹法，乳蛋白合成的开始也显示在妊娠期间没有缺陷(图6C和D)。mt/mt小鼠产后2天(2dpp)的泌乳衰竭视为腺泡减小、腺泡扩张失败以及脂滴和初乳滞留(图7A-F)。乳汁的蛋白质印迹(图8及图6C和D)显示，在2dpp时所有主要乳汁组分的表达相对于上皮细胞标记细胞角蛋白18的水平大大降低。
2.2.2乳蛋白的表达
乳蛋白即乳清酸性蛋白(WAP)β酪蛋白-Cas)的mRNA定量PCR 显示在性交后18天(dpc)并且尤其是在2dpp时mt/mt母鼠(mt)中的水平与wt/wt母鼠(wt)相比降低(图9A和B)。裂解的半胱天冬酶3阳性上皮细胞的数量增加(图9C)并且上皮掺入的BrdU减少，分别表明细胞死亡率增加和细胞增殖减少(图9D)。
2.2.3 OAS2突变体小鼠系中的Stat1激活
使用免疫组织化学法检查Stat1激活。在wt/wt母鼠中在妊娠第 18.5天和产后2天，观察到在较小且未扩张的腺泡的紧密填充区中有分散的磷酸化Stat1染色区域(图9E)。这些区域在所检查的其它发育阶段非常罕见。在mt/mt动物中，在未扩张且紧密填充的腺泡区域内再次观察到Stat1磷酸化(图9F)，但是在妊娠第18.5天，这些Stat1 磷酸化区域出现的频率远高于wt/wt腺体，而不是像wt/wt腺体一样在产后阶段消退，这种染色模式的频率进一步增加(图9G)。
还在通过将mt/mt或wt/wt动物的上皮移植到清除了内源性上皮的青春期前的野生型小鼠的乳腺脂肪垫中形成的乳腺中检查到Stat1 磷酸化。在产前期的mt/mt移植物中再次观察到统计学上显著的Stat1 磷酸化增加(移植物不能询问产后期)，从而证明ENU突变经由乳腺上皮细胞自主作用(图9H)。
2.2.4 RNA转录谱分析
使用Affymetrix小鼠转录组测定(MTA)1.0基因芯片测量这些事件潜在的基因表达变化。在18dpc和2dpp时来自wt/wt和mt/mt小鼠的乳腺中进行RNA转录谱分析。使用Limmat-统计量作为分级差异性表达的量度进行基因的基因集富集分析(GSEA)，并用Cytoscape的富集图谱插件目测。在18dpc或2dpp时在mt/mt和wt/wt小鼠之间比较基因表达的变化(图10)。这样鉴定了在产后mt/mt而不是wt/wt乳腺中涉及干扰素反应的突出基因集集群的稳健富集，其在18dpc和 2dpp之间在量级上增加。这些集合中的基因包括干扰素诱导的基因Isg15、Mx1、Rsad2、Oas1、OAS2和OasL。涉及分子模式反应途径的干扰素诱导的基因还包括，诸如Ddx58(RIG-1)、Dhx58(RIG-1 regulator)、Mavs和Nlrc5(NOD5)。干扰素反应的其它下游转录调控因子，诸如Stat1、Irf7和Irf9上调。在mt/mt腺体中这伴随着广泛的线粒体相关细胞死亡基因诸如Tnsfs10(TRAIL)、Acin1、Birc2、Traf2、 Bcl2l1(BCL-XL)、Bcl2l11(BIM)、Apaf1、Dffb、Xaf和Ripk1的表达增加。使用基于自组织映射的独立分析技术获得了非常相似的结果 (图11A和B)。该转录数据表明，突变诱导出稳健的干扰素反应。
2.3讨论
这些实验显示，OAS2突变引起OAS2驱动的信号传导的激活以防止产后期泌乳的激活。可以经由来自妊娠中期的Stat1激活检测突变的作用，并且仅在乳腺上皮细胞中需要以发挥作用。
泌乳衰竭和乳汁淤滞是乳腺炎的特征。乳腺炎的主要后果是婴儿的体重增加减少，促使转换为人工喂养(在减少的情况下)，或降低新生儿健康(在未减少的情况下)。本文呈现的结果表明，在乳腺炎发病机制中可能涉及OAS2途径。本文呈现的结果还显示刺激OAS2途径可以产生持续的干扰素反应，该干扰素反应防止Stat5激活，这对于产后期间激活乳汁分泌是必需的，且仅在乳腺上皮细胞中需要以发挥作用。因此，本文呈现的结果也支持使用OAS2激活剂以防止、减少或关停泌乳，这可以用作乳腺炎的预防。
实施例3.向泌乳期小鼠乳房内输注聚(I:C)
在该实例中，发明人证明当经由乳房内输注施用给泌乳小鼠时聚 (I:C)(代表性OAS2激活剂)可减少或关停泌乳。结果显示，施用聚(I:C) 导致泌乳衰竭、过早退化和乳腺泡重建，使得在前次妊娠中输注过的乳腺可以恢复并且在后续妊娠之后变得完全能够泌乳。
3.1方法
按照制造商的说明书将浓度为10mg/ml的聚(I:C)原液在无菌盐水中稀释，然后加热至50℃。由该原液，如下配制用于向小鼠乳腺注射的处理和对照溶液：
表3：25ng/μl聚(I:C)的注射主混合物
表4：媒介物对照的注射主混合物
简言之，使小鼠交配，使其产仔并建立泌乳，持续6-10天，此时对幼崽实施安乐死，并将聚(I:C)或盐水媒介物对照分别经由向输乳管进行乳房内输注而经导管内注射到左侧和右侧第4(腹股沟)乳腺中，如图12所示。泌乳小鼠(6-10dpp)的腹股沟乳腺的乳头通过去除乳头大约0.2mm的尖端以打开输乳管并暴露主乳窦而准备好。然后使用平端的50μl 30/12.7mm/3 Hamilton注射器，经由打开的输乳管注射单剂量的处理或对照溶液(视情况而定)。处理剂量在体积为4μl、4 μl、10μl和20μl的含有0.01％台盼蓝的无菌PBS中分别含有50ng、 150ng、250ng或500ng聚(I:C)(根据表3和4制备)。注射后，用外科伤口胶(例如，Histoacryl)密封乳头或让乳头愈合。
24小时，通过观察第4乳头周围皮肤下的近侧区域目测聚(I:C) 的成功注射，当与同一乳腺的远侧区域比较时，近侧区域缺乏白色的乳汁充盈区。还使用台盼蓝染料目测注射区，台盼蓝染料渗透与乳头直接相邻(近侧)的大约25％腹股沟乳腺区域(图13，黑色箭头)。通过在注射时移开幼崽产生强制性退化。
在注射后48小时、72小时或7天(即，退化后48小时、72小时和7天)，对小鼠实施安乐死并收集乳腺，或替代性地使乳腺在注射后恢复2-3周，再次交配并在泌乳6天(6dpp)后实施安乐死，此时收集乳腺。
分析集中在输注部位近侧的腺体区域(其中输注已经填充乳腺导管)，以及输注未到达的输注部位的远侧区域。
为了评估乳腺中的泌乳，根据实施例2中描述的方法并且使用针对小鼠乳汁的兔抗体(Accurate Chemical&Scientific Corporation，如表2中所述)，对在注射聚(I:C)或盐水媒介物对照后48小时、72小时和7天收集的乳腺进行免疫组织化学分析。
由于在处于泌乳期的OAS2突变体小鼠中观察到磷酸化Stat1增加和磷酸化Stat5相应减少(实施例2)，根据实施例2中描述的方法，使用pStat1、pStat5和乳汁的抗体(表2)对输注了150ng(5μg/kg)(聚 (I:C)、单独的盐水对照的乳腺或内源性右侧第3乳腺进行免疫组织化学分析，以确定输注聚(I:C)对Stat1和Stat5的影响。
3.2结果：
3.2.1乳房内输注聚(I:C)引起中性粒细胞聚集、腺泡萎陷、泌乳停止和过早退化。
在注射并移开幼崽后24-48小时，观察到腹股沟(第4)和轴向(第 3)乳腺区域真皮正下方的白色区域乳汁充盈，剃毛小鼠腹膜的深色衬托出所述白色区域的鲜明轮廓。当与同一腺体的远侧区域或与仅输注盐水媒介物的乳腺近侧区域相比时，输注聚(I:C)的主乳腺窦近侧区域并未出现乳汁充盈(较暗的区域，红色虚线，图13)。
使用针对小鼠乳汁产生的抗体进行的免疫组织化学分析确认在输注后48小时(图13，上图)和72小时(图13，中图)，左侧输注了聚 (I:C)的腺体的近侧区域中乳汁损失。同一小鼠右侧输注了盐水的腺体具有充满乳汁的膨胀腺泡(深色染色)。嗜中性白细胞积聚在腺泡和细胞外组织中在输注了聚(I:C)的腺体的近侧区域中也观察到，这在同一腺体的远侧区域中也有较小程度的明显，表明炎症反应已经从注射部位扩散。在经聚(I:C)处理的腺体的近侧区域和早期时间点也观察到腺泡萎陷，并且到聚(I:C)输注后7天，当与盐水对照腺体相比时，在注射了聚(I:C)的腺体中这已经进展为广泛的组织重建(图13，左侧第4 下方图)。对于所有小鼠，未注射的对照(右侧第3内源性腺)作为另外的未注射的对照。
更高浓度的聚(I:C)250-500ng/注射(8.3-16.7μg/kg)导致注射后72 小时发声更严重的腺泡完整性缺陷和乳汁积聚方面的缺陷，注射 500ng(16.7μg/kg)的最高剂量产生最明显的效应(图14)，证明是剂量依赖性效应。腺体中中性粒细胞积聚明显，腺泡尺寸已缩小或萎陷，并且乳汁积聚减少。输注500ng(16.7μg/kg)的左侧第4乳腺的近侧区域显示出完全复原的腺泡，其中与对照盐水处理的右侧第4乳腺相比，腔内表达的乳汁很少，右侧第4乳腺显示出完全扩张的腺泡和大量的乳汁充盈(深色染色，图14的下图)。在输注了500ng(16.7μg/kg) 聚(I:C)的腺体中的较大腺泡中，与盐水对照相比，乳汁染色弱，并且存在中性粒细胞积聚。在输注了250ng(8.3μg/kg)聚(I:C)的腺体中观察到类似效应，但炎症作用不太严重。250ng(8.3μg/kg)剂量比500 ng(16.7μg/kg)更好地为小鼠所耐受，小鼠保持体重并未表现出全身炎症不良影响的体征。因此，50-250ng(1.67-8.3μg/kg)的剂量足以减少产乳量并诱导过早退化而没有不良副作用。
3.2.2乳房内输注聚(I:C)导致泌乳关停，这与磷酸化Stat1增加和磷酸化Stat5损失相关。
从图15中显而易见，与输注盐水的右侧对照乳腺和右侧第三内源性乳腺相比，左侧第4乳腺显示出磷酸化Stat1增加、磷酸化Stat5 损失和乳汁积聚减少的聚焦区，证明聚(I:C)处理产生与I405N突变引起的OAS2激活相似的作用。
实施例4.向泌乳期小鼠乳房内输注聚(I:C)
在该实施例中，发明人证实乳房内输注聚(I:C)未引起小鼠泌乳能力的永久缺陷。
4.1方法
由于在实施例3中当施用250ng(8.3μg/kg)剂量的聚(I:C)时观察到了无明显不良的全身毒性的稳健作用，因此选择该剂量来测试在经聚(I:C)处理的乳腺中在第二次妊娠时是否可以恢复泌乳。
在该实验中，对10dpp泌乳小鼠的左侧乳腺输注250ng(8.3μg/kg) 聚(I:C)(按照表3和4制备)，将右侧乳腺用盐水对照注射进行处理。强制退化后24小时，通过观察第4乳头周围皮肤下的近侧区域目测乳房内成功输注聚(I:C)，当与同一乳腺的远侧区域比较时，近侧区域缺乏在强制断奶后预计的白色乳汁充盈区。保持小鼠存活，然后使其恢复2-3周，再次交配，并使其泌乳6天(产后6天，6dpp)。在6dpp，对小鼠实施安乐死并收集乳腺用于组织学分析。
根据实施例2中描述的方法，并且使用针对小鼠乳汁的兔抗体 (AccurateChemical&Scientific Corporation，如表2中所述)，对在6dpp 时收集的乳腺进行免疫组织化学分析。第3(轴向)内源性乳腺用作对照。
4.2结果
使用针对小鼠乳汁的抗体进行的免疫组织化学分析显示，在第一次妊娠时输注聚(I:C)的乳腺的近侧和远侧区域在第二次妊娠时均正常泌乳，并且当与盐水对照或未注射的右侧第3内源性对照相比时，未显示出腺泡结构或乳汁产生方面的缺陷(图16上图)。附属于这些母鼠的幼崽体重也正常增加。没有像活跃泌乳的小鼠所预期的那样观察到腺泡乳汁充盈。
同样，当在出生时而不是在泌乳6天时移开幼崽时，乳房退化正常发生，并且在第一次泌乳期间未因聚(I:C)处理而发生改变。
总的来说，这些数据表明，输注聚(I:C)引起炎症反应，导致泌乳关停和过早退化，这对后续妊娠时的泌乳能力没有长期影响。
实施例5.在荷斯坦奶牛中乳房输注聚I:C
在该实施例中，发明人证实将聚I:C输注到荷斯坦奶牛的乳房中引起瞬时免疫刺激和泌乳抑制，而没有不良副作用。
5.1基本原理
在泌乳荷斯坦奶牛中使用乳房内(乳房)输注聚肌苷酸-聚胞苷酸钾盐即聚I:C进行概念验证(POC)。这项研究的目的是鉴定乳房内输注聚I:C的安全剂量范围并提供在奶牛模型中乳房内输注聚I:C后存在免疫刺激和泌乳抑制的证据。更具体地说，设计该研究是为了：
1.鉴定实现乳腺免疫刺激(通过乳汁中体细胞计数(SCC)的增加来表示)所需的聚I:C最小剂量。
2.鉴定由不同剂量的聚I:C免疫刺激所引起的可能的不良全身性副作用。
3.确定不同剂量的聚I:C的免疫刺激对产乳率(MPR)的影响(如果有的话)。
4.确定乳腺中由有效剂量的聚I:C引起的任何病理变化，诸如临床炎症。
5.确定在输注聚I:C之后SCC和/或MPR是否恢复到典型水平。
体细胞计数(SCC)是乳汁中免疫细胞的测量值，表示为1毫升乳汁中的细胞数量。体细胞主要是白血细胞(白细胞，98％)，以及少量 (2％)从乳房组织脱落的产乳细胞。SCC水平在泌乳高峰期间最低而在初乳和泌乳后期较高。在初乳中，SCC(白细胞)渗漏到乳汁中，因为上皮边界(紧密连接)极具渗漏性。泌乳晚期产乳量普遍下降，引起SCC 的明显增加，这是由于较低的乳汁分泌的集中效应所致。
而实施例1至4证明在啮齿动物模型中乳房内输注聚I:C能够激活乳房内免疫反应并抑制泌乳，所以设计该实验以评价在奶牛中乳房内输注聚I:C是否也会有相同的效果。
5.2方法
5.2.1动物
根据一组相关的健康和生产准则，一所重点大学奶牛群中的荷斯坦奶牛是合格的。在研究中使用泌乳后期的母牛(泌乳250-320天)。母牛是经产的并且未妊娠(未怀孕(open))。每头母牛都有四个功能分区，在研究开始时乳头无损伤。按照每天挤奶两次的时间表，生产水平等于或大于35lbs乳汁/天(等于或大于15.4升乳汁/天)生产。选择该研究中包括的母牛的依据还在于它们在当前的泌乳期中有稳定的产乳史(即日常方差低)。
饲养和喂养方案遵循威斯康星大学的泌乳后期未怀孕(非妊娠)奶牛的标准程序。
5.2.2方案
在每次处理之前进行以下方案：
·收集第-7天到第0天半乳房产乳量的数据。
·在每次挤奶时对母牛每个乳房侧进行CMT(加州乳腺炎检验)。
·对CMT阳性的任何乳汁样品进行微生物培养分析。
·收集并冷冻来自第-2天和第-1天上午挤奶的乳汁样品。
·基线SCC是相对于输注在-48小时和-24小时测定的。
·基线核心温度是相对于输注在-48小时和-24小时测定的。
在处理的每一天，使用以下方案给予母牛对照和实验输注：
·仅在两个分区中，每个分区通过乳头导管在乳房内输注稀释在 10ml媒介物(生理盐水)中的聚I:C。
ο给予在第0天进行上午挤奶之后进行。
ο对侧两个分区仅接受媒介物。
·处理后进行乳头杀菌浸渍。
·收集并冷冻来自上午挤奶的乳汁样品。
·输注后按摩每个分区以使输注液分布。
处理后使用以下方案进行数据收集：
·持续每天挤奶两次并计算半乳房产乳率(kg/小时)。
·在输注后0、12、24、36、48、72和96小时收集并冷冻乳汁样品。
·在第0天至第7天(相对于每次处理)，在下午挤奶期间记录核心温度。
·在每次挤奶时记录观察到的行为变化(兴奋、发声、斜卧)。
·在每次挤奶时观察乳房酸痛、水肿或炎症的体征以监测乳房健康。
·在输注后0、12、24、36、48、72和96小时，测量乳汁样品中的SCC。
ο对SCC升高(CMT阳性)的任何动物进行微生物分析。
ο预计聚I:C的免疫刺激作用会引起SCC的处理依赖性增加。
ο预计处理依赖性SCC反应的发生不会伴随任何感染(无菌乳腺炎)。
重复上述方案，并在第11天(10天淘汰)上午挤奶后给予下一次输注：
·第1给药周期＝0.1μg在10ml媒介物中。
·第2给药周期＝1μg在10ml媒介物中。
·第3给药周期＝10μg在10ml媒介物中。
·第4给药周期＝0.1mg在10ml媒介物中。
·第5给药周期＝1mg在10ml媒介物中。
·第6给药周期＝10mg在10ml媒介物中。
5.3.结果
5.3.1母牛健康
母牛在整个研究中都很健康。具体来说，在所有母牛中体温和呼吸率维持正常。在母牛中也未观察到异常或指示的行为变化。
5.3.2乳房健康
乳腺(乳房)在典型发生的正常范围内是健康的。一头母牛踩踏它的其中一个乳头并且损伤导致该分区停止泌乳。然而，在乳房中未出现水肿、炎症、酸痛或其它大体的病理指征。因为每头母牛在两个分区中接收剂(聚I:C)而在另外两个分区中接受对照输注，因此可以证明在任何个体母牛中经处理的分区和对照分区之间乳房健康没有差异。
研究期间乳房内感染发生率较低(6个感染的分区，全部为葡萄球菌感染)。所有这些感染都发生在研究早期，且没有病例与聚I:C处理相关。乳房内感染的这个比率在正常预期范围内。
5.3.3聚I:C在乳房内诱导免疫反应
正如通过SCC测量的，向奶牛乳房中输注聚I:C在经处理的乳房分区中引起剂量依赖性的局部免疫反应(图17)。通过双因素方差分析 (2-way ANOVA)(时间X处理)分析每个剂量的效果，统计显著性 P<0.05，用邦弗朗尼事后检验(Bonferroni post-test)比较单个时间。对于处理(P＜0.01)和时间(P＜0.01)两者，存在总体上高度显著的效果，并且在处理和时间(P＜0.01)之间存在显著的相互作用。在两个最高剂量(每个分区1mg和10mg)下，在母牛经聚I:C处理的分区中SCC水平在12-36小时显著上升。然后，SCC水平在各种处理后96小时(4 天)下降至对照水平。没有证据表明将聚I:C输注到两个未处理的分区中会产生任何交叉效应。由于正常的晚期泌乳模式，所有乳房分区中的SCC水平逐渐增加。然而，对照分区没有显示出任何SCC增加，这反映出经处理分区中聚I:C诱导的变化。
5.3.4聚I:C对奶牛产乳率的影响
在经聚I:C处理的乳房分区，在两个最高剂量的输注下，产乳率 (MPR)存在处理相关性降低(图18)。在处理后的间隔(处理后96小时) 期间，计算每头母牛的对照分区和经聚I:C处理的分区的半乳房 MPR，并通过单因素方差分析(1-way ANOVA)进行分析。在第5和第6处理时间存在非常显著的处理效果(剂量分别为1mg和10mg)。由于在泌乳后期MPR下降的正常模式，所有母牛中都存在MPR下降的总体趋势。聚I:C的作用作为MPR的附加抑制而叠加。
5.4结论
从该研究中可以得出几个结论。
1.经鉴定每分区1mg是引起乳汁中SCC增加(指示乳腺中的免疫刺激作用)的最小剂量。
2.在将聚I:C输注到奶牛乳房中后没有观察到全身性副作用。
3.在将聚I:C输注到奶牛乳房中后，没有观察到奶牛体温、呼吸速率或行为的变化。
4.在泌乳后期MPR下降，而聚I:C在每分区1mg和10mg的剂量下引起MPR的附加抑制。
5.在测试的任何剂量下，对乳房都没有与聚I:C输注有关的病理作用。
6.在测试的剂量范围内，SCC水平在聚I:C输注后4天恢复到对照水平。由于MPR在泌乳后期的下降趋势，在本研究中不可能确定 MPR恢复的程度。
总之，该实施例中的数据显示可以将聚I:C输注到奶牛乳房中，并且引起局部免疫反应，该局部免疫反应引起SCC水平增加和MPR 降低。由聚I:C引起的乳腺功能的变化与母牛乳房健康或全身健康的任何负面副作用无关。
本领域技术人员将理解的是，在不脱离本公开的一般广泛范围的情况下，可以对上述实施方案进行许多变型和/或修改。因此当前的实施方案在所有方面都应视为是说明性的而非限制性的。
应当理解的是，本文所包括的对公开文件、法案、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了为本发明提供背景的目的。这不能看作是承认这些物项中的任何一项或全部因为存在于本申请任何权利要求的优先权日之前而是与本发明有关的领域中的公知常识。
序列表
<110> 加文医学研究所(Garvan Institute of Medical Research)
Amelgo有限责任公司(Amelgo LLC)
<120> 用于减少或关停非人哺乳动物中的泌乳的方法及其试剂
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<150> US 62/557280
<151> 2017-09-12
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 1
gctcttccta aagcagat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
gctcttccta aagcagaa 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
ggtgtcagaa ttcaagaagc agac 24
Claims (35)
1.一种减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的方法，所述方法包括向所述受试者的乳腺施用在所述受试者的乳腺中激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中激活所述OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂是干扰素或干扰素诱导剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述干扰素诱导剂是toll样受体(TLR)激动剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述TLR激动剂选自由以下组成的组：聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚(I:C))或其衍生物，所述衍生物选自聚I:聚C(12)U和用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚-ICLC)；聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A:U)、细菌脂多糖(LPS)；单磷酰脂质A(MPL)；CpG二核苷酸(CpG-ODN)；细菌鞭毛蛋白；和前纤维蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在所述乳腺中激活所述OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂是聚(I:C)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在所述乳腺中激活所述OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂是以足以减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的量施用的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中向所述受试者的乳腺施用所述剂是通过乳房内输注进行的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述非人哺乳动物受试者施用单剂量的所述剂，从而减少或关停泌乳。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用重复剂量的所述剂，直至泌乳减少或关停。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法包括每天向所述非人哺乳动物受试者施用所述剂，直至泌乳减少或关停。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中减少或关停所述受试者中的泌乳预防所述非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。
12.根据权利要求11所述的方法，其中施用在所述乳腺中激活所述OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的所述剂足以在抗微生物剂不存在的情况下预防所述非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法不包括向所述非人哺乳动物受试者施用抗微生物剂。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其基本上由以下组成：通过乳房内输注向所述非人哺乳动物受试者的乳腺施用在所述受试者的乳腺中激活所述OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述非人哺乳动物受试者施用抗微生物剂以预防所述受试者乳腺中的微生物感染。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述非人哺乳动物受试者施用关停或减少泌乳的另一剂。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述非人哺乳动物受试者是家畜动物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述非人哺乳动物受试者是用于生产供人类消耗的乳汁的反刍动物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述非人哺乳动物受试者是奶牛。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述非人哺乳动物受试者未患乳腺炎。
21.一种预防泌乳而未患乳腺炎的非人哺乳动物受试者中的乳腺炎的方法，其包括通过进行根据权利要求1至20中任一项所述的方法，减少或关停所述非人哺乳动物受试者中的泌乳。
22.一种乳房内兽用组合物，其包含在非人哺乳动物受试者的乳腺中激活所述OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂和药学上可接受的赋形剂或载体，其中所述剂以足以减少或关停所述非人哺乳动物受试者中的泌乳的量存在。
23.根据权利要求22所述的乳房内兽用组合物，其中所述剂是如前述权利要求中任一项所述的剂。
24.根据权利要求22或23所述的乳房内兽用组合物，其还包含抗微生物剂以预防施用所述制剂的受试者的乳腺中的微生物感染。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的乳房内兽用组合物，其包含关停或减少泌乳的另一剂。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的乳房内兽用组合物，其用于减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳。
27.根据权利要求22至25中任一项所述的乳房内兽用组合物，其用于预防未患乳腺炎的非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。
28.根据权利要求22、23或25至27中任一项所述的乳房内兽用组合物，其用于在抗微生物剂不存在的情况下预防非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。
29.激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂在制备用于减少或关停有需要的非人哺乳动物受试者中的泌乳的药物中的用途。
30.激活OAS2信号传导途径或诱导OAS2表达的剂在制备用于预防处于泌乳期而未患乳腺炎的非人哺乳动物受试者中的乳腺炎的药物中的用途。
31.根据权利要求25或26所述的用途，其中所述剂是如前述权利要求中任一项所述的剂。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的用途，其中所述药物是根据权利要求22至28中任一项所述的兽用制剂。
33.一种用于减少或关停非人哺乳动物受试者中的泌乳的药盒，所述药盒包括：
(i)根据权利要求22至25中任一项所述的乳房内兽用组合物；和
(ii)通过乳房内输注向非人哺乳动物受试者施用所述乳房内兽用组合物的说明书。
34.根据权利要求33所述的药盒，其用于根据权利要求1至21中任一项所述的方法。
35.根据权利要求33或34所述的药盒，其用于预防未患乳腺炎的非人哺乳动物受试者中的乳腺炎。
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