CN111607562A - 一种成纤维干细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种成纤维干细胞培养方法，包括以下步骤：人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手，倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数，将培养用液置低于37℃预热，用0.1％新洁尔灭溶液擦净，打开超净台的紫外灯照射台面15‑25min。本发明通过培养的成纤维干细胞能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用，通过培养的成纤维干细胞对骨骼系统的作用，可促进生成大量的成骨细胞、抑制破骨细胞，治疗骨质疏松、股骨头坏死、关节炎、风湿病和因钙缺乏导致的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，特别涉及一种成纤维干细胞培养方法。
背景技术
众所周知，细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂(如琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须解决细胞离体培养问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种成纤维干细胞培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明一种成纤维干细胞培养方法，包括以下步骤：
(1)准备：人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手，倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数，将培养用液置低于37℃预热，用0.1％新洁尔灭溶液擦净，打开超净台的紫外灯照射台面15-25min，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧，点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内，将培养用液瓶口用75％酒精消毒；
(2)复苏：干细胞在37℃、5％CO2和95％湿度的培养条件下,生长在铺有一层滋养细胞层，在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的成纤维干细胞，把融化的细胞悬浮液加到预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，3-5min离心收集细胞，除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃含有5％CO2的加湿培养箱中培养，根据情况对细胞进行换液，放置3-4天，细胞基本长满整个培养皿，可以进行传代、冻存或用于后续试验；
(3)传代：吸掉培养基，用不含二价离子的PBS洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，在37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来，用1ml的ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，离心5min，去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养，ES细胞的分配比1:1到1:10；
(4)冻存：吸掉培养基，用PBS洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来，用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，离心5min，去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞，按每管1ml的量分装到冻存管中，梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1：本发明通过培养的成纤维干细胞能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用。
2：本发明通过培养的成纤维干细胞对骨骼系统的作用，可促进生成大量的成骨细胞、抑制破骨细胞，治疗骨质疏松、股骨头坏死、关节炎、风湿病和因钙缺乏导致的疾病。
3：本发明对消化系统的作用：加强胃肠功能，促进消化酶的分解，增进食欲，治疗慢性胃炎。
4：本发明对血液系统的作用：加强骨髓造血功能，促进干细胞生成，进而生成大量红细胞和白细胞，加强左心室厚度，增强心肌弹性力，高效治疗心脏病，有效清除血液中低密度蛋白，防止在血管壁沉积，治疗血栓。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供一种成纤维干细胞培养方法，包括以下步骤：
(1)准备：人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手，倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数，将培养用液置低于37℃预热，用0.1％新洁尔灭溶液擦净，打开超净台的紫外灯照射台面15-25min，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧，点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内，将培养用液瓶口用75％酒精消毒；
(2)复苏：干细胞在37℃、5％CO2和95％湿度的培养条件下,生长在铺有一层滋养细胞层，在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的成纤维干细胞，把融化的细胞悬浮液加到预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，3-5min离心收集细胞，除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃含有5％CO2的加湿培养箱中培养，根据情况对细胞进行换液，放置3-4天，细胞基本长满整个培养皿，可以进行传代、冻存或用于后续试验；
(3)传代：吸掉培养基，用不含二价离子的PBS洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，在37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来，用1ml的ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，离心5min，去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养，ES细胞的分配比1:1到1:10；
(4)冻存：吸掉培养基，用PBS洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来，用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，离心5min，去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞，按每管1ml的量分装到冻存管中，梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
具体的，成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质具有合成和分泌蛋白质、胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质等功能，这种细胞具有合成和分泌蛋白质、胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质等功能。参与人体窗口的修复工作是成纤维细胞的一大作用。通过有丝分裂大量增殖，并合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管的共同形成肉芽组织，增补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。成纤维干细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链，多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子。前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维，在结缔组织中，成纤维干细胞还以其成熟状态—纤维细胞的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位。成纤维干细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维干细胞。
本发明通过培养的成纤维干细胞能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，在创伤愈合及肢体再生中发挥作用，通过培养的成纤维干细胞对骨骼系统的作用，可促进生成大量的成骨细胞、抑制破骨细胞，治疗骨质疏松、股骨头坏死、关节炎、风湿病和因钙缺乏导致的疾病，对消化系统的作用：加强胃肠功能，促进消化酶的分解，增进食欲，治疗慢性胃炎，对血液系统的作用：加强骨髓造血功能，促进干细胞生成，进而生成大量红细胞和白细胞，加强左心室厚度，增强心肌弹性力，高效治疗心脏病，有效清除血液中低密度蛋白，防止在血管壁沉积，治疗血栓。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种成纤维干细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准备：人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手，倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数，将培养用液置低于37℃预热，用0.1％新洁尔灭溶液擦净，打开超净台的紫外灯照射台面15-25min，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧，点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内，将培养用液瓶口用75％酒精消毒；
(2)复苏：干细胞在37℃、5％CO2和95％湿度的培养条件下,生长在铺有一层滋养细胞层，在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的成纤维干细胞，把融化的细胞悬浮液加到预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，3-5min离心收集细胞，除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃含有5％CO2的加湿培养箱中培养，根据情况对细胞进行换液，放置3-4天，细胞基本长满整个培养皿，可以进行传代、冻存或用于后续试验；
(3)传代：吸掉培养基，用不含二价离子的PBS洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，在37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来，用1ml的ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，离心5min，去掉上清，用ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养，ES细胞的分配比1:1到1:10；
(4)冻存：吸掉培养基，用PBS洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来，用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，离心5min，去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞，按每管1ml的量分装到冻存管中，梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
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| CN109266600A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-25 | 郑育洪 | 一种成纤维细胞的培养基及利用其培养成纤维细胞的方法 |
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