CN111601596B - 无规杂聚物在外部环境中保留蛋白质功能 - Google Patents

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Abstract

包含与活性蛋白质复合的统计上无规的杂聚物，并且被配制并用于由蛋白质和合成材料组成的刺激反应性材料和纳米反应器的组合物。

Description

无规杂聚物在外部环境中保留蛋白质功能
本发明是在国防部陆军研究办公室(the Department of Defense,ArmyResearch Office)授予的授权号为W911NF-13-1-0232和W911NF-16-1-0405的政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。
介绍
将活性蛋白质成功地掺入合成聚合物中可以产生具有仅在活体系统中才发现的功能的新型材料。但是，蛋白质在适于聚合物加工的条件下很少发挥作用。基于对蛋白质序列的趋势和蛋白质表面上的特征化学模式的分析，我们设计了多单体无规杂聚物，以模拟固有无序的蛋白质在非天然环境中的蛋白质溶解和稳定。具有优化的组成和统计学单体分布的杂聚物能够无细胞合成具有适当的蛋白折叠性能的膜蛋白质用于运输，以及含酶的塑料用于毒素生物修复。控制杂聚物中的统计学单体分布，而不是特定的单体序列，提供了用于基于蛋白质的生物材料的与生物系统对接新的策略。
发明概述
我们公开了统计上无规的杂聚物(SRHP)的优化，以充当合成的分子伴侣并将蛋白质有效地分散在有机溶剂中，而不损害蛋白质结构和酶活性。使用SRHP，当溶解于有机溶剂，如甲苯中时，我们已经能够保留辣根过氧化物酶(HRP)的大部分(约80％)酶活性以及绿色荧光蛋白(GFP)的大部分(接近100％)荧光。此外，我们证明具有包封的蛋白质的纳米反应器可以与有机介质中的底物以及包封于反相胶束中的底物发生酶促相互作用。最后，我们展示了蛋白质溶解于有机溶剂的能力如何实现独特的加工技术，例如能够将HRP静电纺丝成疏水性纳米纤维垫。
本发明提供了包含与活性蛋白质复合的统计上无规的杂聚物的组合物，以及制剂和在由蛋白质和合成材料组成的刺激反应性材料和纳米反应器中的用途。
一方面，本发明提供了组合物，其包含在有机溶剂中的活性蛋白质和统计上无规的杂聚物(SRHP)的复合物，所述有机溶剂如2-丙醇、丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙酸乙酯、己烷、甲醇、四氢呋喃和甲苯，特别是如果不与SRHP复合时将以另外的方式有效地使蛋白质变性或使其失活的溶剂。
在实施方案中：
-所述杂聚物分散于水性和有机介质两者，
-所述杂聚物的单体嵌段的分布直方图以从嵌段尺寸1开始的归一化频率降低，其中嵌段尺寸10(或12)具有小于1％的归一化频率(且嵌段尺寸1具有5-20％的归一化频率)；
-所述蛋白质是酶或荧光蛋白质；
-所述溶剂选自2-丙醇、丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙酸乙酯、己烷、甲醇、四氢呋喃和甲苯；
-所述SRHP包含不同比例的多种(2-3或2-4或2-6或2-8或2-12种)单体；
-所述单体选自甲基丙烯酸甲酯(MMA)、低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA)、甲基丙烯酸3-磺丙酯钾盐(3-SPMA)和甲基丙烯酸2-乙基己酯(2-EHMA)；和/或
-SRHP具有5(MMA)∶2.5(OEGMA)∶2(2-EHMA)∶0.5(3-SPMA)的组成比。
另一方面，本发明提供了制备所公开的组合物的方法，该方法包括以下或基本上由以下组成：在水溶液中混合所述蛋白质和SRHP；干燥所述混合物；在有机溶剂中重悬所述干燥的混合物，形成所述组合物。
另一方面，本发明提供了使用所公开的组合物的方法，所述方法包括检测所述组合物中的蛋白质的活性。
另一方面，本发明提供了组合物，所述组合物包含在蛋白质表达系统中的活性蛋白质和统计上无规的杂聚物(SRHP)的复合物，其中所述蛋白质被表达并被掺入到所述复合物中。
在实施方案中：
-与没有SRHP的表达系统相比，所述复合物增强了蛋白质的活性；和/或所述表达系统是无细胞系统。
另一方面，本发明提供了制备所公开的组合物的方法，所述方法包括以下或基本上由以下组成：在所述SRHP的存在下表达蛋白质，其中所述SRHP和蛋白质形成复合物。
另一方面，本发明提供了使用所公开的组合物的方法，所述方法包括以下或基本上由以下组成：在其中蛋白质从所述复合物重定位到脂质体的条件下，例如在其中蛋白质以活性跨膜蛋白的形式定位到脂质体的条件下，使所述复合物与所述脂质体接触。
本发明包括本文所述的特定实施方案的所有组合，如同每个组合已经被详尽地叙述过。
本发明的具体实施方案的描述
除非另有相反指示或说明，在这些描述和整个说明书中，如本文所述的，术语“一(a)”和“一(an)”表示一个或多个，术语“或(or)”表示和/或，并且多核苷酸序列理解为包括相反的链以及本文所述的供选择的骨架。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域技术人员提示鉴于其的各种修改或改变，并且将包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请，包括其中的引文，出于所有目的通过引用以其整体由此并入。
诸如蛋白质和生物机械等天然构造块具有许多合成的同类物质无法比拟的特征，包括化学多样性、层次结构、程序化的系统动力学和有效的能量转化。尽管多年来努力稳定在其天然环境之外的蛋白质，但在不损害它们的结构和固有功能的情况下，在连接生物和合成组分方面的发展仍然有限。通过反相胶束的非水性酶学只能维持天然活性的部分(<20％)(1)；amphipol可溶解膜蛋白，但不能溶解有机溶剂中的水溶性蛋白(2)；聚合物缀合依赖于蛋白质官能团的可及性(3)；以及溶胶-凝胶限制使蛋白质的可及性和后期整合受限(4)。
蛋白质外部的分子伴侣样聚合物壳可以通过提供抵抗有机溶剂暴露和蛋白质构象变化的屏障来有效改善蛋白质在有机溶剂中的溶解度和稳定性。为了形成这种纳米级聚合物壳，蛋白质-聚合物相互作用需要足够强以促进吸附，又需要足够温和而不超过控制蛋白质折叠的力。天然构造块的结构和活性受多种非共价相互作用的控制，这些相互作用会随着小扰动而发生变化(5)。当均聚物缀合到蛋白质表面时，单体-氨基酸相互作用会影响蛋白质折叠(6、7)并使聚合物链的构象变形(8)。在自然界中，固有无序的蛋白质采用通常通过多个弱结合位点实现的局部链构象，并介导各种加工(9、10)。考虑到蛋白质的多样性和复杂性，模拟无序蛋白质的两亲性杂聚物可能为蛋白质溶解和稳定提供通用的方法。
蛋白质表面在化学上是多样的和异质的。基于疏水性或电荷的折叠的水溶性蛋白质的表面分析显示出特征性斑块尺寸分布。典型的斑块尺寸为直径1-2nm，斑块间距离为1-2nm。使用甘氨酸作为参照，通过将氨基酸分配为亲水性或疏水性的来进行水溶性蛋白质的序列分析(11)，表明具有相似疏水性的氨基酸嵌段长度往往小于10。已显示匹配统计化学模式在从头蛋白质设计(12、13)和调节聚合物/表面的相互作用(14)中至关重要。除了合成特定序列的聚合物(15)以外，具有相似化学特征和侧链空间分布以匹配天然蛋白质表面样式的合成杂聚物可能表现得像无序蛋白质一样。
可逆的失活自由基聚合的最新进展使得在可靠控制统计单体分布的情况下合成无规杂聚物成为可能(16-18)。选择了四种基于甲基丙烯酸酯的单体以赋予杂聚物化学多样性并优化短程聚合物-蛋白质相互作用：甲基丙烯酸甲酯(MMA)、低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA，Mn＝500Da)，甲基丙烯酸2-乙基己酯(2-EHMA)和甲基丙烯酸3-磺丙酯钾盐(3-SPMA)。MMA旨在调整总体疏水性用于蛋白质增溶，以将链锚定在极性-非极性界面处，并减少与调节其局部构象相关的熵损失。OEGMA旨在利用聚(乙二醇)(PEG)的熟知的能力来稳定蛋白质。选择2-EHMA和3-SPMA以分别与蛋白质表面上的疏水残基和带正电荷的残基相互作用。单体比的选择由计算的溶解度参数(19、20)指导，并通过实验筛选以在最佳的酶活性保留的情况下实现聚合物在水性和有机介质中的分散。我们的性能最好的杂聚物称为“RHP”，其组成比为5(MMA)：2.5(OEGMA)：2(2-EHMA)：0.5(3-SPMA)。我们使用公认的Mayo-Lewis方程估算沿RHP链的统计单体分布(21、22)。单体嵌段尺寸的直方图证实了不存在会干扰天然蛋白质结构的同一单体的长嵌段。使用的RHP的数均分子量为～30kDa，分散度为1.3。以极好的可重现性合成了至少12批RHP。
对在水性缓冲溶液和甲苯二者中的常见酶，辣根过氧化物(HRP)和RHP的混合物进行了计算研究，以阐明聚合物-蛋白质吸附机理。使用CHARMM 36电势进行了显式溶剂全原子分子动力学(MD)模拟(补充，S3节)。构建了组成和聚合度接近相应的实验值的RHP。在甲苯和水中的RHP/HRP混合物的模拟快照显示，在水中，RHP和HRP松散复合，只有～40％的HRP表面被RHP覆盖，这与RHP溶于水的实验观察结果一致。但是，在甲苯中，HRP表面被RHP完全覆盖；该复合物是稳定的，在0.6μs的模拟持续时间内未观察到蛋白质结构变化。计算出在甲苯和水中RHP在蛋白质质心周围的径向分布。在甲苯中，聚合物的亲水性单体(OEGMA和3-SPMA)指向内部，与蛋白质相邻，而疏水性单体(MMA和2-EHMA)位于外部，与甲苯接触。相反，RHP侧链的优先取向在水中变弱。这些结果表明，一旦位于蛋白质表面附近，RHP便可以调节其构象以最大化蛋白质-聚合物相互作用，这与我们的假设很好地相关。通过将ALA、VAL、ILE、LEU、MET、PHE、TYR、TRP、GLY和PRO氨基酸分类为疏水性，将其他氨基酸分类为亲水性，计算出蛋白质表面基团与其最近的邻近单体(monomer neighbor)之间的相关性。大约70％的蛋白质表面被亲水性单体覆盖；50±4％来自亲水性单体-亲水性氨基酸相互作用，贡献-800±300kJ/mol的能量。这表明局部蛋白质表面-聚合物相互作用在稳定蛋白质结构中的重要性。在有机溶剂中，由围绕HRP核的聚合物形成的壳通过提供抵抗有机溶剂暴露和蛋白质构象变化两者的屏障，改善了蛋白质的溶解度和稳定性。
基于从全原子MD模拟和实验收集的数据，使用粗粒度模型研究了RHP的组成对它们在水和甲苯中包封蛋白质的能力的作用(补充，S4节)。进行了RHP完全包封蛋白质的代表性快照。对于所有溶剂的选择性条件，表面覆盖率随吸附单体和蛋白质吸引位点之间的吸引力强度εHh的增加而增加(由聚合物疏溶剂珠之间的吸引力强度εhh捕获的)。对于足够高的εhh，存在使表面覆盖率最大化的吸附单体分数的最佳值(φA)。吸附单体与蛋白质吸引位点之间的空间相关性表明，一旦与蛋白质接触，RHP倾向于采用在能量上有利的构象，以补偿与限制到表面相关的熵损失(23)。
我们通过实验检验了我们的假设，即RHP能够与蛋白质相互作用并介导它们与局部环境的相互作用。我们进行了膜蛋白的无细胞合成，其消除了来自宿主细胞生理的对于翻译过程中的蛋白折叠和脂质插入的潜在干扰或辅助(24)。一旦添加用于模型跨膜蛋白、寡肽/质子同向转运蛋白PepTso或GFP标记的水通道蛋白Z(AqpZ)的质粒，就基于C末端融合的绿色荧光蛋白(GFP)的荧光强度对膜蛋白质的翻译和折叠状态评分。无论是否存在RHP，使用抗GFP抗体的蛋白质印迹分析均证实了PepTso-GFP的表达。在没有RHP的情况下，未检测到GFP荧光，表明蛋白质折叠不正确而未获得GFP荧光(25)。使用在蛋白质表达后有效稳定膜蛋白的amphipol(A8-35)的对照实验显示，aqpZ的GFP荧光很少(2)。但是，当在RHP存在下，以RHP：核糖体摩尔比为50：1表达PepTso-GFP或AqpZ时，GFP荧光增加约15倍。所得的GFP荧光比常用脂质体的荧光高出超过一个数量级。为了进一步验证蛋白质折叠，将无细胞合成的PepTso重构在脂质体中，并在基于荧光黄的质子转运分析中对其测试(26)。通过向含有二肽Ala-Ala的外部溶液中添加缬氨霉素来检测质子转运。在RHP存在下，无细胞合成的PepTso可以正确折叠以在脂质环境中保留转运功能。因此，RHP能够陪伴蛋白正确折叠并使膜蛋白溶解在水溶液中，但不会超过蛋白质-脂质相互作用、干扰脂质插入或损害通道转运功能。
我们研究了蛋白质在有机溶剂中的分散和稳定，这是将蛋白质连接到合成构造块获取蛋白质的材料的要求。以前的HRP非水性酶学研究观察到，在可以提取血红素辅因子的疏水性溶剂中，活性降低了100倍以上(27)。对于所有研究，首先将蛋白质和RHP共同溶解在去离子水中，冻干，然后再重新悬浮在溶剂中。RHP/HRP复合物易于溶于用于材料合成和加工的常用溶剂，例如甲苯和氯仿。TEM结果表明，RHP/HRP复合物形成直径～50-60nm的纳米颗粒。在将RHP/HRP复合物溶解在甲苯中24小时后，收集傅立叶变换红外光谱(FT-IR)。酰胺I谱带及其相应的负二阶导数显示HRP的二级结构在甲苯中变化最小。在24小时内，在HRP中的血红素辅因子的紫外-可见光谱中未观察到明显变化，证实在甲苯中HRP三级结构的保留和血红素结合口袋的稳定性，这对酶活性至关重要。为了评价悬浮在甲苯中后HRP活性的保留，将RHP/HRP甲苯溶液的等分试样分散在水溶液中以进行比色分析。在RHP的存在下，悬浮在甲苯中24小时后，保持约80％的HRP天然活性。这比在非水性介质中单独的HRP高几个数量级，比使用分子和/或聚合物表面活性剂的最佳报告值高至少四倍(1)。
我们通过将研究扩展到其他蛋白质来探索RHP的多功能性和通用性。PEG化对蛋白质的分散和稳定有效，但对具有少量官能团的蛋白质，例如葡萄糖氧化酶(GOx)无效(28)。PEG化足以使GOx分散，但2小时后蛋白质保留不到10％的天然活性。相反，RHP/GOx在甲苯中储存24小时后显示出～50％的天然活性。还测试了具有不同结构的蛋白质，例如β-桶GFP(β-barrel GFP)。将RHP/GFP复合物溶于有机溶剂中后，在24小时内，在发射的荧光中没有检测到荧光发射峰的最大值和最小值减少的变化。这些结果证实，β-桶内部的环境保持不变，并表明基本上排除甲苯渗透到蛋白质核心中。
RHP实现的蛋白质的溶解和稳定可以产生技术上相关的基于蛋白质的材料。选择有机磷水解酶(OPH)是因为它的出色的降解有机磷酸酯的能力，通常用作杀虫剂和化学战剂(29)。然而，OPH即使在其部分折叠的二聚体状态下也变得不活泼(30)，并且有机磷酸酯在水溶液中的溶解度通常差。有必要在与有机磷酸酯共溶时保留OPH活性，以实现对这些急性毒素的按需生物修复。使用熟知杀虫剂甲基对硫磷(MP)的10mM制剂评价OPH活性。RHP/OPH可以容易地溶解在甲苯和氯仿中，然后重悬在缓冲溶液中。在甲苯中悬浮24小时后，RHP/OPH保留了初始OPH活性的80±5.6％(N＝3)。当甲基对硫磷与RHP/OPH共同溶解在甲苯中、干燥并分析时，OPH活性比在水溶液中的纯OPH活性高7倍以上。这归因于甲苯中较高的底物浓度，以及RHP在水性和有机介质两者中稳定OPH的能力。RHP/OPH复合物的成功分散和稳定实现OPH和合成聚合物的共加工。通过静电纺丝制备了基于聚环氧乙烷(PEO)或PMMA的纤维垫，并测试了生物修复。两种纤维垫都有活性，并在几分钟内降解了大约占总纤维垫十分之一的MP。特别地，当将RHP/OPH/PEO纤维垫浸泡在含MP的甲苯溶液中并在缓冲液中分析时，可以捕获水解副产物以便于去除。这实现毒素的原位修复，而无需在解毒之前和之后的预处理、转移或与药剂接触。
我们的研究证实，基于统计学单体分布设计的无规杂聚物有效地维持了外部环境中的蛋白质功能。我们证实了具有正确折叠的膜蛋白的成功无细胞合成，并且多种蛋白质在有机溶剂中保留了蛋白质活性。这些杂化材料不仅利用了天然构造块的精密度和效率优势，而且在无法得到常规化学必需品的情况下，能够实现按需反应和加工。
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补充材料
S1节.蛋白质分析
S1.1使用PyMOL1.5.0.3分析蛋白质表面
从蛋白质数据库(Protein Data Bank)获得辣根过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)、绿色荧光蛋白(GFP)和α-胰凝乳蛋白酶(α-CT)的晶体结构–分别是1H55、1CF3、2HRW和1YPH。使用PyMOL将蛋白质表面简化为不带电荷的亲水性、疏水性、阳离子或阴离子斑块。将斑块近似为具有不同直径的圆，并使用直线从一个斑块的中心到相邻斑块的中心测量化学上类似的斑块之间的距离。将测量结果归类为最接近的整数，然后通过模式频率对频率归一化。绘制带电斑块的直径和距离的直方图。
S1.2基于二元疏水性的蛋白质序列分析
程序在来自蛋白质数据库(PDB)文件的氨基酸序列中读取，并为每个氨基酸分配0或1的值。所有比甘氨酸更亲水的氨基酸均被分配0的值，而所有比甘氨酸更疏水的氨基酸，包括甘氨酸，均被分配1的值。该标度是对Monera等人建立的标度(11)的二进制改造。然后，从链的起点开始，计算两个亲水性残基之间的距离，以确定该疏水性嵌段的大小。重复此过程，直到整条链被分析。
S2节.RHP合成与表征
S2.1.通过RAFT聚合合成RHP
在使用前，使甲基丙烯酸甲酯(1，99％，Aldrich)、乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(2，99％，Mn＝500g/mol，Aldrich)和甲基丙烯酸2-乙基己酯(3，98％，Aldrich)先通过中性氧化铝短柱以去除抑制剂。直接使用甲基丙烯酸3-磺丙酯钾盐(4，98％，Aldrich)和最纯级的溶剂(Aldrich)。如先前所述合成S-甲氧基羰基苯基甲基二硫代苯甲酸酯(5)RAFT链转移剂(31)。
将在N,N-二甲基甲酰胺(3.2mL)中的1(513mg，5.13mmol)、2(1280mg，2.56mmol)、3(403mg，2.03mmol)、4(123mg，0.50mmol)和5(11mg，0.04mmol)的溶液通过三个冷冻-泵吸-解冻循环脱气，然后在真空下密封。在60℃下20小时后，将聚合介质在二氯甲烷中稀释，在乙醚中沉淀并在真空下干燥。将所得的聚合物溶于四氢呋喃，并使用截留分子量为6000-8000g/mol的透析膜(Spectrum Laboratories Inc.)，在四氢呋喃和水的1:1混合物中透析3天，在纯水中透析2天。透析溶液每天都更新。最后，将剩余的水溶液冷冻干燥，产生粘稠的粉红色聚合物。
S2.2.RHP序列模拟与分析
S2.2.1.RHP序列的模拟
我们进行了共聚的蒙特卡洛(Monte-Carlo)型模拟。我们定义了单体的总数目，它们的相对浓度比以及单体与RAFT比。然后，借用Mayo-Lewis共聚方程(S1，S2)(22)，输入每种单体与自身以及每种其他单体之间的反应比。最后，选择目标转化率百分比，该百分比决定了模拟的聚合物的聚合度。
Mayo-Lewis方程：
Figure BDA0002587216050000121
其中[Mx]是单体x的浓度，并且
Figure BDA0002587216050000122
瞬时形式
Figure BDA0002587216050000123
其中，fx是进料中单体x的摩尔分数，Fx是共聚物中单体x的摩尔分数。
模拟分为三个步骤：(i)开始，(ii)增长和(iii)结束。下面概述了每个步骤的简单讨论。
开始。给定链上的第一单体是基于该单体的相对浓度比确定的，例如，如果MMA为单体总批量的50％，则MMA为第一单体的概率为50％。然后，通过考虑上述加权概率随机选择单体之一，通过默认的理想化引发剂引发每条链，而不偏好任何特定单体。针对单体与RAFT之比限定的模拟链的总数完成此操作。
增长。然后，基于给定单体添加到模拟链中位于其前面的单体的概率增长每条链。首先，根据等式w＝r×[M]建立用于每条链的加权因子，其中w是加权因子，r是给定单体对的反应性之比，并且[M]是添加的单体的当前浓度。这些加权因子被归一化以产生每种类型的添加事件发生的概率。然后，基于先前计算的概率，由一种单体随机增长链，并从总单体库去除添加的单体。对于所有链均已完成此步骤，此时该过程将循环回到第一个增长步骤。
结束。增长过程进行直到实现目标转化百分比为止。
如Manders等人确定的(21)，假设甲基丙烯酸亚甲酯(OEGMA、EHMA、SPMA)的反应率相等，而MMA的值降低，进行4-单体模拟。(表S1)。
如13C-NMR所观察到的，该关于反应性的假设的有效性得到了单个单体转化的支持，这表明在所有的总体转化中，甲基丙烯酸亚甲酯(OEGMA、EHMA、SPMA)的消耗量相等，而MMA的转化较低。
S2.3.RHP的特征
使用5mm BBFO+探针，以Bruker Avance III 400光谱仪在363K下进行1H NMR和1H-13C异核单量子相干(HSQC)2D NMR光谱(1H为400MHz，13C为100MHz)。使用10mm选择性13CSEX探针，以Bruker Avance II 400光谱仪在363K和100MHz下进行通过极化转移(DEPT135)光谱的定量13C NMR无畸变增强。将聚合物样品作为在N,N-二甲基甲酰胺-d7(DMF-d7)中的约15％(w/v)的溶液进行检查。参照残留的氢化溶剂，以ppm为单位给出化学位移值(δ)。使用Waters 717Plus自动进样器，515HPLC泵，2410差示折光仪，2487UV-vis检测器，来自Wyatt Technology Inc的MiniDawn多角度激光散射(MALLS)检测器(测量角度为44.7°、90.0°和135.4°)，来自Wyatt的ViscoStar粘度检测器和五个按以下顺序：500、103、104、105和
Figure BDA0002587216050000131
相连的Styragel HR柱，由尺寸排阻色谱(SEC)获得RHP的数均(Mn)和重均(Mw)摩尔质量以及分散度/>
Figure BDA0002587216050000132
在室温下，四氢呋喃(THF)以1.0mL/min的流速用作洗脱液。使用来自Wyatt Technology Inc.的Astra 5.4软件处理结果。
RHP的1H NMR光谱用于验证最终样品中既不存在有机溶剂也不存在单体残留。通过将1H NMR、定量13C NMR和DEPT 13C NMR和1H-13C HSQC2D NMR光谱与单体1、2、3、4和通过80mol％的1和20mol％的2、3或4中任一种的共聚获得的2-单体无规共聚物模型类似物的这些光谱比较，进行NMR信号的归属。
通过比较在51.86ppm的1(I1)、在58.43ppm的2(I2)、在68.74ppm的3(I3)和在48.77ppm的4(I4)的定量13C NMR光谱积分来进行实验单体的比率的计算。使用方程S3-S6计算单体1(i)、2(j)、3(k)和4(l)的摩尔比。
i＝I1/(I1+I2+I3+I4) (S3)
j＝I2/(I1+I2+I3+I4) (S4)
k＝I3/(I1+I2+I3+I4) (S5)
l＝I4/(I1+I2+I3+I4) (S6)
在表S2中可以找到RHP组成和SEC数据。
S2.4.通过变化转化分析组成漂移
制备一组12个单独批次的RHP，并使其进行各种转化，以检查组成漂移的可能性。除非另有说明，所有试剂均购自Sigma Aldrich，无需进一步纯化即可使用。在使用前，将偶氮二异丁腈(AIBN)在乙醇中重结晶。为了在聚合之前除去抑制剂，将甲基丙烯酸甲酯(1)和甲基丙烯酸2-乙基己酯(3)低温蒸馏(cryodistiled)，并将乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(2)通过碱性氧化铝柱。甲基丙烯酸3-磺丙酯钾盐(4)无需进一步纯化即可使用。从Aldrich购得2-(苯基硫代羰基硫基)-2-苯基乙酸乙酯(98％)，并直接使用。测试了三种不同的单体与RAFT试剂比例：572:1、286:1、191:1，每个重复四次。改变反应时间以达到近似转化。
1. 25％的转化目标(A1、A2、A3、A4)
分别向4个干净的20mL玻璃安瓿瓶中装入1(0.501g，5.00mmol)、2(1.25g，2.50mmol)和3(0.397g，2.00mmol)(全部以2.14mL的5.00：2.50：2.00M 1:2:3的溶液添加)、4(123mg，0.500mmol，以0.760mL的660mM的DMF悬浮液添加)、2-(苯基硫代羰基硫基)-2-苯基乙酸乙酯(5.5mg，0.018mmol)和AIBN(0.8mg，0.005mmol)(以0.38mL的46mM RAFT：13mMAIBN的DMF溶液添加)、三氧杂环己烷(55mg，0.61mmol，以0.090mL的6.66M的DMF溶液添加)以及1.63mL的DMF，至最终反应体积为5.0mL。
2. 50％的转化目标(B1、B2、B3、B4)
分别向4个干净的20mL玻璃安瓿瓶中装入1(0.501g，5.00mmol)、2(0.125g，2.50mmol)和3(0.397g，2.00mmol)(全部以2.14mL的5.00：2.50：2.00M 1:2:3的溶液添加)、4(123mg，0.500mmol，以0.760mL的660mM的DMF悬浮液添加)、2-(苯基硫代羰基硫基)-2-苯基乙酸乙酯(11mg，0.035mmol)和AIBN(1.6mg，0.010mmol)(以0.76mL的46mM RAFT：13mMAIBN的DMF溶液添加)、三氧杂环己烷(55mg，0.61mmol，以0.090mL的6.66M的DMF溶液添加)和1.25mL的DMF，至最终反应体积为5.0mL。
3. 75％的转化目标(C1、C2、C3、C4)
分别向4个干净的20mL玻璃安瓿瓶中装入1(0.501g，5.00mmol)、2(0.125g，2.50mmol)和3(0.397g，2.00mmol)(全部以2.14mL的5.00：2.50：2.00M 1:2:3的溶液添加)、4(123mg，0.500mmol，以0.760mL的660mM的DMF悬浮液添加)、2-(苯基硫代羰基硫基)-2-苯基乙酸乙酯(16.6mg，0.052mmol)和AIBN(2.5mg，0.015mmol)(以1.14mL的46mM RAFT：13mMAIBN的DMF溶液添加)、三氧杂环己烷(55mg，0.61mmol，以0.09mL的6.66M的DMF溶液添加)和0.87mL DMF，至最终反应体积为5.0mL。
通过4次冷冻-泵吸-解冻循环将每种反应混合物脱气，并将安瓿瓶在30毫托下火焰密封。将安瓿瓶在80℃的烘箱中放置所列的总小时数：(A1：18.25h A2：18.25h A3：2hA4：5.8h B1：18.25h B2：20.3h B3：23.3h B4：5.8h C1：5.8h C2：14.5h C3：14.5h C4：14.5h)。将每种粘性混合物在液氮中冷却然后破裂开。通过将稀释的混合物滴加到250mL搅拌的戊烷中来沉淀聚合物。然后将粉紫色沉淀物溶于10mL水中，并转移至3500MWCO离心过滤器中。通过旋转溶液减至总体积为2mL，并通过添加新鲜的水使其回升至10mL，将每种样品洗涤5次。然后将所得溶液转移至小瓶中，并在真空下干燥过夜。
使用聚合溶剂(DMF羰基在162.37ppm处)作为内标，由13C NMR计算单个单体转化。单体MMA(136.25ppm)和OEGMA(136.33ppm)可以单独解析。单体2-EHMA和SPMA不能彼此拆分(136.55ppm)，并且在转化的计算中分组。
由单个单体转化和总单体组成一起计算总单体转化。将单个转化针对所有样品的这些总转化绘图表明，与其他单体相比，MMA消耗较慢，如根据报道的与甲基丙烯酸亚甲酯(包括OEGMA)共聚时，MMA的反应活性较低所预期的。这表明从50％的起始单体组成到54-56％的MMA的轻微漂移，保持在该水平到至少70％的转化率。这表明共聚物组成中的漂移最小，并且由在所有转化时纯化的聚合物的1H NMR叠加几乎完全重叠进一步证实了这一点。
S3节.全原子分子动力学模拟
S3.1.模拟方法学
使用软件包GROMACS(5.0版)以全原子分辨率进行了经典分子动力学(MD)模拟(32)。CHARMM 36力场(33，34)和兼容的CHARMM通用力场(CGenFF)(35，36)用于所有研究的分子，这已在GROMACS中实施(33)。在研究大分子(天然和合成两者)系统中已经很好确立了CHARMM 36力场(37)。
从RSCB蛋白质数据库下载蛋白质HRP的结构，蛋白质ID为1H55。RHP采用的聚合度(DP)为80，接近实验摩尔重量20kDa(DP约为88)。在构建单条RHP链时，将随机种子进行变化以匹配MMA：2-EHMA：OEGMA：3-SPMA＝10：4：5：1的实验组成比。因此，每条聚合物链均以随机顺序包含40个MMA、16个2-EHMA、20个OEGMA和4个3-SPMA单体。使用不同的随机种子总共构建了12条不同的RHP链，以使聚合物的浓度与蛋白质的浓度之比与实验值匹配。为了研究溶剂对RHP包封蛋白质的影响，研究了两种不同的溶剂条件，水溶液和有机(甲苯)溶液。组分的组成在表S3中提供。
由于长聚合物链的性质，包封动力学超出了原子MD模拟的能力。因此，采用一些方法来加速聚合物-蛋白质聚集过程。具体地，首先在真空条件下进行模拟，然后在400K的高温下模拟，然后在室温(298K)下进行生产模拟。
使用程序包PACKMOL构建聚合物-蛋白质复合物的初始结构(38)。最初将蛋白质分子放在所有维度的边长均为15nm的盒子的中央。随后将12条聚合物链排列在蛋白质周围，其中四个-SO3 -基团中的一个分布在距蛋白质分子的质心4nm的距离内。注意到蛋白质分子的尺寸约为6×4×4nm3。在使用最速下降算法将短时能量最小化后，在真空条件下模拟聚合物-蛋白质复合物1ns的持续时间。在模拟结束时，所有聚合物链都聚集在蛋白质分子周围。在真空条件下的模拟中，通过V-rescale恒温器(参考温度为400K，特征时间为0.5ps)采用NTV系综(恒定的颗粒数、温度和体积)。使用1000KJ/mol/nm2的力常数将蛋白质分子的骨架原子约束在其初始坐标处，以维持蛋白质分子的结构。
基于在真空条件下该模拟的最终框架，随后将聚合物-蛋白质复合物包埋在有机甲苯溶液或水溶液中。添加的溶剂分子的数量参见表S3。它们被用作以下在有机或水溶液下的模拟的初始结构。在以下的模拟中，在所有三个维度都施加了周期性边界条件；以最高达1.2nm的距离进行邻域搜索，并且每10个时间步长更新一次；使用Lennard-Jones(LJ)12-6电势的短程范德华相互作用在1.2nm处被截断，并且对能量和压力均进行了长程色散校正；短程库仑相互作用也在1.2nm处被截断，而长程相互作用则使用平滑Particle MeshEwald算法计算得出(39,40)。此外，为了加快模拟速度，通过使用LINCS算法约束涉及氢原子的共价键，采用2fs的模拟时间步长(41,42)。为了加快获得最佳聚合物-蛋白质聚集物结构的过程，首先在400K的温度下对模拟进行了首次模拟，这充当增强蛋白质-聚合物聚集的模拟采样的简单手段。将NTP系综(恒定的颗粒数、温度和压力)与通过V-rescale算法耦合的温度和各向同性的Berendsen恒压器(参考压力1巴)一起应用。进行了40ns的模拟持续时间，在此期间再次约束蛋白质骨架原子以维持结构。
随后在298K的室温下进行生产模拟。关闭蛋白质分子的位置限制，使其完全松弛以获得最佳结构。将NTP系综与通过Parrinello-Rahman算法耦合的压力一起施加(参考压力1巴，特征时间4ps，可压缩性4.5×10-5巴-1)。通过Nose-Hoover算法分别耦合蛋白质、聚合物和溶剂(甲苯或水)的温度(参考温度298K，特征时间0.5ps)。以50ps的频率保存帧。甲苯系统模拟了600ns的持续时间，最后400ns用于数据分析。水系统模拟了200ns。
为了证明全原子MD模拟的收敛性，我们计算了在400K和298K下的甲苯溶液模拟中的蛋白HRP和12条聚合物链的骨架原子的回转半径(Rg)和均方根偏差(RMSD)。对水溶液模拟进行了类似的计算。此外，我们计算了两个系统中的系统势能和密度作为所述模拟时间的函数。获得的结果支持在甲苯和水溶液模拟中蛋白质-聚合物聚集行为的收敛性。注意到，微秒或超过微秒的更长的模拟，或者增强的采样方法(例如，元动力学(43,44)，副本交换(45))，可以为全原子模拟的收敛性提供进一步的证据。然而，这些方法对于复杂的大长度规模的模拟，如这里研究的蛋白质-聚合物聚集物而言，在计算上非常昂贵。
S3.2.证明CHARMM36力场合理性的对照全原子模拟
除了上述三个系统，还进行了对照模拟。在对照系统中，在水溶液中除了HEME-Fe的配体分子、乙酸根离子、Ca2+离子和403个水分子外，还溶解了一个蛋白质分子。还参见表S3。所有的模拟参数均与上述298K下的生产模拟中的参数相同。计算的蛋白质骨架原子的二级结构和RMSD的收敛性证明使用CHARMM36力场是合理的。
S3.3.蛋白质包封
蛋白质-聚合物复合物形成核-壳结构，其中蛋白质1H55被聚合物包封。
S3.4.蛋白质HRP的二级结构
基于VMD软件包下的STRIDE方法计算蛋白质1H55残基的二级结构(表S4)(46)。
S3.5.甲苯中蛋白质表面残基与其最近的邻近聚合物之间的相关性
为了量化蛋白质表面和周围的聚合物单体之间的相关性，将蛋白质表面残基以及周围的聚合物单体被分成亲水的和疏水的。对于蛋白质，以下残基被认为是疏水的：ALA、GLY、ILE、LEU、MET、PHE、PRO、TRP、TYR和VAL，而所有其他蛋白质残基被认为是亲水的。对于聚合物，MMA和2-EHMA单体被认为是疏水的，而OEGMA和3-SPMA单体是亲水的。
首先，通过假定蛋白质为大致球形的形状来标记在表面上的蛋白质骨架原子。为此，搜索所有的蛋白质骨架原子。基于蛋白质骨架原子(xc，yc，zc)的质心(COM)，隐含包括了半径为5nm(大于蛋白质半径)的假想球壳。对于位于(x，y，z)处的每个聚合物骨架原子，基于从蛋白质COM(xs，ys，zs)到蛋白质骨架原子(x，y，z)的矢量，获得在球壳上最近的位置(xs，ys，zs)。然后，搜索所有的蛋白质骨架原子，以发现到壳上位置(xs，ys，zs)最接近的一个，因此将其标记为蛋白质表面原子。基于所有标记的蛋白质表面原子，定量计数蛋白质表面的亲水/疏水特征。
基于标记的蛋白质表面原子，标记那些聚合物尾部原子，其是在先前步骤中标记的蛋白质表面原子的最近邻近原子。在这些计算中，采用了MMA和2-EHMA单体尾部上的最后一个烃原子、OEGMA上的最后一个氧原子和3-SPMA单体上的硫原子。在将MMA和2-EHMA定义为疏水的，将OEGMA和3-SPMA定义为亲水的情况下，从而定义了与标记的蛋白质表面原子相邻的聚合物的亲水和疏水特征。
基于蛋白质表面原子及其最近的邻近聚合物尾部原子的亲水性和疏水性，定量地计算了亲水和疏水蛋白质表面与亲水和疏水邻近聚合物之间的相关性的数值概率。
类似于步骤3，如此计算了蛋白质表面残基与其邻近聚合物残基之间的分子间(Coulomb和LJ 12-6)相互作用能。
S4节.粗粒模型与模拟
我们基于从S4节获得的全原子模型和结果，开发了粗粒度模型和模拟。具体地，我们采用了在甲苯中平衡的最终HRP结构，并使用VMD软件包中的CGBuilder插件构建了基于形状的粗粒模型(47,48)。疏水残基中的原子被粗粒化为98个球形珠，并且亲水残基中的原子被粗粒化为107个球形珠。
无规共聚物被模型化为由分别对应于单体MMA、2-EHMA、OEGMA和3-SPMA的4种类型A、B、C和D的P＝20个珠组成的线性链。链中连续珠之间的键通过有限扩展的非线性弹性(FENE)弹簧连接。尽管其简单，但证明线性链模型足以定性地捕获在我们的全原子MD模拟和实验中观察到的蛋白质表面上的聚合物的吸附行为。
在开发当前的CG模型时，我们选择关注聚合物珠之间的短程吸引力之间和聚合物珠之间的竞争，而将静电相互作用留待将来研究。这对于本研究是合理的，因为在实验条件下HRP表面上的带电残基的分数推测起来很小。这样，吸附聚合物珠(即A型和B型的)与聚合物吸引位点之间的相互作用是通过12-6Lennard-Jones(LJ)电势来建模的，其能阱深度εHh表征了吸附强度。溶剂选择性是由A型和B型聚合物珠本身之间的有效吸引通过LJ电势来建模的，其能阱深度为εhh。LJ电势在3.0σ的截止距离处被截断并迁移至零。其他珠类型之间的有效相互作用是通过纯斥力的Weeks-Chandler-Andersen(WCA)电势建模的。
使用朗格温(Langevin)恒温器在恒定的温度和体积下进行CG模拟。隐式处理溶剂分子和抗衡离子，并且其作用通过由朗格温恒温器施加到单个珠的随机和拖曳力来建模。单个CG磁珠的运动方程受以下因素支配：
ma＝FC+FD+FR
其中m和a分别为珠质量和加速度；FC是保守力，FD＝-γv是拖曳力，且FR是随机力，根据波动耗散定理，其大小与(kBTγ/Δt)1/2成比例。模拟时间步长为Δt＝0.005τ，其中t为无量纲时间单位τ＝σ(m/ε)1/2，其中m＝1为CG珠的质量，ε＝1为WCA电势的能阱深度。无量纲设定温度为T*＝kBT/ε＝1.0。所有的CG模拟均使用LAMMPS 2016年9月20日的版本进行(49)。该蛋白质位于立方模拟盒的中心，其尺寸为具有周期性边界条件的L＝65σ。
通过谐波弹簧将蛋白质珠约束为其平衡构型，以确保维持蛋白质的整体结构，同时考虑到由于隐式溶剂和抗衡离子轰击而引起的热波动的影响。我们改变聚合物链的数量NC＝12、50和100，以涵盖在实验中以及在全原子MD模拟中使用的摩尔比(NC＝12)。CG珠的总数从N＝445到2205变化。链内单体的随机顺序是通过两种方法生成的：1)在单条链中混洗珠类型，和2)在聚合物珠的总数中混洗珠类型。当链的数量NC足够大时，如NC＝50和100时，使用第一种方法。当链的数量少时，即NC＝12，使用第二种方法，以改善单体顺序的随机性。B型和D型珠的组成始终分别固定为0.2和0.05，这与全原子MD模拟中的那些一致。当A型珠的组成φA变化时，相应调整C型珠的组成，以确保φA+φB+φC+φD＝1。
为了加速通过MD模拟的吸附过程的采样，我们使用谐波弹簧(即，使用LAMMPS中的命令fix indent)将所有聚合物链约束在半径为Rc的球形体积内。选择Rc的值，使得对于所有研究的聚合物-蛋白质摩尔比，球形限制中的聚合物珠的数量密度固定为0.1σ-3。我们的全原子MD模拟和实验条件促成选择这样的数量密度。
为了确定模拟结果不因初始构型出现偏差，我们改变了用于产生无规聚合物链的随机种子和聚合物珠的初始速度分布。为了进一步改进模拟结果的统计，我们对每个数据点进行了退火/平衡循环。在退火期间，聚合物吸引位点和聚合物吸附珠之间的相互作用被切换为纯斥力WCA电势，从而使系统在无热条件下进行退火，然后再次平衡。除了监视系统电势能之外，我们还测量每个吸引位点附近的吸附聚合物的平均数量，以证明平衡是否达到稳态。在平衡期结束时，然后收集最终构型以分析表面覆盖度、对相关函数和径向密度分布。通过使用退火/平衡循环，我们尝试避免具有强吸引力的动力学阱构型，以及获得统计上不相关的最终构型。
我们还进行了额外的哈密顿交换(Hamiltonian exchange)模拟，以确保系统在平衡时达到平衡。在哈密顿交换模拟中，我们使用了16个副本，每个副本被分配的吸附强度εHh在0.3-1.8kBT范围内。每104个时间步长尝试在相邻副本之间以εHh进行试验性交换。使用类似于Metropolis的标准接受或拒绝交换(1)。对于φA的给定值的副本交换模拟进行了5000万个时间步长。然后在运行结束时从副本收集每个εHh值获得的构型用于表面覆盖度分析。如已报道的，哈密尔顿交换运行的结果确实与从加热/冷却程序中得到的结果一致。
如下所述，我们从基于颗粒的分子模拟数据估算表面覆盖度Γ。首先，确定与聚合物珠相互作用的蛋白质珠。然后计算从蛋白质珠到蛋白质的质心的最大距离rmax。接下来，我们构建以蛋白质的质心为中心的半径为(rmax+rc)的球形体积，然后将球形表面分成面积相等的N单元，以使每个单元的尺寸约为σ。然后根据聚合物珠的坐标，将球形体积内的聚合物珠归到单元中。所占用的单元的数量与单元总数N单元之比给出了表面覆盖度Γ的近似测量值。
当A型和B型珠之间的吸引力固定为εhh＝0.8kBT，并且A的分数为φA＝0.5时，我们确定了不同吸附强度εHh的代表性最终构型。
我们还说明了针对吸附组分的不同分数φA的吸附的聚合物珠之间和蛋白质的吸引位点之间的对相关函数。对相关函数的峰高随φA的增加与表面覆盖度密切相关，表明当吸附组分的组成增加时，聚合物吸附的珠更可能与蛋白质吸引位点的分布相匹配。
我们的模拟结果表明，对于所研究的所有吸附强度，表面覆盖度随聚合物比摩尔比增加。这是因为NC与吸附珠的数量成比例，这在一定程度上具有类似的增加φA的作用。
研究了聚合物链的结构性质。确定了吸附的聚合物链的数量变化nads作为φA和吸附强度εHh的函数。随着φA增加，nad增加，因为如预期的有更多的吸附聚合物珠。然而，在较高的nad值下，由于A和B型聚合物珠之间的强烈的吸引，nads降低。nad和表面覆盖度Γ之间的强相关性可以解释如下。一方面，nad与受吸附强度支配的在能量上有利的聚合物-蛋白质接触成比例。因此，nad并且因此Γ随φA和蛋白质吸引位点的密度和分布而增加。另一方面，与未吸附的那些相比，nad的特征在于由于链的表面限制造成的熵损失。当εhh增加时熵损失减小，这是因为未被吸附的A和B型聚合物珠易于聚集。然后，Γ的最佳值和nads的最大值则归因于聚合物避免由于限制到表面导致的熵损失的趋势和其最大化它们在能量上有利的接触的趋势之间的竞争。
我们对吸附的聚合物链的结构分析显示吸附珠和对于不同的吸附强度的聚合物吸引位点的对相关函数，这与来自S3节中我们的全原子MD模拟的发现是一致的。我们的结果进一步显示来自蛋白质质心的聚合物珠对于不同的吸附强度的径向密度分布。随着εHh增加，密度分布的峰值迁移至更高的值并更接近蛋白质表面。
S5节.RHP介导的无细胞合成和蛋白质-RHP复合物
无细胞蛋白质合成。根据修订的PURExpress手册进行无细胞蛋白质合成。简言之，在25μl反应中，将RHP以50/1(摩尔/摩尔)的比例添加到核糖体溶液，并在冰上孵育30分钟。将聚合物/核糖体样品与溶液A和B混合，该溶液A和B包含所有其他所需的酶、RNA、能量和营养分子。加入20个单位的RNA酶抑制剂和200ng质粒用于PepTso-GFP、PepTso或AqpZ-GFP，并将混合物在37℃下孵育3小时以完成膜蛋白合成。所得样品储存在-20℃下。
蛋白质合成动力学和蛋白质印迹分析。通过在Tecan I-control infinite 200酶标仪上测量GFP标签的荧光强度监测PepTso-GFP和AqpZ-GFP无细胞合成的动力学。将无细胞蛋白质合成混合物在384孔板中在37℃下孵育，并在3小时内记录GFP荧光(Ex/Em 480nm/520nm)。对于蛋白质印迹，首先通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离无细胞蛋白质合成样品中的蛋白质。泳道1对应于蛋白质质量标准品(光谱多色宽范围蛋白条带，(ThermoFisher))。然后将蛋白质电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。成功转移后，膜上可见多色蛋白质质量标准品。然后将膜用3％BSA封闭，与1：2000小鼠抗GFP抗体一起孵育，并洗涤。与1：4000碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠二抗孵育后，通过使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)和硝基蓝四唑(NBT)使条带显色。
膜蛋白质的重构和转运分析。遵循修订的已报道的方法进行含有PepTso的POPE/POPG(3/1)的蛋白脂质体的制备(26)。简言之，为了制备脂质体，将脂质中的氯仿蒸发，并将所得的脂质膜在真空下进一步干燥过夜。在37℃下，将干燥的脂质膜以10mg/mL在内溶液(5mM HEPES pH 6.8、1.2mM NaCl、120mM KCl、2mM MgSO4、1mM吡喃)中溶解1小时。将10μL无细胞的PepTso合成混合物添加到500μL脂质体溶液，然后使用液氮和37℃的水浴对其进行6次冷冻/解冻循环。将所得的蛋白脂质体在37℃下通过0.4μm膜挤出10次。使用不含吡喃的内溶液通过sephadex G-25脱盐柱除去过量的吡喃。在质子和寡肽转运分析之前，将含有蛋白脂质体的样品在含有0.2mM二肽Ala-Ala的外溶液(5mM HEPES pH 6.8、1.2mM KCl、120mMNaCl、2mM MgSO4)中稀释20倍。将1μM缬氨霉素添加到外溶液以启动质子转运。通过在Perkin Elmer LS55荧光光谱仪上，在带有磁力搅拌子的比色皿中在460和415nm(51)激发时，读取在510nm处的吡喃荧光的比率来测量质子转运。
将II型辣根过氧化物酶(HRP，Sigma-Aldrich)和II型葡萄糖氧化酶(GOx，Sigma-Aldrich)溶解在Milli-Q水(Millipore)中至浓度为10mg/mL。将α-胰凝乳蛋白酶(α-CT，Sigma-Aldrich)溶于具有1mM CaCl2(pH 7.75)的0.1M Tris-HCl中至浓度为10mg/mL。得到绿色荧光蛋白(GFP，Millipore)后，使用截留分子量为10kDa的Amicon Ultra-0.5mL离心滤器(Millipore)将GFP离心过滤以除去盐和甘油。然后将GFP溶解在Milli-Q水中至浓度约为1mg/mL。根据确定的程序表达有机磷水解酶(OPH)。将该酶以1.5mg/mL的浓度存储在pH 9的50mM Tris-HCl缓冲液中。将RHP以1mg/mL的浓度溶于Milli-Q水中。将双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT，Aldrich)以200mM的浓度溶解在甲苯中。聚合物表面活性剂，聚苯乙烯(22kDa)-嵌段-聚(环氧乙烷)(21.5kDa)(PS-b-PEO)购自Polymer Source，并以1mg/mL的浓度溶于甲苯中。
为了制备反相胶束，将HRP溶液以w0＝13的[H2O]/[AOT]比注入AOT溶液中，或以1:50的HRP溶液与聚合物溶液的体积比注入PS-b-PEO中。使用恒定的氮气流对悬浮液进行超声处理，混合并部分蒸发，直到光学上透明为止。加入额外的甲苯以补偿蒸发的溶剂并重新获得原始浓度。通过将RHP水溶液和蛋白质溶液以50:1的体积比合并获得蛋白质/RHP复合物。将RHP/蛋白质混合物冻干过夜，用甲苯重悬至原始浓度，然后超声处理。除GFP外，所有材料均直接使用。
S5.2.结构表征
透射电子显微术(TEM)将RHP-HRP复合物滴铸在TEM碳栅格(Ted Pella)上并干燥5分钟。随后，使用几滴水冲洗掉多余的游离聚合物。使用2w/v％的磷钨酸水溶液将样品染色2分钟。在JEOL 1200EX TEM上以80kV的加速电压拍摄TEM图像。在甲苯中，HRP/RHP形成纳米颗粒，尺寸为～50nm。
傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)为了提高信噪比，将HRP/RHP复合物的溶液浓缩至HRP浓度达到～8-10mg/mL。将溶液沉积在由CaF2窗口组成的液体单元中，其路径长度为1mm。在Thermo Scientific Nicolet 6700上，在重悬于甲苯后的0、2、4、8和24小时收集光谱。在室温下进行测量，并监测1700cm-1和1620cm-1之间的酰胺I谱带。使用内置的OMNICSpectra软件进行光谱分析。
紫外-可见光谱法(UV-Vis)在Hewlett-Packard 8453分光光度计上进行紫外-可见光谱法。将HRP/RHP复合物的甲苯溶液密封在路径长度为1cm的石英比色皿中。在室温下进行测量，并在重悬后的0、2、4、8和24小时，在350nm至800nm之间监测血红素峰的位置。
荧光光谱法使用Perkin Elmer LS-55荧光光谱仪评价GFP荧光的保留。将GFP/RHP溶解于甲苯后，立即将溶液密封在路径长度为1cm的石英比色皿中，并在450nm的激发波长下激发。监测在450nm至600nm之间的发射波长。在室温下进行测量，并在重悬于甲苯后的0、2、4、8和24小时取测量值。
S5.3.在水性缓冲液中的蛋白质活性的分析
在环境室温条件下，将溶液在甲苯中放置0、2、4、8和24小时。在指定的时间后，取等分试样，并在pH 6的100mM KH2PO4/K2HPO4磷酸盐缓冲液中稀释，以分散蛋白质和RHP。充分混合后，应用分析溶液。使用紫外-可见光谱法通过监测比色分析的转化来定量活性。
使用TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒(Bio-Rad)评估HRP活性。通过在pH 6的100mMKH2PO4/K2HPO4磷酸盐缓冲液中制备蛋白质储备溶液，并如制造商所述应用制备的TMB分析溶液来确定基线HRP活性。将溶液充分混合，并在Hewlett-Packard 8453分光光度计上进行紫外-可见光谱法。使用1-cm路径长度的比色杯，并监测370nm处的吸光度。
使用包含葡萄糖、苯酚、4-氨基安替比林和HRP的分析法评估GOx活性。通过在pH 6的100mM KH2PO4/K2HPO4磷酸盐缓冲液中制备蛋白储备溶液并使用比色分析来确定基线GOx活性。使用1-cm路径长度的比色杯，并监测505nm处的吸光度。
使用含有甲基对硫磷的分析法评估OPH活性。通过在50mM TRIS-HCl缓冲液中制备蛋白储备溶液并使用比色分析来确定基线OPH活性。使用Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000在405nm下监测OPH活性。
S5.4.其他蛋白质的RHP辅助的蛋白质分散和稳定的评价
GFP使用GFP进行类似的实验，并监测荧光作为在甲苯中的孵育时间的函数。
按照先前报道的程序进行GOx PEG化。(28)调节PEG的进料比以增加PEG化。
S5.5.含蛋白质的纤维垫
静电纺丝对于基于PMMA的电纺纤维垫，首先将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，Sigma-Aldrich)(MW＝350000g/mol)溶解在氯仿中以得到7.5wt％的溶液浓度。将200μL含有蛋白质/RHP复合物的甲苯与800μL PMMA/氯仿溶液混合。对于本研究，纤维垫中的蛋白质浓度通常在0.3-0.5wt％的范围内。即将进行静电纺丝之前，将混合物在350RPM下搅拌5分钟。然后由1mL注射器和20号针头对溶液进行静电纺丝。以水平设置将铝收集板放置在距针尖18厘米处。以0.45mL/hr的速率泵送溶液。向溶液施加8kV的电压。对于基于PEO的纤维垫，将OPH-RHP冻干并直接重悬在5.5wt％PEO(Mw＝900000g/mol)的MilliQ水溶液中。将扁平的铝收集板放置在距针尖20cm处。向溶液施加9kV的加速电压，以0.35mL/hr的流速泵送该溶液。
扫描电子显微术(SEM)使用日立TM-1000扫描电子显微镜获取静电纺丝纤维的图像。将样品安装在导电碳带上。使用15kV的加速电压获取SEM图像。
静电纺丝纤维中的OPH活性的分析在用于测量游离蛋白质活性的相同水性缓冲液中测试了负载蛋白质/RHP的纤维垫。通过溶液颜色变化目视监测活性。实现了每1mg聚合物约1μg OPH的蛋白质负载量。
Figure BDA0002587216050000241
由RAFT聚合合成RHP。
Figure BDA0002587216050000242
评价HRP活性的比色分析。
Figure BDA0002587216050000251
评价GOx活性的比色分析。
Figure BDA0002587216050000252
评价OPH活性的比色分析。
表S1. 4-单体共聚模拟中使用的反应性比。
MMA OEGMA EHMA SPMA
MMA 0.89 1 1 1
OEGMA 1 1.09 1.09 1.09
EHMA 1 1.09 1.09 1.09
SPMA 1 1.09 1.09 1.09
表S2.RHP的理化性质。
Figure BDA0002587216050000253
a由SEC确定的。
b分别通过重量分析法和定量13C NMR确定的理论/实验摩尔％。
表S3.在不同的全原子MD模拟中的HRP/RHP混合物的组成
Figure BDA0002587216050000261
a)蛋白质包含一个1H55分子及其HEME-Fe的配体、乙酸根离子、Ca2+离子和403个水分子。
b)12条DP＝80的聚合物链和48个K+抗衡离子。
c)溶剂：甲苯或水。
表S4.三种不同的全原子模拟中的二级结构的概率(％)
Figure BDA0002587216050000262
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Claims (15)

1.一种组合物，其包含在有机溶剂中的活性蛋白质和统计上无规的杂聚物(SRHP)的复合物，其中所述SRHP具有5甲基丙烯酸甲酯(MMA)∶2.5低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA)∶2甲基丙烯酸2-乙基己酯(2-EHMA)∶0.5甲基丙烯酸3-磺丙酯钾盐(3-SPMA)的组成比。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述杂聚物分散于水性介质和有机介质两者中，和/或其中所述杂聚物的单体嵌段的分布直方图以自嵌段尺寸1开始的归一化频率降低，其中嵌段尺寸10或12具有小于1％的归一化频率并且嵌段尺寸1具有5-20％的归一化频率。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述蛋白质是酶或荧光蛋白质。
4.权利要求1或2所述的组合物，其中所述溶剂选自2-丙醇、丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、乙酸乙酯、己烷、甲醇、四氢呋喃和甲苯。
5.权利要求1或2所述的组合物，其中所述蛋白质是有机磷水解酶(OPH)。
6.权利要求1或2所述的组合物，其中所述蛋白质和SRHP包含在聚合物基质中。
7.权利要求1或2所述的组合物，其中所述蛋白质是有机磷水解酶(OPH)，并且所述蛋白质和SRHP包含在聚合物基质中，并且所述基质包含纤维垫形式的聚合的聚环氧乙烷(PEO)或PMMA。
8.一种制备权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的组合物的方法，所述方法包括以下或基本上由以下组成：在水溶液中混合所述蛋白质和SRHP；干燥所述混合物；在有机溶剂中重悬所述干燥的混合物，形成所述组合物。
9.一种使用权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的组合物的方法，所述方法包括检测所述组合物中的蛋白质的活性。
10.一种组合物，其包含在蛋白质表达系统中的活性蛋白质和统计上无规的杂聚物(SRHP)的复合物，其中所述蛋白质被表达并被掺入到所述复合物中，其中所述SRHP具有5甲基丙烯酸甲酯(MMA)∶2.5低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA)∶2甲基丙烯酸2-乙基己酯(2-EHMA)∶0.5甲基丙烯酸3-磺丙酯钾盐(3-SPMA)的组成比。
11.权利要求10所述的组合物，其中与没有所述SRHP的表达系统相比，所述复合物增强蛋白质的活性。
12.权利要求10或11所述的组合物，其中所述表达系统是无细胞系统。
13.一种制备权利要求10、11或12所述的组合物的方法，所述方法包括以下或基本上由以下组成：在所述SRHP的存在下表达蛋白质，其中所述SRHP和蛋白质形成所述复合物。
14.一种使用权利要求10、11或12所述的组合物的方法，所述方法包括以下或基本上由以下组成：在其中所述蛋白质从所述复合物重定位到脂质体的条件下，使所述复合物与脂质体接触。
15.权利要求14所述的方法，其中所述蛋白质以活性跨膜蛋白的形式从所述复合物重定位到脂质体。
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