CN111593108A

CN111593108A - 与噪声性听力下降发生相关的7q36.3区域的多态性的检测方法、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111593108A
Application number: CN202010171308.8A
Authority: CN
Inventors: 牛玉光; 周钢桥; 李佳楠; 于慧颖; 李元丰; 谢成勇
Original assignee: Fifth Medical Center of PLA General Hospital
Current assignee: Fifth Medical Center of PLA General Hospital
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2040-03-12
Also published as: CN111593108B

Abstract

本发明涉及了与噪声性听力下降(Noise induced hearing loss,NIHL)患病风险相关的易感基因区域7q36.3的SNP位点rs10081191的检测方法、试剂盒及其应用。所述方法为Sequenom分型，本发明进一步涉及检测上述易感位点的试剂盒及其应用。另外，本发明将7q36.3区域的SNP位点rs10081191与NIHL的患病风险联系起来，公开了该SNP及其应用。其中，该SNP位于人类基因组区域7q36.3，确定了7q36.3是NIHL的一个新的易感基因区域，能够有效用于筛选噪声性听力损失疾病易感群体和确定噪声性听力损失疾病易感个体。

Description

与噪声性听力下降发生相关的7q36.3区域的多态性的检测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及与噪声性听力下降发生相关的7q36.3区域的多态性的检测方法、试剂盒及其应用，更具体地，本发明涉及噪声性听力损失疾病相关的SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物组和试剂盒，前述SNP标记、引物组、试剂盒在确定噪声性听力损失疾病易感个体中的用途，以及确定噪声性听力损失疾病易感个体的方法。

背景技术

噪声是生活环境中最普遍的环境污染之一。经常接触噪声可能导致噪声性听力损失(NIHL)。由于数以百万计的人每天都暴露在有害水平的噪音中，全世界大约有5％的人口遭受工业、军事或娱乐性噪声危害。因此，NIHL严重影响个人的生活质量，给社会造成巨大的经济损失。NIHL被认为是一个具有环境和遗传成分的多因素和多基因事件。已知的环境因素包括噪音、吸烟、有机溶剂接触、高血压、胆固醇。动物研究也证实遗传因素与NIHL有关。表现出年龄相关听力损失的小鼠比其他小鼠更容易受到噪声的影响。此外，敲除小鼠的基因，如Pmca2-/-、Cdh23-/-、Sod1-/-和Gpx1-/-比野生型鼠更容易受到噪声的影响。对人类的双胞胎研究表明，遗传成分在NIHL的发育过程中起着重要作用。基于候选基因的关联研究发现，一些单核苷酸多态性与NIHL的风险显著相关。这些SNPs标记的基因主要分为以下四个基因组：(i)氧化应激基因，如CAT、SOD1和SOD2；(ii)内耳钾循环途径基因，如KCNQ4和KCNE1；(iii)HSP基因，如HSP70；(iv)单基因耳聋基因，如PCDH15和MYH14。最近，在一个由25个病例和23个对照组成的欧洲人群中进行的全基因组关联研究显示，核仁蛋白(NCL)基因中的一个SNP(rs7598759)与NIHL的风险显著相关。然而，这些发现不足以解释NIHL的总遗传力。

此外，现有的NIHL的GWAS样本量有限，在中国人群中从未进行过NIHL的全基因组关联研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

为了在中国人群中发现与NIHL易感性相关的新基因，发明人进行了一项全基因组关联研究，由89例NIHL患者(例)和209例听力正常的受试者(对照组)组成，接着在一个由53例NIHL病例和360例对照者组成的独立样本集中进行验证。发明人发现7q36.3(指数rs10081191)是导致NIHL易感性的新位点。这些发现扩展了人们对NIHL遗传基础的理解。

为此，本发明的一个目的在于提出一种与噪声性听力损失疾病相关，能够有效用于确定噪声性听力损失疾病易感个体的SNP。

其中，需要说明的是，SNP(single nucleotide polymorphism,SNP，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种噪声性听力损失疾病相关的SNP。根据本发明的实施例，所述SNP为人类7号染色体158322806(hg19)位置上的碱基A或C。本发明首次将7q36.3区域的多态性位点rs10081191(位于人类基因组7号染色体158322806(hg19)位置)与NIHL的患病风险联系起来。其中，该SNP为人类基因组区域7q36.3上的多态性位点rs10081191，确定了7q36.3是NIHL的一个新的易感基因区域，能够有效用于筛选噪声性听力损失疾病易感群体和确定噪声性听力损失疾病易感个体。

根据本发明的实施例，所述SNP标记位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的方框标记处：

TGAGATCCATTCCTAGGACAGGCTGACCCCACAATAAGTAGAATTACGTCAGATATTTAGAA(SEQ IDNO：1)。

根据本发明的实施例，所述SNP标记位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的方框标记处，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的方框标记处的碱基是A或C。根据本发明的实施例，该SNP位点的AA基因型个体相比CC、AC基因型个体易感噪声性听力损失疾病。由此，该SNP位点的AA基因型可以作为确定噪声性听力损失疾病易感个体的重要标准。

即发明人发现，该SNP位点的AA基因型个体的噪声性听力损失疾病的易感性显著高于CC、AC基因型个体。进而，表明该SNP位点的AA基因型可以作为判断个体易感噪声性听力损失疾病的重要标准。进而，根据本发明的实施例，通过检测个体的上述SNP，能够有效地预测个体是否易感噪声性听力损失，具体地，如前所述，该SNP位点的AA基因型个体中易感噪声性听力损失疾病的比重显著高于CC、AC基因型个体中的比重。从而，例如所述SNP位点的基因型为AA时，则能够预测待测个体很大可能为易感噪声性听力损失疾病易感个体。由此，发明人确定，本发明的SNP位点与人类个体的噪声性听力损失疾病的易感性紧密相关，能够有效用于确定个体是否易感噪声性听力损失疾病。进而能够根据实际情况对个体进行早期选择和预防，进一步能够有效降低噪声性听力损失疾病的发生率。此外，根据本发明的一些实施例，利用本发明的SNP标记进行筛选噪声性听力损失疾病易感群体，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的本发明的一种SNP标记的引物组。根据本发明的实施例，所述引物组包含：具有SEQ ID NO：2-4所示的核苷酸序列，用于检测所述SNP标记。

具体地，引物组的序列如下所示(F为正向引物，R为反向引物，E为延伸引物)：

F:ACGTTGGATGGAGATCCATTCCTAGGACAG(SEQ ID NO：2)。

R:ACGTTGGATGTAGCCAGGGAACCAAATCAC(SEQ ID NO：3)。

E:GACAGGCTGACCCCA(SEQ ID NO：4)。

根据本发明的实施例，利用本发明的引物组能够有效地对待测个体的上述与噪声性听力损失疾病相关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对这种SNP标记的检测，确定待测个体该种SNP标记位点的基因型，进而能够有效预测待测个体是否易感噪声性听力损失疾病。具体地，该SNP位点的AA基因型个体中患噪声性听力损失疾病的比重显著高于CC、AC基因型个体中患噪声性听力损失疾病的比重。从而，例如所述SNP标记位点的基因型为AA时，则能够预测待测个体易感噪声性听力损失疾病。由此，用于检测前面所述的本发明的SNP标记的引物组，能够有效用于筛选噪声性听力损失疾病易感群体，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地确定噪声性听力损失疾病易感个体。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的SNP标记的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：前面所述的用于检测本发明的SNP标记的引物组。即本发明的试剂盒中包含具有SEQ ID NO：2-4所示的核苷酸序列的引物组。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物组，能够有效实现对待测个体的上述与噪声性听力损失疾病相关的SNP标记的多态性检测，确定待测个体该SNP标记位点的基因型，进而能够有效预测待测个体是否易感噪声性听力损失疾病。具体地，该SNP位点的AA基因型个体中患噪声性听力损失疾病的比重显著高于CC、AC基因型中患噪声性听力损失疾病的比重。从而，例如所述SNP标记位点的基因型为AA基因型时，则能够预测待测个体很大可能为易感噪声性听力损失疾病个体。由此，本发明的用于检测前面所述的本发明的SNP标记的试剂盒，能够有效用于筛选易感噪声性听力损失疾病群体，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地确定易感噪声性听力损失疾病个体。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的SNP标记、引物组或试剂盒，在确定噪声性听力损失疾病易感个体中的用途。如前所述，通过能够用于检测本发明的与噪声性听力损失疾病相关的SNP标记的试剂例如前述的引物组或包含该引物组的试剂盒等，能够有效地检测确定待测个体的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效预测待测个体是否易感噪声性听力损失疾。

进而，根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种确定噪声性听力损失疾病易感个体的方法。根据本发明的实施例，该方法通过对待测个体进行前面所述的SNP标记的检测，预测所述待测个体是否易感噪声性听力损失疾病。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与噪声性听力损失疾病相关的SNP标记的试剂例如前述的引物组或包含该引物组的试剂盒等，对待测个体进行PCR扩增、测序，以便检测确定待测个体的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效预测待测个体是否易感噪声性听力损失疾病。其中，如前所述，该SNP位点的AA基因型个体中患噪声性听力损失疾病的比重显著高于CC、AC基因型中患噪声性听力损失疾病的比重。从而，例如所述SNP标记位点的基因型为AA时，则能够预测待测个体极可能为易患噪声性听力损失疾病个体。由此，本发明的确定噪声性听力损失疾病易感个体的方法，能够快速、高效、准确地确定噪声性听力损失疾病易感个体。

另外，根据本发明上述实施例的确定噪声性听力损失疾病易感个体的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，对待测个体进行SNP标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP)及飞行时间质谱等技术均可以实现SNP的检测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通量大、检测周期短的检测技术。只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增400-700bp的产物，再通过测序即可直接检测SNP位点的基因型。因而，本发明采用测序的方法进行SNP标记检测。根据本发明的一些具体示例，通过对待测个体进行前面所述SNP标记的检测，预测所述待测个体是否易感噪声性听力损失疾病，进一步包括：提取待测个体的基因组DNA；利用前面所述的引物组，将所述待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测个体的所述SNP标记的基因型；以及基于所述待测个体的所述SNP标记的基因型，预测所述待测个体是否易感噪声性听力损失疾病。由此，能够有效提高确定噪声性听力损失疾病易感个体的效率。

根据本发明的实施例，提取待测个体的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用常规酚-氯仿方法抽提待测个体的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。

根据本发明的实施例，将所述待测个体的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，PCR扩增：5μl反应体系为：10ng/μl基因组DNA 1μl，20μM的上下游引物各0.25μl，10μM的探针各0.125μl，以及2.5μl 2×预混缓冲液(AppliedBiosystems Sequenom Genotyping Master Mix；包括dNTP及Taq DNA聚合酶)。PCR条件为：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；95℃ 15秒和60℃ 1分钟，共计40循环。由此，能够快速、高效、准确地扩增本发明的SNP标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。根据本发明的实施例，对所述PCR扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得PCR扩增产物即SNP标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示例，可以采用选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序方法的至少一种对所述PCR扩增产物进行测序。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。

根据本发明的实施例，基于测序结果，通过比对人类参考基因组序列，能够有效确定待测个体的SNP标记为AA、CC还是AC。

根据本发明的实施例，该SNP位点的AA基因型个体中患噪声性听力损失疾病的比重极显著高于CC、AC基因型的个体中患噪声性听力损失疾病的比重。由此，基于确定的待测个体的该SNP标记的基因型，能够准确有效地预测待测个体是否易感噪声性听力损失疾病。具体地，例如所述SNP标记位点的基因型为AA时，则能够预测待测个体很大可能为易感噪声性听力损失疾病个体。进而本发明的方法能够有效用于确定噪声性听力损失疾病易感个体。

需要说明的是，本发明的与噪声性听力损失疾病相关的SNP标记及其应用具有如下优点：

(1)本发明提供的SNP标记不受个体的年龄、性别等限制，可用于筛选噪声性听力损失疾病易感人群；

(2)检测本发明的个体SNP位点的方法，准确可靠，操作方便；

(3)本发明的个体SNP位点的检出，为筛选噪声性听力损失疾病易感人群提供了科学依据。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的研究工作流程概述；

其中，数字指的是病例和对照以及基因型或插补出来的SNP数量，利用1000人基因组计划的数据进行插补，并在发掘阶段生成3830431个SNPs的基因型，在发掘阶段，29个显著相关的SNP(P≤1.0×10^-4)在验证阶段被分型。在验证阶段我们验证了rs10081191。最后，结合两个阶段的研究结果对rs10081191进行meta分析；

图2显示了根据本发明实施例的主成分分析结果。(A-C)病例对照主成分图。圆圈实点：病例；三角实点：对照。(D)病例-对照和千人基因组计划基因型数据主成分图。圆圈：本研究中的病例和对照个体；倒三角：日本个体；正三角：中国北京个体；菱形：中国南方个体；

图3显示了根据本发明实施例的发掘阶段全基因组P值的曼哈顿图和分位数图；

(A)曼哈顿图显示利用logistic回归加性模型计算病例/对照人群在发现阶段通过基因分型和推算出来的SNP的全基因组P值。x轴代表基因组位置，y轴显示-log10(P)。红线表示P值为1.0×10^-4。选择P≤1.0×10^-4的SNPs进行验证；

(B)分位数图，红线表示没有真正关联的零假设，具有梯度λ(膨胀系数)的黑线拟合到观测试验统计分布的90％以下，该图是基于通过质量控制的SNPs，这些SNPs都是来源于基因分型和基因插补，膨胀系数的值是0.996；

图4显示了根据本发明实施例的rs10081191在发掘和验证阶段森林图；

图5显示了根据本发明实施例的发掘阶段rs10081191周围相关位置的区域图，其中，

基因组位置基于NCBI Build 37。在meta分析中，紫色菱形代表rs10081191的meta-P值，其在发掘阶段的初始P值用紫色圆点表示。其他SNP与rs10081191的连锁不平衡值用不同颜色表示。红色表示r²>0.8，橙色表示0.6<r²≤0.8，绿色表示0.4<r²≤0.6，浅蓝色表示0.2<r²≤0.4，蓝色表示r²≤0.2。估计的重组率，源自于2014年11月亚洲人口1000基因组计划的第一阶段(第3版)。图中注释了rs10081191上下游500kb范围内的基因，以及转录物的位置；

图6显示了根据本发明实施例的rs10081191调控PTPRN2表达水平的eQTL分析结果。(A-I)测定了不同基因型(AA、AC、CC)在大脑杏仁核(A)、前扣带回皮质(B)、尾状核(C)、小脑半球(D)、皮质(E)、额叶皮质(F)、下丘脑(G)、伏隔核(H)、壳核(I)中PTPRN2的表达水平。PTPRN2的mRNA表达水平通过修剪平均值的方法(trimmed mean of M-values，TMM)方法进行标准化处理，并进行log²转化。基因型下面的数字表示每个基因型的样本数。通过检验基因型与表达水平之间的线性回归模型斜率是否偏离0这一备择假设，为每个变异-基因对生成P值，并且在低于0.05时被认为是显著的。方框图中的白线(黑色)表示每个基因型表达的中值；

图7显示了根据本发明实施例的rs10081191调控WDR60表达水平的eQTL分析结果。测定了不同rs10081191基因型(AA、AC、CC)杏仁核(A)、尾状核(B)、下丘脑(C)中WDR60的表达水平。WDR60的mRNA表达水平通过TMM方法进行标准化处理，并进行log²转化。基因型下面的数字表示每个基因型的样本数。通过检验基因型与表达水平之间的线性回归模型斜率是否偏离0这一备择假设，为每个变异-基因对生成P值，并且在低于0.05时被认为是显著的。方框图中的白线(黑色)表示每个基因型表达的中值。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明公开了与噪声性听力下降(Noise induced hearing loss,NIHL)患病风险相关的易感基因区域7q36.3的位点rs10081191的检测方法、试剂盒及其应用。所述方法为Sequenom分型，本发明进一步涉及检测上述易感位点的试剂盒及其应用。另外，本发明将7q36.3区域的SNP位点rs10081191与NIHL的患病风险联系起来，公开了该SNP及其应用。其中，该SNP位于人类基因组区域7q36.3，并确定了7q36.3是NIHL的一个新的易感基因区域，能够有效用于筛选噪声性听力损失疾病易感群体和确定噪声性听力损失疾病易感个体。

实施例

1.材料与方法

1.1全基因组关联研究样本

在本项研究中，发明人在两个中国人群中开展了全基因组关联研究(Genome-wideassociation study,GWAS)，该项研究包含两个阶段，共有711例中国男性。具体来说，发掘阶段包含298例受试者，验证阶段包含413例受试者(参见表1)。对每个受试者进行纯音测听，分别在高频和语音频率下检测受试者耳朵听到的最小声音。根据世界卫生组织的分类，如果受试者两侧耳朵中任意一侧的最低听力阈值大于25分贝，则该受试者可视为噪声性听力损失病例。根据这一标准，发掘阶段包括了89例病例和209例对照。而验证阶段包含53例病例和360例对照(参见表1)。此外，发明人还收集了包括研究对象的年龄、性别、噪声暴露时间、噪声暴露强度和噪声暴露后双耳听力阈值等临床资料。病例-对照人群个体均不存在亲缘关系。所有患者均已签署知情同意书，且本项研究经北京放射与辐射医学研究所伦理委员会批准执行。

发掘阶段：该群体共有298例(89例病例和209例对照)。所有受试者均于2018年3月从中国安徽省职业性噪声暴露男性工人中招募。所有患者均使用Illumina InfiniumAsian Screening Array-24(v1.0)进行基因分型。病例和对照组的平均年龄(s.d.)分别为23.8和23.3(参见表1)。

验证阶段：该群体共有413人(53例病例和360例对照)。所有受试者同样是于2018年8月至2019年9月从中国安徽省职业性噪声暴露男性工人中招募所得。病例和对照组的平均年龄(s.d.)分别为26.5和24.5(参见表1)。

总的来说，在发掘阶段和验证阶段，病例的平均年龄均显著高于对照组。(P＝0.07，0.006；参见表1)。

表1本研究中研究对象的信息

1.2发掘阶段基因分型与质量控制

发明人对样本和SNPs进行了严格的质量控制，以确保随后关联分析的准确性。病例和对照组采用Infinium Illumina Asian Screening Array-24(v1.0)进行基因分型(总共包括659184个SNPs)。样本的质量控制的条件包括，(i)总体基因分型率<90％；(ii)显示性别差异；(iii)显示意外重复或亲属(PI_HAT>0.025)或(iv)被确定为异常值，若出现以上情况则将样本移除。使用全基因组复杂性状分析软件(Genome-wide Complex TraitAnalysis，GCTA)进行PCA分析，用于去除离群样本。SNPs质量控制的条件包括：(i)基因分型率<90％；(ii)次要等位基因频率(MAF)<0.05；(iii)未映射到常染色体，以及(iv)在发掘阶段群体的Hardy-Weinberg平衡试验中P<1.0×10^-4。质量控制后，共保留89例病例和209例对照；最终，发掘阶段得到的302253个SNPs用于后续分析。

1.3SNP推算

为了增加SNPs的覆盖度，发明人在发掘阶段进行了SNPs推算，发明人使用SHAPEIT软件和IMPUTE2软件对原始的GWAS基因型数据进行了插补，并以千人基因组计划中的数据(2012年3月第3版)作为参考数据集。推算完成后，为去除推算质量较差的SNP，我们仅保留info值大于0.6的SNP，然后发明人再次对推算出的SNPs进行质量控制。在Hardy-Weinberg平衡试验中，发明人去除了(i)分型率<90％；(ii)MAF<0.05；(iii)Hardy-Weinberg平衡试验中P<1.0×10^-4；以及(iv)多等位SNP。最后，发明人在89例病例和209例对照者的病例-对照样本人群中共获得了3,830,413个SNPs。

1.4全基因组关联分析

发明人使用PLINK软件在加性模型下使用了logistic回归分析，对每个SNP进行了关联分析，并对年龄和噪声暴露时间进行了调整。使用R软件生成曼哈顿图。并使用R软件计算绘制膨胀系数和分位数图，以评估全基因组关联的意义和种群分层的潜在影响，用以提示系统偏差是否存在。

1.5验证阶段基因分型和质量控制

首先，利用MassARRAY Assay Design 3.0软件(Sequenom)为29个SNPs设计了位点特异性聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)和检测引物。这些29个SNPs用于基因分型的引物和探针，见表5。在29个SNPs中，rs56328361未能被分型。在其他28个成功分型的SNPs中，这些SNPs的质谱图用MassARRAY TYPER软件(Sequenom)进行分析，并进行目视检查以确认其质量良好。在验证阶段中，5％的个体被随机选中进行重复基因分型，结果100％一致。验证阶段中的基因型数据进行了与发掘阶段相同的质量控制。发明人使用PLINK软件进行了关联分析，在年龄、噪声暴露时间调整的加性模型下使用了logistic回归分析。最终只有rs10081191在验证阶段显示出显著性(P<0.05，效应方向与发掘阶段一致)。

1.6表达数量性状基因座分析

表达数量性状基因座(expression quantitative trait loci，eQTL)分析能够有效发现易感SNP位点所定位的易感基因。我们使用了来自基因型组织表达数据库(Genotype-Tissue Expression portal，GTEx)中的基因表达数据，通过eQTL法来分析rs10081191在人类13种脑部组织中的表达情况。发明人只关注位于这个SNPs的上下游500kb范围内的蛋白质编码基因。构建基因型特异性表达的小提琴图，以可视化rs10081191(AA、AC和CC；A和C等位基因分别表示次要和主要等位基因类型)的基因型与基因的表达情况。基因的表达结果进行了标准化，且当P<0.05时被认为是显著的。

1.7功能注释位于7q36.3处的候选SNPs

使用多个工具，包括HaploReg在线软件工具和概率注释积分器(ProbabilisticAnnotation Integrator，PAINTOR)对14个SNPs(在7q36.3处由rs10081191标记)(连锁不平衡r²>0.4)进行功能注释。PAINTOR方法是一个概率框架，包含了多种类型的信息，包括来自GWAS统计数据的关联Z-score、成对相关系数的LD矩阵和功能注释信息。该方法将基因型与表型的关联强度与两个独立的信息源、LD结构和功能注释数据结合起来，计算出所有精细定位位点上每个SNP的后验概率。

在运行软件之前，发明人设置了以下参数：-enumerate 3可以选择运行所有考虑到的可能模型；-annotations Coding,Promoter,Enhancer,DHS指定功能注释文件中计算后验概率所涉及的基因元件。

1.8统计分析

利用Meta分析助手(Meta-analysis helper，METAL)软件对发掘和验证阶段的关联结果进行荟萃分析，以评估合并的遗传效应。计算Cochran的Q统计量来检验组间的异质性。利用Haploview软件(4.2版)推算了特定基因组区域的连锁不平衡结构。使用在线工具LocusZoom1.1生成区域图。

2.结果

2.1全基因组SNPs基因分型和质量控制结果

我们对病例-对照人群(包括89例病例和209例对照)进行了SNPs基因分型。同时，为了保证后续研究的准确性，我们进行了严格的质量控制，用以去除不符合质量控制要求的SNPs(质量控制条件详情见1.2发掘阶段基因分型与质量控制)，最终通过质量控制的SNPs数，如表2所示。

表2通过质量控制的SNPs汇总表

2.2SNP推算结果

为了增加SNPs的覆盖度我们使用千人基因组计划的中国人基因型数据作为参考集进行SNP推算，共获得81,677,399个SNPs。为了保证SNPs的质量和后续实验结果的准确性，我们进行了质量控制(质量控制详情见2.3SNP推算)，结果如表3所示。

表3基因插补和通过质量控制的SNPs汇总表

注：根据1000个基因组项目数据(版本3)，使用IMPUTE2软件对GWAS数据进行插补。

2.3主成分分析结果

我们使用推算出来的SNPs结果进行主成分分析。主成分分析的结果(图2A-C)显示，人群间不存在分层现象，也不存在离群值。此外，本研究使用千人基因组计划的数据作为参考集，主成分图中显示本研究样本中发觉人群与中国个体距离最近，表明发掘人群在生物学上均为中国个体(图2D)。

2.4关联分析结果

我们对推算得到的SNPs进行关联研究，并校正年龄和噪声暴露时间。基于千人基因组计划基因型数据推算得到的结果分位数图，见图3B。膨胀系数(genomic inflationfactor)为0.996，小于1.05，提示我们的研究并不存在人群分层等因素导致的系统性偏差。关联结果的曼哈顿图见图3A。

先前发表的候选基因关联研究和GWASs已经确定了多个与NIHL风险相关的SNPs。遗憾的是在本研究中，这些SNPs没有显示出显著的相关性(表4)。这样的结果不太可能是由于插补错误造成的，因为这些SNPs要么是直接基因分型的，要么是插补质量高的。这种不一致的关联可能是由于不同的种族或样本数量有限。

以往的研究表明，NIHL和其他类型的听力损失可能有共同的发生机制，因此，我们回顾了以往的其他类型听力损失的候选基因关联研究和GWASs。SCARNA16、IQGAP2、PTPRK、GLI3、ADARB2和NDUFV2中的SNPs得到了验证(所有P值均小于或等于0.05；表4)。以上结果显示，我们的研究重复出大量以往报道的与其他类型听力损失相关的SNPs，表明我们的研究结果是可信的。

表4已报道的听力损失关联研究热点

注：^a基因组位置基于NCBI第37版本；^b距离最近基因；^cP值为基于千人基因组推算后进行的关联结果。

2.5人群验证结果

为进一步验证发掘阶段所发现的新的显著关联信号，我们选择在发掘阶段显著关联的29个SNPs进入验证阶段(P≤1.0×10^-4)(参见表5)。在后续的验证阶段中我们采用与发发掘阶段相同的样本纳入和排除标准，最后总共筛选出53例病例和360例对照，且所有受试者均为中国男性(参见表1)。

在这29个被验证的SNPs中，我们成功分型了28个SNPs。在这些成功分型的SNPs中有1个SNP与发掘阶段观察到的方向相同(rs10081191)。然后我们整合该SNP在发掘阶段和验证阶段的结果，发现rs10081191表现出更显著的相关性(rs10081191，OR＝1.99，P＝2.1×10^-6；表6，图4)。在所有这些样本集中均未观察到rs10081191的异质性或值(P＝0.34,0.11；表6；图4)。

表5验证阶段SNPs基因分型的引物

表6病例-对照人群rs10081191的关联结果

注：^a病例对照人群中rs10081191的AA/AC/CC基因型计数。由于基因分型失败，基因分型样本的数量会有所不同。^b次要等位基因/主要等位基因。ORs和95％CIs的计算是基于逻辑回归加性模式，并且调整了年龄和噪声暴露时间。

2.6分层分析结果

采用年龄分层法进一步研究了rs10081191对NIHL的影响。在合并病例对照样本后，我们发现按年龄分层的亚组中，年龄对rs10081191影响并不显著(P_{heterogeneity}＝0.57)。没有评估rs10081191与噪声暴露时间之间的交互作用，是因为在验证人群中这些数据收集不全。因此，不能完全排除在7q36.3处检测到的相关信号能够反映噪声暴露时间与NIHL有关的可能性(参见表7)

表7 rs10081191与性别交互作用分析表

注：校正年龄的同时，在通过logistic回归加性模型下，计算ORs 95％的CIs。

2.7易感基因定位

rs10081191位于7q36.3上PTPRN2基因的第一内含子处。五个蛋白质编码基因(PTPRN2、NCAPG2、ESYT2、WDR60和VIPR2)位于rs10081191的上下游500kb范围内(图5)。我们进行了eQTL分析，以确定7q36.3处的潜在致病基因。eQTL分析表明rs10081191基因型与脑组织中PTPRN2和WDR60的表达水平有关(表8)。rs10081191的基因型与大脑中杏仁核、扣带回前皮质、大脑皮质、尾状核、小脑半球、下丘脑、伏隔核、壳核和额叶皮质处PTPRN2的表达显著相关(P均小于等于0.05；图6；表8)。PTPRN2编码蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族成员，这种蛋白被认为是胰岛素依赖型糖尿病的自身抗原。有趣的是，有研究发现PTPRN2基因突变可能导致听力损失，这表明PTPRN2可能在NIHL中起作用。rs10081191的基因型与大脑脑杏仁核、基底节、下丘脑中WDR60的表达也显著相关(P＝4.2×10^-4，P＝2.3×10^-2，P＝9.6×10^-3；图7和表9)。有研究发现WDR60基因在纤毛的形成中起重要作用，而纤毛功能障碍可导致包括听力损失在内的多种疾病，。综上所述，这些结果表明WDR60在NIHL中起着重要作用。

表8对来自GTEx的13个人脑组织中rs10081191的eQTL分析结果

注：通过检验基因型和表达之间线性回归模型的斜率偏离0的备择假设，为每个变异-基因对生成P值；13种脑组织的表达数据来自GTEx。

2.8功能注释7q36.3处的候选SNPs

使用多个软件工具，包括HaploReg和概率注释积分器(ProbabilisticAnnotationIntegrator，PAINTOR)对14个SNPs(在7q36.3处由rs10081191标记)(r²>0.4)进行功能注释。根据NIHL的原始汇总统计，14个SNPs均未达到全基因组显著性(P≤1.00×10-⁴，表9)。PAINTOR软件是一个概率框架，包含了多种类型的信息，包括来自摘要统计的关联Z-得分、成对相关系数的LD矩阵和功能注释。该方法将基因型与表型的关联强度与两个独立的信息源、LD结构和功能注释数据结合起来，计算出所有精细定位位点上每个SNP的后验概率。在运行软件之前，我们设置了以下参数：-enumerate 3运行考虑到的所有模型；-annotationsCoding，Promoter，Enhancer，DHS指定功能注释文件中计算后验概率所涉及的DNA元件。最后，在7q36.3这个位点上，我们得到了14个SNPs的后验概率。

在7q36.3处，rs4909237和rs10270958的后验概率高于0.90(表9)。来自人类组织的表观基因组数据显示，rs4909237是在多个脑组织中表现增强子信号的变异。此外，我们还发现rs4909237位于胎脑DNaseⅠ超敏位点(DNase I hypersensitive site，DHS)。综上所述，这些观察结果表明rs79299033和rs4909237是NIHL最有可能的因果变异。这些结果表明遗传因素参与了NIHL的发生过程。

表9本研究中rs10081191强连锁不平衡SNPs的功能注释

注：后验概率的计算是基于PAINTOR；根据千人基因组计划中亚洲人群的基因型数据，计算了SNPs与rs10081191之间的r²；只保留r²>0.4的SNPs；^a基因组位置基于NCBI第37版本。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军总医院第五医学中心

<120> SNP标记及其应用

<130> PIDC3200913A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SNP标记位于核酸的核苷酸序列

<400> 1

tgagatccat tcctaggaca ggctgacccc acaataagta gaattacgtc agatatttag 60

aa 62

<210> 2

<211> 0

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACGTTGGATGGAGATCCATTCCTAGGACAG

<400> 2

000

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物对序列

<400> 3

acgttggatg tagccaggga accaaatcac 30

Claims

1.一种噪声性听力损失疾病相关的SNP，其特征在于，

所述SNP为人类7号染色体158322806位置的碱基A或C。

2.根据权利要求1所述的SNP，其特征在于，该SNP位点的AA基因型个体相比CC、AC基因型个体更易感噪声性听力损失疾病。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP的引物组，其特征在于，所述引物组具有SEQID NO：2-4所示的核苷酸序列。

4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP的试剂盒，其特征在于，包含：

权利要求3所述的引物组。

5.权利要求3所述的引物组在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于筛选或确定噪声性听力损失疾病易感个体。

6.权利要求1或2所述的SNP标记、权利要求3所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒，在确定噪声性听力损失疾病易感个体中的用途。

7.一种确定噪声性听力损失疾病易感个体的方法，其特征在于，通过对待测个体进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，预测所述待测个体是否易感噪声性听力损失疾病。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过对待测个体进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，预测所述待测个体是否易感噪声性听力损失疾病，进一步包括：

提取待测个体的基因组DNA；

利用权利要求3所述的引物组，将所述待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

基于所述测序结果，确定所述待测个体的所述SNP标记的基因型；以及

基于所述待测个体的所述SNP标记的基因型，预测所述待测个体是否易感噪声性听力损失疾病。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，该SNP位点的AA基因型个体相比CC、AC基因型个体易感噪声性听力损失疾病。