CN111568923A - 一种mTOR信号通路小分子抑制剂在制备肺癌化疗药物中的应用 - Google Patents

一种mTOR信号通路小分子抑制剂在制备肺癌化疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种mTOR信号通路小分子抑制剂在制备肺癌化疗药物中的应用，所述抑制剂由下列化学结构式表达：
Figure DDA0002543447400000011
本发明新开发的mTOR信号通路抑制剂可通过下调mTORC1上游RagD表达及受体酪氨酸激酶磷酸化来抑制mTOR通路的活性；并在与顺铂联合化疗时促进肺鳞癌细胞对化疗药的敏感性。从而有望将其开发为新的抗肿瘤药物，为改善肺癌患者对化疗药物的反应提供一个潜在靶点。

Description

一种mTOR信号通路小分子抑制剂在制备肺癌化疗药物中的 应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及mTOR信号通路抑制剂，具体涉及一种mTOR信号通路小分子抑制剂及其在制备肺癌化疗药物中的应用
背景技术
2018 GLOBOCAN及中国癌症中心的数据显示，肺癌的发病率和死亡率均居全球癌症之首。对于大部分晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者，顺铂(cisplatin)是有效并广泛应用的一线化疗药物。过去25年肺癌患者化疗后的5年生存率仍未见显著提高，仅为15％。长期化疗导致的耐药性，是影响肺癌患者整体治疗效果，导致化疗失败的主要原因之一。因此，深入地开展肺癌化疗耐药机制的研究及针对性地开发新的靶向药物是我们迫切需要解决的问题，对提高肺癌患者的治疗和生存率具有重要的临床现实意义。
Nrf2信号通路是引起肺癌细胞增殖和耐药的重要信号通路，可作为提高肺癌患者对化疗药物敏感性的潜在靶点。在最近的一项Anju Singh的研究中，作者通过利用NSCLC肺腺癌细胞系(A549)对MLSMR药物库中400000种临床化合物进行高通量筛选，发现ML385能通过与转录因子Nrf2的DNA结合域特异性结合，抑制其下游靶基因的转录与表达。
然而关于ML385抑制mTOR信号通路的作用，国内外均未见报道。mTOR信号通路是细胞增殖分化的重要调控因子，该通路失调在肺癌的肿瘤发生、细胞增殖，及化疗耐药中起到中枢调控作用。mTOR在细胞内至少有两种不同的复合物：mTORC1和 mTORC2，研究较为成熟的是mTORC1信号通路。mTORC1上游受到具酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinases,RTKs)活性的生长因子受体及Rag GTP酶(RagA/B；RagC/D) 调节。mTORC1下游的直接底物为S6K和4EBP1；前者被磷酸化激活后可通过磷酸化核糖体蛋白S6促进核糖体的发生及蛋白合成，后者磷酸化后可促进mRNA的翻译。随着对mTOR信号通路及其在肺癌中重要作用的研究逐渐深入，针对该信号通路开发新的通路抑制剂对肺癌的治疗具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供Nrf2通路小分子抑制剂ML385其抑制mTOR通路的新功能，并与顺铂联合化疗时促进肺鳞癌细胞对化疗药的敏感性。
本发明的技术方案为：一种mTOR信号通路小分子抑制剂，结构式为
Figure BDA0002543447380000021
在制备肺癌化疗药物中的应用。
一种mTOR信号通路小分子抑制剂与顺铂化疗药物的联合使用。
有益效果
本发明新开发的mTOR信号通路抑制剂可通过下调mTORC1上游RagD表达及受体酪氨酸激酶磷酸化来抑制mTOR通路的活性；并在与顺铂联合化疗时促进肺鳞癌细胞对化疗药的敏感性。从而有望将其开发为新的抗肿瘤药物，为改善肺癌患者对化疗药物的反应提供一个潜在靶点。
附图说明
图1：ML385刺激肺鳞癌细胞的时间梯度和浓度梯度。
图2：肺鳞癌细胞中ML385可抑制Nrf2及mTOR信号通路的活化。
图3：肺鳞癌细胞中ML385可下调mTOR通路上游RagD的表达。
图4：肺鳞癌细胞中ML385抑制mTOR通路上游RTKs的磷酸化。
图5：ML385促进肺鳞癌细胞对顺铂的药物敏感性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：
ML385，别名：N-[4-[2,3-二氢-1-(2-甲基苯甲酰基)-1H-吲哚-5-基]-5-甲基-2-噻唑基]-1,3-苯并二氧杂环戊-5-基-乙酰胺
Figure BDA0002543447380000031
上述化合物作为Nrf2信号通路小分子抑制剂应用。该化合物的商用名为ML385，可从美国Sigma-Aldrich生化试剂公司购买获得。
ML385对Nrf2及mTOR通路的抑制作用
为了确定ML385对肺鳞癌细胞作用的合适刺激时间和刺激浓度，首先我们以Western blot检测不同时间点及不同浓度下ML385刺激肺鳞癌细胞(MGH7及LK2)后， Nrf2及其下游靶基因NQO1蛋白水平，及mTOR信号通路重要组成成员S6的磷酸化水平变化趋势。
方法：
①将肺鳞癌细胞MGH7及LK2细胞在6孔板中体外培养，培养基为RPMI1640 (GIBCO)细胞培养基并添加10％的小牛血清，待细胞长至60％的细胞密度时，加入5 uM的ML385刺激并继续培养不同时间(0h，6h，24h，48h，54h，72h)，对照组细胞以DMSO做刺激。
②将肺鳞癌细胞MGH7细胞在6孔板中体外培养，培养基为RPMI1640(GIBCO) 细胞培养基并添加10％的小牛血清，待细胞长至60％的细胞密度时，加入不同浓度的 ML385刺激(0uM，15uM，10uM，20uM，25uM)48小时，对照组细胞以DMSO 刺激。
③到达刺激时间点后收集提取细胞蛋白。预先预冷PBS，轻柔洗涤细胞3次，并吸净；加入适量SDS细胞裂解液，充分刮下细胞，收集并置入EP管中；沸水煮15分钟，迅速置于冰水混合物中冷却；待细胞完全裂解后，4℃离心13000rpm/min，20分钟；使用紫外分光光度仪对蛋白进行定量、分装后置于冰箱保存备用。
④取30ug蛋白进行凝胶电泳，检测Nrf2及Nrf2靶基因NQO1的蛋白水平表达，检测mTOR通路下游蛋白S6、4EBP1的表达及其磷酸化水平，以GAPDH作为内参。
首先时间梯度实验结果显示，在ML385刺激细胞48小时后，Nrf2信号通路水平被抑制至最低点(图1A及1B)。进一步的浓度梯度实验显示，ML385刺激48小时后，5 uM浓度组Nrf2蛋白水平被抑制至最低点(图1C)。因此我们后续的实验选择5uM刺激48小时作为ML385刺激细胞的合适浓度和合适时间点。同时我们的实验也发现作为 mTOR信号通路的重要组成成分，S6的磷酸化水平也明显受到抑制(图1A，1B及1C)。
随后我们进一步验证ML385对肺鳞癌细胞中Nrf2及mTOR通路的抑制作用。选取两种不同的肺鳞癌细胞系LK2及MGH7(图2A、2B)为研究对象，以5uM的ML385 为实验组(M)或DMSO为对照组(C)刺激48小时，Western Blot检测ML385对Nrf2 通路中关键蛋白分子水平(Nrf2及靶蛋白NQO1)及mTOR通路中关键蛋白的磷酸化水平(S6，4EBP1)的影响。结果表明，在肺鳞癌细胞系中，Nrf2信号通路及mTOR 信号通路均受到ML385的明显抑制。
实施例2：ML385对mTOR通路上游RagD表达的抑制作用
mTORC1激活的一个必要调节因子为Rag GTP酶家族重要成员分子RagD，因此为了确定ML385对mTOR通路上游RagD表达的调控作用，将体外培养肺鳞癌细胞系(LK2 和MGH7细胞)用ML385刺激，WB比较刺激前后RagD表达水平的差异。
方法：
①将肺鳞癌细胞LK2及MGH7细胞在10cm培养皿中体外培养，培养基为 RPMI1640(GIBCO)细胞培养基并添加10％的小牛血清，待细胞长至60％的细胞密度时，加入5uM的ML385(M)刺激并继续培养48h，对照组细胞以DMSO(C)做刺激。
②到达刺激时间点后收集提取细胞蛋白。预先预冷PBS，轻柔洗涤细胞3次，并吸净；加入适量SDS细胞裂解液，充分刮下细胞，收集并置入EP管中；沸水煮15分钟，迅速置于冰水混合物中冷却；待细胞完全裂解后，4℃离心13000rpm/min，20分钟；使用紫外分光光度仪对蛋白进行定量、分装后置于冰箱保存备用。
③取30ug蛋白进行凝胶电泳，检测Nrf2及RagD的蛋白水平表达，以GAPDH 作为内参。
结果如图3显示ML385在下调Nrf2表达的同时，RagD的表达也明显受到抑制，提示ML385可能通过下调mTORC1激活的必要调节因子RagD而抑制mTOR通路的激活。
实施例3：ML385对mTOR通路上游RTKs磷酸化的抑制作用
mTORC1激活的另外一个重要的激酶就是Rheb GTP酶，它在具酪氨酸激酶(RTKs)活性的生长因子受体(胰岛素受体、表皮生长因子受体)活化后可激活mTORC1。因此课题组试图探讨ML385对mTOR通路上游Rheb GTP酶活化的影响。体外培养肺鳞癌细胞系(EBC1和MGH7细胞)用ML385刺激，对照组细胞用DMSO刺激培养。以 R&D蛋白芯片为研究工具，将ML385刺激前后的细胞裂解液加入人RTKs磷酸化抗体芯片试剂盒中，比较特定位点42种受体酪氨酸激酶的相对磷酸化水平，结果如图(图 4A、4B)。其中a膜是细胞用DMSO处理对照组，b膜是ML385刺激实验组，每个磷酸化位点在芯片上有2个重复孔。结果显示多种受体酪氨酸激酶的磷酸化水平受到抑制，包括非小细胞肺癌最重要的两个驱动基因，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和间变淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase,ALK)ALK(图4A、 4B)，其中磷酸化水平分别降为0.14倍和0.32倍。
另外一批细胞裂解液，使用通用型磷酸化抗体如4G10酪氨酸磷酸化抗体，Western检测细胞总的酪氨酸磷酸化水平的差异，结果如图(图4C、4D)，ML385可下调人肺鳞癌细胞总体RTKs磷酸化水平。四种鳞癌细胞(KYSE70,LK2,EBC1和MGH7)以 5uM的ML385或对照DMSO刺激48小时后，收取细胞裂解液。以通用型磷酸化抗体如4G10酪氨酸磷酸化抗体孵育，Western检测ML385刺激前后细胞酪氨酸激酶总体磷酸化水平的差异。与RTKs磷酸化抗体芯片研究结果一致的是，ML385确实对酪氨酸激酶的总体磷酸化水平有抑制作用。并与磷酸化抗体芯片研究一致的是，WB结果显示 EGFR及ALK(蛋白分子均大于170KD)蛋白所在位置磷酸化水平也明显受到抑制(图4C)。
实施例4：ML385促进肺鳞癌细胞对顺铂的药物敏感性
将体外培养的肺鳞癌细胞消化为单细胞后直接接种至96孔板中。单独给予不同浓度梯度的顺铂刺激，或与5uM的ML385协同刺激培养72小时，CellTiter细胞增殖实验分析比较两组之间细胞活力的差异。首先为了明确ML385促顺铂敏感性作用不是由于其自身药物毒性所致，我们以DMSO或不同浓度(0-20uM)的ML385刺激细胞72 小时后，比较细胞活力(图5A)，结果显示，在ML385浓度10uM以下时，其对细胞活力的影响与对照组DMSO无统计差异。随后以5uM ML385联合不同浓度梯度顺铂(0.01 uM-10uM)共刺激细胞72小时，结果显示，与单独顺铂刺激相比，联合5uM ML385 共刺激后使细胞对顺铂敏感性提高。其中在肺鳞癌细胞MGH7中顺铂IC50从15.68uM 降至5.651uM(图5B)。明视野显微镜下可见肺鳞癌细胞单独顺铂刺激组在顺铂浓度达到 15uM时才可见明显的细胞坏死，而顺铂联合ML385组在顺铂浓度达到5uM时即可见明显的细胞坏死(图5C)。

Claims (2)

1.一种mTOR信号通路小分子抑制剂，结构式为
Figure FDA0002543447370000011
在制备肺癌化疗药物中的应用。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，与顺铂化疗药物联合使用。
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