CN111579778A - 支气管肺泡灌洗液中的IgE作为急性期腺病毒肺炎的病程诊断标记物的应用 - Google Patents

支气管肺泡灌洗液中的IgE作为急性期腺病毒肺炎的病程诊断标记物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学诊断学领域，具体而言，涉及支气管肺泡灌洗液中的IgE作为急性期腺病毒肺炎的病程诊断标记物的应用。在本发明中，发明人调查了HAdVs肺炎患儿血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)中IgE、双链DNA(dsDNA)和双链DNA特异性IgE(dsDNA‑IgE)的存在。本发明确定了支气管肺泡中IgE的水平与疾病的严重程度相关，从而能更好地用于急性期腺病毒肺炎的病程判断，方便治疗与预后评估。

Description

支气管肺泡灌洗液中的IgE作为急性期腺病毒肺炎的病程诊 断标记物的应用
技术领域
本发明涉及医学诊断学领域，具体而言，涉及支气管肺泡灌洗液中的IgE 作为急性期腺病毒肺炎的病程诊断标记物的应用。
背景技术
人类腺病毒(HAdVs)是儿童肺炎的重要病因之一[1]。HAdVs相关的呼吸道感染通常被认为是轻度和自我限制性的[2]。然而，HAdVs感染可导致严重肺炎，致死率超过50％，在某些情况下可导致永久性肺损伤[3-6]。尽管HAdVs肺炎的严重程度与病毒血清型有关，但对于重症HAdVs肺炎患儿，肺损伤的机制，尤其是免疫机制尚不清楚。
当免疫球蛋白E(IgE)与靶细胞结合并触发嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞等几种白细胞分泌组胺时，它通常会引起炎症反应。IgE产生的主要目的是增强宿主的抗病毒免疫[7,8]。然而，IgE介导的炎症在过敏症中被发现IgE 可以触发干扰素反应，从而加剧自我毁灭性自身免疫反应[9]。因此，严重的病毒感染可引起宿主免疫系统过度活化，并通过诱发自身反应性IgE的产生而引起靶器官的自身免疫损伤。
发明内容
本发明涉及支气管肺泡中IgE的定量检测剂在制备腺病毒肺炎患者病程的诊断剂中应用。
可选的，如上所述的应用，所述IgE为双链DNA特异性的IgE。
可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂用于执行如下方法：
放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、免疫印记法和酶联免疫吸附法。
可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂包含抗IgE的抗体。
可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂包含dsDNA抗原。
可选的，如上所述的应用，所述患者为儿童。
可选的，如上所述的应用，所述腺病毒肺炎患者为急性期腺病毒肺炎患者。
可选的，如上所述的应用，所述诊断剂用于将所述急性期腺病毒肺炎患者的病程分为重度患者与非重度患者。
可选的，如上所述的应用，所述定量检测剂检测的样本为支气管肺泡灌洗液。
可选的，如上所述的应用，所述诊断剂中还包含dsDNA的定量检测剂。
本发明的有益效果为：
目前现有技术中还没有直接显示高IgEs水平与HAdV感染相关的记载。虽然在HIV等病毒感染者的血清中检测到IgE，但没有直接的参考文献表明IgE 与HAdV感染的关系。在本发明中，发明人调查了HAdVs肺炎患儿血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)中IgE、双链DNA(dsDNA)和双链DNA特异性IgE (dsDNA-IgE)的存在。本发明确定了支气管肺泡中IgE的水平与疾病的严重程度相关，从而能更好地用于急性期腺病毒肺炎的病程判断，方便治疗与预后评估。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中非重症和重症HAdVs肺炎的影像学特点；(A-D) 入院当天胸部高分辨率CT扫描，显示非重症HAdVs肺炎患者右上叶弥漫性浸润和少量实变区；(E-H)入院当天胸部高分辨率CT扫描，显示左肺的空域实变区和胸腔积液重症HAdVs肺炎患者；
图2为本发明一个实施例中HAdVs肺炎急性期血浆及BALF中IgE、Th2 细胞因子水平的比较及疾病严重程度的IgE比较；
图3为本发明一个实施例中HAdVs肺炎急性期血浆和BALF中dsDNA水平的比较；
图4为本发明一个实施例中HAdVs肺炎急性期血浆和BALF中dsDNA-IgE 水平与病情严重程度的比较；
图5为本发明一个实施例中BALF中IgE识别非重症和重症HAdVs肺炎患者dsDNA的比较。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及支气管肺泡中IgE的定量检测剂在制备腺病毒肺炎患者病程的诊断剂中应用。
在一些实施方式中，所述IgE为双链DNA特异性的IgE。
在一些实施方式中，所述定量检测剂用于执行如下方法：
放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、免疫印记法和酶联免疫吸附法。
其中，放射免疫法可以为放射免疫吸附剂试验(radioimmunosorbenttest，IRST)或放射变应原吸附剂试验(radioallergosorbenttest，RAST)。IRST是将抗IgE吸附到固相载体上用以检测物IgE的方法，故又称固相放射免疫测定(SPRIA)；临床常用双抗体夹心法，多以滤纸为载体。将抗IgE抗体偶联到经例如溴化氟活化的滤纸上，使其与待检血清及IgE参考标准进行反应；洗涤后加入放射性标记例如125I标记的抗人IgE，再经洗涤后测定滤纸片的放射活性，其测定值与标本中的IgE含量呈正相关。RAST将纯化的变应原与固相载体结合，加入待检物及参考对照，再与同位素标记的抗IgE抗体反应，然后测定固相的放射活性，通过标准曲线求出待检物中特异性IgE的含量，或在标本放射活性高于正常人均数加3S时判为阳性。
酶联免疫测定法测定IgE时也常用双抗体夹心ELISA法，操作方便，敏感性也很高，在临床上经常应用。
间接血凝试验用抗IgE至敏红细胞，将标本血清做系列稀释后与致敏红细胞反应。此法更加简便易行，便于普及。
在一些实施方式中，所述定量检测剂包含抗IgE的抗体。
“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体。在一些优选的实施方式中，抗体的来源可以为大鼠、小鼠、狗、马、山羊、兔子等。
在一些实施方式中，所述定量检测剂包含dsDNA抗原。
在一些实施方式中，所述患者为儿童。
儿童是指18岁以下的任何人。
在一些实施方式中，所述腺病毒肺炎患者为急性期腺病毒肺炎患者。
在一些实施方式中，所述诊断剂用于将所述急性期腺病毒肺炎患者的病程分为重度患者与非重度患者。
在一些实施方式中，所述定量检测剂检测的样本为支气管肺泡灌洗液。
在一些实施方式中，所述诊断剂中还包含dsDNA的定量检测剂。
本发明还涉及dsDNA的定量检测剂在制备腺病毒肺炎患者病程的诊断剂中应用。检测对象可以为血浆、支气管肺泡灌洗液等。
本发明还涉及一种诊断腺病毒肺炎患者病程等方法，包括：
通过定量检测剂检测样本中IgE的含量，并根据所述含量是否发生显著性升高判断病程。
确定受试患者和对照组受试患者的健康状态(baseline)相比，是否具有显著性的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间可以为90％、95％、97.5％、98％、99％、 99.5％、99.9％或99.99％并且p值可以为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、 0.001或0.0001。
本发明涉及支气管肺泡中IgE的定量检测剂在制备腺病毒肺炎患者病程的诊断剂中应用。
在一些实施方式中，所述IgE为双链DNA特异性的IgE。
除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。
为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
一.实验对象和方法
(1)研究设计、参与者和样本
通过查阅广州市妇幼保健中心电子病历系统，对HAdVs肺炎患者与健康儿童血浆IgE水平进行回顾性研究。然后，在2017年7月至2019年7月期间，使用需要柔性支气管镜检查和治疗的HAdVs肺炎儿童血浆和BALF进行前瞻性研究。排除标准包括与其他微生物混合感染、采集样本前在疾病治疗过程中使用皮质类固醇、有记录的肺结核、过敏性疾病的病史和/或现有和/或实验室证据、寄生虫感染和免疫低下或自身免疫性疾病。HAdVs感染通过检测血清中的 HAdVs免疫球蛋白M(IgM)抗体和/或入院时咽拭子中的实时逆转录聚合酶链反应来确认。患者分为重度组和非重度组。根据美国胸科学会的社区获得性肺炎管理指南对肺炎严重程度进行分类。重症肺炎的标准如下：1)主要标准：有创机械通气；液体难治性休克；急性需要无创正压通气；低氧血症需要吸入氧 (FiO2)的分数大于一般护理区的吸入浓度或流量。2)次要标准：呼吸频率大于世卫组织年龄分类；呼吸暂停；呼吸功增加(如收缩、呼吸困难、鼻扩张和呼噜声)；PaO2/FiO2比值<250；多叶浸润；儿科早期预警评分>6；精神状态改变；低血压；有积液；共病情况(如血红蛋白SS疾病、免疫抑制和免疫缺陷；以及原因不明的代谢性酸中毒。本研究经广州市妇女儿童医疗中心医德委员会批准(编号2016111853)。所有参与者的监护人均书面同意。
(2)支气管镜检查
对符合以下一个或多个适应症的HAdVs肺炎患儿进行了柔性支气管镜检查： 1)胸片上存在病因不明的病变；2)需要评估复发性肺炎；3)高分辨率计算机断层扫描显示持续的肺浸润或肺实变。所有的孩子都满足这些要求。患者准备使用吸入利多卡因进行支气管镜检查以减少咳嗽反射，静脉注射咪唑安定进行适度镇静，阿托品用于减少气道分泌物。支气管肺泡灌洗是在放射和/或内镜下确定的最易受影响的区域进行的。将3-5ml/kg温无菌生理盐水分成3-5等份，在负压为6.65-13.3kpa(50-100mmhg)的情况下，吸入吸盘回收。BALF的回收量超过40％被认为是可以接受的。
(3)IgE抗体测定
采用人IgE酶联免疫吸附测定试剂盒(4A生物技术，北京，中国)按照制造商的方案测定血浆和BALF上清液中IgE抗体水平。血浆样本按1:5稀释， BALF样本未稀释。用MultiSkan-GO微型平板阅读器(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)在450nm处测量吸光度，以评估IgE水平。
(4)细胞因子测定
用Bio-Plex-Pro测定IL-4、IL-5和IL-13水平TM带Luminex(LX1000)系统的人类细胞因子标准27丛I组试剂盒(BioRad)。简单地说，血浆或BAL上清液用珠子孵育30分钟，然后30分钟检测抗体，然后用链霉亲和素PE孵育15 分钟。在用Bio-Plex 200系统分析之前，将微球重新悬浮在分析缓冲液中。
(5)dsDNA的检测
使用QubitTM dsDNA-HS检测试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA) 和Qubit3.0荧光计(Invitrogen)按照制造商的方案检测dsDNA。
(6)dsDNA-IgE检测
dsDNA IgE的测定是通过在4℃的96孔PVC板中以10μg/mL的磷酸盐缓冲液(PBS)将dsDNA抗原(Invitrogen)包被一夜。然后用含有10％胎牛血清的PBS(Hyclone，Logan，UT，USA)封闭包被的dsDNA。血清和BALF样本与dsDNA孵育2小时。以1μg/mL的速度将山羊抗人IgE二级抗体(Thermo Scientific)添加到培养孔中。通过用对硝基苯基磷酸盐(SigmaAldrich，St.Louis， MO，USA)孵育培养板形成颜色。用MultiSkan-GO微板阅读器在405nm处测量吸光度，以评估抗体水平。
(7)酶联免疫斑点检测(ELISPOT)
用96孔滤板包被dsDNA抗原进行ELISPOT检测。
二.实验结果
根据我们的回顾性研究，110例HAdVs肺炎患儿中53例(48.2％)血浆IgE 高于临界水平。相比之下，60名年龄和性别分布相同的健康儿童中只有7名 (11.7％)的血浆IgE水平升高。与HAdVs肺炎组比较，差异有显著性(P<0.01)。
在我们的前瞻性研究中，共有60名患者被诊断为HAdVs肺炎。非重度组 30例(男18例，女12例)，中位年龄31.5(15.8-67.0)个月；重度组30例(男 15例，女15例)，中位年龄22.0(9.75-61.5)个月。两组在性别和中位年龄上均无显著差异。
前瞻性患者的主要临床特征见表1。所有患者均出现发热，但中位发热时间重度组明显长于非重度组(P<0.01)。重度组明显高于非重度组(P<0.01)(图1)。重症HAdVs肺炎患儿血浆C反应蛋白和乳酸脱氢酶水平显著高于非重症HAdVs 肺炎患儿(P<0.01)。但两组外周血白细胞数量无显著差异。重症组患者中有83.3％接受了氧治疗，16.7％接受了重症监护。与非重度组比较，差异有显著性(P<0.01)。重度组的住院时间明显长于非重度组(P<0.01)。
表1：非重症和重症HAdVs肺炎患者的特点
Figure BDA0002479896040000081
数据以数字(百分比)、中位数(25-75％)或平均值±标准差(如适用)表示。
BALF中的IgE、dsDNA和dsDNA IgE水平明显高于急性期HAdVs肺炎患儿血浆中的水平(P均<0.05)(图2A、3A、4A)。重度患者与非重度患者血浆 IgE水平无显著性差异(图2B)，但重度患者BALF水平明显高于非重度患者 (P<0.05)(图2C)。此外，BALF患者血清中与Th2相关的细胞因子IL-4、IL-5、 IL-13均明显升高(P<0.05)(图2D-F)。重度患者BALF和血浆dsDNA水平明显高于非重度患者(P<0.05)(图3B、C)。重度和非重度患者血浆dsDNA-IgE 水平无显著性差异(图4B)，但重度患者BALF水平明显高于非重度患者(P<0.05) (图4C)。BALF中的IgE识别HAdVs肺炎患儿的dsDNA，特别是重症患儿重度患者的病灶数目明显多于非重度患者(P<0.05)(图5)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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Claims (10)

1.支气管肺泡中IgE的定量检测剂在制备腺病毒肺炎患者病程的诊断剂中应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述IgE为双链DNA特异性的IgE。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂用于执行如下方法：
放射免疫法、间接免疫荧光法、斑点免疫金渗滤法、免疫印记法和酶联免疫吸附法。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂包含抗IgE的抗体。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂包含dsDNA抗原。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述患者为儿童。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述腺病毒肺炎患者为急性期腺病毒肺炎患者。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述诊断剂用于将所述急性期腺病毒肺炎患者的病程分为重度患者与非重度患者。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂检测的样本为支气管肺泡灌洗液。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述诊断剂中还包含dsDNA的定量检测剂。
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