CN111511917A - 肽结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够跨哺乳动物细胞的细胞质膜移位并抑制Notch信号通路的肽结合物。本发明的肽结合物、组合物和方法可用于靶向化疗抗性癌症干细胞。

Description

肽结合物
技术领域
本发明涉及能够跨哺乳动物细胞的细胞质膜移位并抑制Notch信号通路的肽结合物。特别地，本发明涉及肽结合物，其包含衍生自触角足(Antennapedia,ANTP)同源结构域的第一区域和衍生自Mastermind样(Mastermind样,MAML)蛋白的第二区域。本发明还涉及这种肽结合物在治疗癌症中的应用。特别地，本发明涉及肽结合物在靶向化疗抗性癌细胞和癌症干细胞(cancer stem cell,CSC)中的应用。
背景技术
肿瘤细胞群体的表型和基因型特性表现出变异性。例如，许多肿瘤细胞是免疫细胞(例如巨噬细胞)、内皮细胞或其他终末分化的细胞类型。只有一小部分肿瘤细胞能够引发肿瘤发生。在许多不同类型的恶性肿瘤中，这些“肿瘤引发”细胞已显示出成体干细胞的干细胞样特性，包括与正常干细胞相似的对抗有害刺激(例如化疗)进行自我更新、分化和具有相对抗性的能力。肿瘤引发细胞，也统称为癌症干细胞(CSC)，被认为可以驱动肿瘤生长、疾病发展和转移。尽管CSC最初是在白血病中发现的，但现在有大量证据表明CSC也存在于大多数实体瘤中，包括乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、结肠肿瘤、胃肿瘤和脑肿瘤。
当前模型表明，CSC被组织为树状层次结构。层次结构的顶部是“顶点”CSC。这些细胞可以进入高度增殖状态，从而导致产生低效祖CSC。然后，祖CSC经历大量的不对称细胞分裂，以生成成熟的、分化的细胞类型，从而形成了大部分肿瘤。顶点CSC同时进入静止状态。
当前的放射疗法、化学疗法、激素疗法和免疫疗法可以消除大部分癌细胞，但往往无法消除包括关键CSC在内的所有癌细胞(图1)，这些细胞受到与干细胞特性机制相关的内源性和特异性耐药机制的保护，例如Notch信号通路。存活的CSC引起新的和更具侵袭性的肿瘤和转移，导致疾病复发和患者死亡。复发的肿瘤倾向于更像“干细胞样”、侵袭性、转移性和对常规疗法的抗性。这些特征导致患者的预后和前景恶化。因此，CSC的存活和出现可以解释当前癌症疗法的失败。这可能会突出针对癌细胞和CSC的新型和改良癌症治疗的新方向。
Notch信号通路主要被认为在胚胎发育过程中调节干细胞的自我更新和分化。但是，现在有大量证据表明，Notch信号在癌变和肿瘤进展中也起作用。例如，据报道，在60％的T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic亮氨酸kemia,T-ALL)中存在Notch信号通路的组成性激活。Notch信号传导的增加在乳腺癌的病因中也起着重要的作用，Notch信号传导的抑制可逆转乳腺癌细胞系的转化表型并阻止原发性肿瘤细胞的生长。因此，Notch信号传导的操纵被认为是到靶向CSC和抑制Notch突变肿瘤中肿瘤进展的可行方法(图2)。
正常的Notch信号传导是通过膜结合的配体与嵌入相邻细胞膜中的Notch受体的结合而开始的。已知的哺乳动物Notch配体包括Jagged1、Jagged2、δ样1、δ样3和δ样4。哺乳动物Notch家族的受体同时包含四个成员(Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)。Notch配体和受体是高度保守的。Notch1、Notch2、Notch3和Notch4彼此之间及其果蝇直系同源物(图2)共享大约60％的序列同一性。
Notch受体是单程跨膜蛋白。因此，它们包含细胞外结构域(NECD)、跨膜结构域(NTMD)和细胞内结构域(NICD)。在配体呈递之前，Notch受体会保持自身抑制状态，并标记为泛素介导的降解。在相邻细胞上同源受体之间相互作用后，Notch受体会经历两次连续的蛋白水解裂解。由ADAM(解整合素和金属蛋白酶)家族的金属蛋白酶催化的首次水解裂解，释放出Notch胞外域。所得的膜连接中间体为γ-分泌酶多蛋白酶复合物的底物。随后的蛋白水解作用将NICD从质膜的细胞质一侧释放出来。释放的NICD然后能够移位到细胞核。
NICD无法结合DNA并单独激活Notch靶基因的转录。相反，NICD与称为核心结合因子1(Core Binding Factor 1,CBF-1)的转录因子复合。NICD-CBF-1复合物的形成取代了许多CBF-1的共阻遏物，因此起着转录开关的作用。Notch转录复合物的协同组装还依赖于共激活因子(coactivator)的募集；mastermind样(Mastermind样,MAML)蛋白。MAML结合在NICD-CBF-1复合物的界面上形成的凹槽，并借助低复杂度的C-末端结构域募集其他共激活剂蛋白，包括p300和介体复合物的成分。
仅由N末端NICD-CBF-1结合结构域组成的截断MAML突变体是Notch信号传导的有效抑制剂。例如，dnMAML(13至74)足以形成稳定的、转录惰性的NICD/CBF-1/MAML1三元复合物，从而抑制所有四个哺乳动物Notch受体对Notch信号传导的激活。因此，主要的阴性MAML(Dominant negative MAML,dnMAML)及其变体可用于靶向Notch信号途径来治疗癌症。
靶向细胞内蛋白的治疗性肽必须首先穿过生物膜。因此，能够进入细胞内靶标的工程肽具有挑战性。制备可穿透细胞的治疗性肽的潜在有前途的策略涉及将治疗性部分融合到能够穿越细胞膜的肽上。许多天然存在的细胞穿透肽(cell penetrating peptide,CPP)是已知的。例如，ANTP同源结构域已用于内化许多功能性和调节性蛋白。由于ANTP同源结构域较大(有60个氨基酸残基)，因此ANTP同源域可能能够比其他CPP内化更大的货物或治疗部分，并且比单独的穿透肽(penetratin)更有效(Wu A and Gerhing W(2014)BiochemBiophys Res Commun 443,1136-1149)。因此，治疗性ANTP-结合物可用于医学应用。然而，此类结合物将需要保留CPP部分的细胞穿透能力并保留治疗部分的治疗作用。
在实践中，已经发现重组制备ANTP融合蛋白在技术上具有挑战性。已知重组技术的成功受到宿主生长不良、包涵体(inclusion body,IB)形成、蛋白质失活和产量低的限制。特别地，本文所述的重组ANTP融合蛋白形成聚集体。尽管使用了多种变性折叠策略，但部分ANTP融合蛋白仍然错折叠，并且在与细胞接触时具有毒性。此外，以可扩展的产量重组制备可以在临床上或商业上应用的功能性融合蛋白可能是非常困难的。
本发明涉及CPP和Notch信号抑制剂的肽结合物，该结合物出人意料地保留了CPP的功能和稳定性以及Notch抑制功能。可以使用例如固相肽合成法在体外合成该肽。
发明内容
本申请涉及一种新型治疗性肽结合物，其包含触角足(Antennapedia,ANTP)同源结构域或其变体和显性负效Mastermind样(MAML)肽。可以使用固相肽合成和不涉及重折叠缓冲液或复杂程序的简单重构方法合成此类肽。肽的产率高(即大于90％)，这表明所述结合物可以足以具有治疗效果的量生产。此外，与包含dnMAML的替代性治疗结合物相比，本发明的肽结合物，例如Syntana-4，可以具有改善的溶解度和/或体内效力。
因此，本发明提供了一种肽结合物，其包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:4的细胞穿透肽或与其具有至少80％序列同一性的同源物；结合到(b)第二区域，所述第二区域包含肽，所述肽为Notch信号通路的抑制剂并且具有SEQ ID NO:9序列，或包括与SEQ IDNO:9具有至少80％序列同一性的同源物；和(c)在所述第一和所述第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
在一些实施方式中，所述肽结合物能够跨哺乳动物细胞的细胞质膜移位并抑制Notch信号通路。
在一些实施方式中，所述第一区域包含SEQ ID NO:2的细胞穿透肽，或包括与SEQID NO:2具有至少80％序列同一性的同源物。
在一些实施方式中，本发明的结合物包含第一区域，所述第一区域包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的细胞穿透肽。在一些实施方式中，本发明的结合物包含SEQ ID NO:2的细胞穿透肽。
在一些实施方式中，本发明的结合物包含由SEQ ID NO:9定义的Notch信号通路的抑制剂或根据以下序列的变体：
LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKR AGKH
且其中带下划线的残基是保守的，并且零个、一个、两个、三个、四个、五个或至多15个其他残基被保守取代替换。
在一些实施方式中，本发明的结合物包含由SEQ ID NO:9定义的Notch信号通路的抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述连接肽为2至7个氨基酸长度。在一些实施方式中，所述连接肽包含选自G、E、F、M或A的氨基酸。在一些实施方式中，所述连接肽是氨基酸序列GEFMA。
在另一个实施方式中，所述结合物包含或为SEQ ID NO:12(Syntana-4)。在另一个实施方式中，所述结合物包含或为SEQ ID NO:10。
本发明还提供了一种包含本发明的结合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还提供本发明的结合物，在通过疗法治疗人或动物体的方法中的应用。在一些实施方式中，本发明的结合物或药物组合物在治疗癌症或在癌症干细胞或祖细胞中抑制Notch信号传导的方法中的应用。在一些实施方式中，本发明的结合物或药物组合物在包括将所述结合物或组合物与化疗药物共同给药或相继给药的方法中的应用。在一些实施方式中，本发明的结合物或药物组合物在制造治疗癌症或抑制癌症干细胞或祖细胞中的Notch信号传导的药物中的应用。还提供了治疗癌症或在癌症干细胞或祖细胞中抑制Notch信号传导的方法，其包括施用本发明的结合物或药物组合物。
还提供了试剂盒，其包含本发明的结合物或药物组合物，以及一种或多种适合于同时给药、相继给药或单独给药的其他治疗剂。
还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于进行限制。本发明的范围将仅由所附权利要求来限制。
附图说明
图1通过根除癌症干细胞的治疗癌症的概况
图2典型的Notch信号通路和正在开发的各种实验性药理抑制剂的概况
图3 ANTP的表达和纯化
图4显示表达为折叠的富含螺旋的蛋白质的纯化的ANTP的CD光谱。
图5低产量的重组ANTP-dnMAML的制备：
a.使用基于T7的表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的重组ANTP-dnMAML的可溶性(S)和不溶性(I)部分。
b.抗组氨酸印迹以确认TR4同一性
c.通过逐步透析重折叠，其中S是起始样品，l1(Lane-1)是6M尿素透析，l2是4M尿素透析，l3是2M尿素透析，l4是剩余的可溶性折叠TR4。
图6重组ANTP-dnMAML结合物的哺乳动物表达是不可行的：
CHO转染哺乳动物细胞培养基后，大肠杆菌重组ANTP-dnMAML(根据实施例1制备)和(活)细胞提取物(不存在TR4)和(碎片)少量重组ANTP-dnMAML存在的抗-组氨酸Western印迹。
图7体内功效研究表明，在裸鼠异种移植模型中，重组ANTP/DN-MAML的效力不如Syntana-4
图8 Syntana-4“预折叠”肽的合成和表征
图9 Syntana-4的CD分析
图10 Syntana-4浓度
图11 ANTP的3D结构。半胱氨酸残基用虚线箭头标记，赖氨酸用粗体箭头标记，精氨酸残基用箭头标记。
该结构是使用Qian等人的数据生成的。Proc Natl Acad Sci U.A.1994Apr26；91(9)：4091-5和Swiss PDB Viewer。
图12用于缀合到Syntana-4上的市售染料
图13缀合的Syntana-4荧光光谱
(A)Syntana-4-IR染料光谱
(B)Syntana-4-Cy5染料光谱
(C)Syntana-4-Cy5.5染料光谱。
(D)SDS PAGE凝胶
图14体内功效研究的两个实施例，显示Syntana-4在MDA-MB-231肿瘤的裸鼠异种移植模型中引起明显的肿瘤生长延迟
图15 RT-定量PCR
上图显示了各种Notch相关基因的mRNA相对表达，下图为图形表示。
图16 Syntana-4处理的肿瘤的免疫组织化学图像，Ki67增殖标记物染色
图17用Syntana-4处理的MDA-MB-231细胞的流式细胞仪
通过膜联蛋白V-DAPI染色鉴定和定量凋亡细胞。将细胞以15,000个细胞/孔接种，并在48小时后用Syntana-4、ANTP或阿霉素一式三份处理。72小时后，通过流式细胞仪分析细胞。左下象限表示活细胞，右下象限表示早期凋亡，右上象限表示晚期凋亡，左上象限表示死细胞。使用直方图计算凋亡细胞的比例。
图18用Syntana-4处理的MDA-MB-231细胞的细胞增殖抑制*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
序列表摘要
SEQ ID NO:1同源结构域共有序列
SEQ ID NO:2触角足同源结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO:3具有保守取代的触角足同源结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO:4穿透肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:5具有保守取代的穿透肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:6人Mastermind样1的氨基酸序列
SEQ ID NO:7人Mastermind样2的氨基酸序列
SEQ ID NO:8人Mastermind样3的氨基酸序列
SEQ ID NO:9dnMAML(13-74)的氨基酸序列
SEQ ID NO:10全长结合物(ANTP-dnMAML)的氨基酸序列
SEQ ID NO:11全长结合物(穿透肽-dnMAML)的氨基酸序列
SEQ ID NO:12全长结合物加上组氨酸标签(Syntana-4)的氨基酸序列
SEQ ID NO:13HIV-TAT的氨基酸序列
SEQ ID NO:14MPG的氨基酸序列
SEQ ID NO:15PEP-1的氨基酸序列
SEQ ID NO:16EB1的氨基酸序列
SEQ ID NO:17转运蛋白(Transportan)的氨基酸序列
SEQ ID NO:18hCT(18-32)的氨基酸序列
SEQ ID NO:19KLA seq的氨基酸序列
SEQ ID NO:20AGR的氨基酸序列
SEQ ID NO:21LyP-2的氨基酸序列
SEQ ID NO:22REA的氨基酸序列
SEQ ID NO:23LSD的氨基酸序列
SEQ ID NO:24HN-1的氨基酸序列
SEQ ID NO:25CTP的氨基酸序列
SEQ ID NO:26HAP-1的氨基酸序列
SEQ ID NO:27 239P-1的氨基酸序列
SEQ ID NO:28示例性连接肽的氨基酸序列
具体实施方式
术语“Notch抑制剂”旨在包括能够减少Notch信号传导的任何分子。Notch抑制剂可以靶向Notch信号传导中的任何步骤；包括配体-受体结合、ADAM介导的裂解、γ分泌酶介导的裂解、Notch转录复合物组装或公认的(putative)Notch靶基因和蛋白质的表达。可以使用标准分子生物学技术确定分子是否充当Notch抑制剂。例如，可以通过实时定量PCR(RT-qPCR)定量在处理细胞和对照细胞中公认的Notch靶基因(包括Hes和Hey)的表达，可以使用Microarray同时定量大量Notch响应基因的表达，可使用标记的抗体或原位杂交来可视化裂解的NICD，或者利用Notch响应启动子(基于内源性靶标或基于多聚(multimerised)CSL结合位点)的转录报告子检测法(transcriptional reporter assay)可以用来控制荧光蛋白、生物发光蛋白或其他报告蛋白的表达。功能细胞的NICD或NΔECD增益具有组成性高的NOTCH活性，因此在这些研究中有用。
“细胞穿透肽”(Cell penetrating peptide,CPP)的长度通常为5至60个氨基酸残基，有助于细胞摄取分子货物(molecular cargo)。CPP可能是天然存在的肽、融合蛋白或完全合成的肽(如Guidotti G,Brambilla L,Rossi D.Cell-Penetrating Peptides:FromBasic Research to Clinics.Trends Pharmacol Sci.2017Apr；38(4):406-424中所分类的)。常规实验方法，包括将候选CPP与荧光团共价偶联并定量细胞摄取的速率和/或程度，可用于确定肽是否应被分类为CPP。
术语“保守氨基酸取代”是指在不损害蛋白质功能的情况下可以耐受的取代。可以基于取代矩阵(例如PAM或BLOSUM)来选择保守取代，该取代矩阵表示一种氨基酸可以突变为另一种氨基酸或替代另一种氨基酸的相对容易性。保守取代通常涉及用尺寸和化学性质相似的另一个氨基酸替换一个氨基酸。例如，以下几组氨基酸之间的取代不太可能破坏蛋白质功能：具有脂肪族侧链的氨基酸(即丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸)、两亲性氨基酸(即精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺)、具有非常疏水的芳香族侧链的氨基酸(即苯丙氨酸和色氨酸)、具有轻度疏水性的芳香族侧链的氨基酸(即酪氨酸和组氨酸)、疏水性芳香族氨基酸有时可以取代尺寸相似的脂肪族残基(即苯丙氨酸到亮氨酸，而不是色氨酸到缬氨酸)、带负电荷的极性氨基酸(即天冬氨酸和谷氨酸)、带正电荷的极性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)、中性极性氨基酸(即组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(即丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。
术语“癌症干细胞”是指具有自我更新、克隆性肿瘤启动能力和克隆性长期再增殖潜力的主要特性的肿瘤细胞。细胞表面蛋白CD133、CD24和CD44是某些癌症中癌症干细胞(CSC)群的公认标记物，与侵袭性癌症类型和不良预后相关。这些标记物还能够从大块肿瘤中分离出CSC，用于下游分析。
如本文所用，术语“治疗”是指由于所执行的动作而减轻了与癌症有关的临床体征和/或症状。待监测的体征或症状是特定癌症的特征，并且对于熟练的临床医生是众所周知的，监测体征和状况的方法也将是众所周知的。例如，熟练的临床医生将知道，可以使用通常用于特定肿瘤的诊断成像方法来监测肿瘤的尺寸或生长速率(例如，使用超声或磁共振图像(magnetic resonance image,MRI)来监测肿瘤)。
短语“药学上可接受的”用于指在合理的医学判断范围内与合理的获益/风险比相称，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物或剂型。
术语“治疗有效量”是指仅本发明的肽结合物单独有效地充当Notch信号传导的抑制剂的量，或有效地治疗或预防诸如癌症的增殖性疾病的量。术语“治疗有效量”还指本发明的肽结合物与其他活性成分组合以有效地充当Notch信号传导的抑制剂的量或有效地治疗或预防诸如癌症的增殖性疾病的量。
术语“递送”或“给药”被定义为包括向需要治疗的受试者提供本发明的肽结合物或药物组合物的行为。该术语包括肠胃外和局部给药。例如，可以通过静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下腔、脊柱内和胸骨内注射和输注来给药所述肽结合物和组合物。
肽结合物
本发明的肽结合物包含第一区域，其包含细胞穿透肽(CPP)部分或由细胞穿透肽(CPP)部分组成；第二区域，其包含治疗性货物(cargo)部分或由治疗性货物(cargo)部分组成；以及第一和第二区域之间的连接肽。
历史上低的膜渗透性一直是多肽向细胞内递送的障碍，并且被认为限制了许多抗癌药的疗效。本发明涉及治疗性肽结合物，包含在其第一区域中的细胞穿透肽(CPP)部分。CPP部分促进第二治疗部分的内化。
本文描述了利用果蝇同源异型转录因子触角足(ANTP)或其变体的细胞穿透能力的肽、组合物和方法。具体地，本发明的肽、组合物和方法通常利用在ANTP(SEQ ID NO:2)中发现的60个氨基酸的同源结构域的细胞穿透能力。通常，同源结构域折叠成特征性的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋(helix-loop-helix-turn-helix)基序。但是，在ANTP中，“第三”螺旋通常被认为是两个螺旋。
许多穿透细胞的ANTP变体是已知的，并且包括在本发明的范围内。可通过从SEQID NO:2的N和/或C末端去除一个或多个氨基酸来产生用于本发明的结合物、组合物或方法的变体CPP。截短也可能由一个或多个内部删除生成。截短的衍生物可以包含一个或多个α螺旋(α1、α2或α3)或基本上由一个或多个α螺旋(α1、α2或α3)组成。在一种实施方式中，CPP部分是被称为穿透肽(SEQ ID NO:4)的ANTP的16个氨基酸截短物。这些残基对应于ANTP的残基43至58(即，螺旋-环-螺旋-转角-螺旋基序的α3螺旋)。因此，在一些实施方式中，本发明的肽、组合物和方法的CPP部分包含穿透肽或其合适的变体，或基本由穿透肽或其合适的变体组成。
60-氨基酸的同源结构域是高度保守的(SEQ ID NO:1)。在动物中，同源框基因有16个主要类别；ANTP、PRD、PRD-LIKE、POU、HNF、CUT(具有四个子类：ONECUT、CUX、SATB和CMP)、LIM、ZF、CERS、PROS、SIX/SO，以及具有IRO、MKX、TGIF、PBC和MEIS类的TALE超类。在植物中，同源框基因有11个主要类别；HD-ZIP(具有四个子类：I至IV)、WOX、NDX、PHD、PLINC、LD、DDT、SAWADEE、PINTOX以及两个TALE类：KNOX和BEL。另外，同源结构域与在噬菌体，特别是噬菌体λ中表达的阻遏蛋白具有显著的结构相似性。
与ANTP同源框结构域共享氨基酸序列相似性的结构基序也有望用作CPP。在某些情况下，本发明的结合物、组合物或方法可以使用衍生自替代的真核同源结构域蛋白的CPP。在其他情况下，本发明的结合物、组合物或方法可以使用衍生自噬菌体阻遏蛋白的CPP。
在优选的实施方式中，结合物包含与SEQ ID NO:2具有序列相似性的CPP部分。例如，合适的变体CPP可具有与60个氨基酸的ANTP CPP(SEQ ID NO:2)具有至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列。或者，本发明的结合物可包含与穿透肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)具有序列相似性的CPP部分。例如，合适的变体CPP可以具有与16氨基酸穿透肽CPP具有至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％或至少90％的序列同一性的氨基酸序列。
用于本发明的结合物的合适的CPP变体衍生自ANTP(SEQ ID NO:2)。这些变体可包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段(即，穿透肽(SEQ ID NO:4))的一个或多个氨基酸取代或内部缺失。
在一些情况下，CPP部分与SEQ ID NO:2具有至少80％的序列同一性。在其他情况下，CPP部分与SEQ ID NO:2具有至少85％的序列同一性。在其他情况下，CPP部分与SEQ IDNO:2具有至少90％的序列同一性。在一些情况下，CPP部分与SEQ ID NO:4共享至少80％的序列同一性。在其他情况下，CPP部分与SEQ ID NO:4具有至少85％的序列同一性。在其他情况下，CPP部分与SEQ ID NO:4具有至少90％的序列同一性。
序列同一性可以使用许多在线程序之一来确定。包括但不限于ToPLign(BioSolveIT GmbH，德国)、BLAST2(NCBI)、SUPERMATCHER(L'Institut Pasteur，法国)、MATCHER(EMBOSS)或ClustalW(Thompson et al.,1994,supra)。例如，可以使用ClustalW和以下参数评估序列同一性：
配对比对参数(Pairwise alignment parameters)
方法：准确，矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，缺口延伸罚分：0.10；
多个对齐参数
矩阵：PAM，缺口开放罚分：10.00，延迟的同一性％：30，末端缺口罚分：开启，缺口间隔距离：0，负矩阵：否，缺口延伸罚分：0.20，残基特异性缺口罚分：开启，亲水缺口罚分：开启，亲水性残基：GPSNDQEKR。在特定残基处的序列同一性旨在包括简单地衍生化的相同残基。
用于本发明的结合物、组合物或方法中的变体CPP可包含来自全长果蝇ANTP(SEQID NO:2)中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多达20个氨基酸取代或缺失。或者，用于本发明的结合物、组合物或方法中的变体CPP可包含穿透肽(SEQ ID NO:4)的1、2、3或4个氨基酸取代或缺失。优选地，氨基酸取代本质上是保守的。例如，氨基酸可以被具有相似特性的替代氨基酸取代(即，另一个碱性氨基酸，另一个酸性氨基酸，另一个中性氨基酸，另一个带电荷氨基酸，另一个亲水氨基酸，另一个疏水氨基酸，另一极性氨基酸，另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸)。下面总结了20种天然氨基酸的特性。该表可以被技术人员用来确定哪些氨基酸被取代。例如，赖氨酸(K)残基是极性的，亲水的并且带正电荷的，因此可以被精氨酸(R)残基取代。
表1：示例性保守替代
Figure BDA0002465788690000091
技术人员将理解，可以在本发明中使用替代的CPP。下表列出了细胞穿透肽的实例：
表2：示例性的细胞穿透肽(CPP)
CPP 氨基酸序列
HIV-TAT GRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO:13)
MPG Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya(SEQ ID NO:14)
PEP-1 Ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKC-cya(SEQ ID NO:15)
EB1 LIKLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK(SEQ ID NO:16)
转运蛋白 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:17)
hCT(18-32) KFHTFPQTAIGVGAP-NH2(SEQ ID NO:18)
KLA序列 KLALKLALKALKAALKLA(SEQ ID NO:19)
最近，发现了提供一定程度的细胞和组织特异性的CPP。这些所谓的“细胞穿透归巢肽”除了能够跨质膜移位外，还识别特定的细胞类型。细胞穿透归巢肽的具体实例包括靶向前列腺癌的AGR(SEQ ID NO:20)、靶向皮肤和宫颈癌的LyP-2(SEQ ID NO:21)、靶向前列腺癌、子宫颈癌和乳腺癌的REA(SEQ ID NO:22)、靶向黑色素瘤和骨癌的LSD(SEQ ID NO:23)、靶向头颈部鳞状细胞癌的HN-1(SEQ ID NO:24)、靶向心肌细胞的CTP(SEQ ID NO:25)、靶向滑膜组织HAP-1(SEQ ID NO:26)、靶向角膜细胞生长因子的293P-1(SEQ ID NO:27)。
其他变体包括不常见或非天然氨基酸、肽分支(peptide branches)或其他修饰。任何修饰应优选避免合成产率低，并且应避免聚集或溶解性差。可以通过引入修饰的氨基酸来增强二级结构的亲和力或稳定性。修饰的氨基酸可以常规地掺入通过SPPS合成的肽中。示例包括D-氨基酸、同型氨基酸、β-同型氨基酸、N-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸、非天然侧链变异氨基酸和其他不常见氨基酸(例如(Cit)、羟脯氨酸(Hyp)、正亮氨酸(Nle)、3-硝基酪氨酸、硝基精氨酸、鸟氨酸(Orn)、萘丙氨酸(Nal)、Abu，DAB、蛋氨酸亚砜或蛋氨酸砜)。例如，可以掺入D-氨基酸以增加对降解酶的抗性，同型氨基酸具有连接到该氨基酸的α-碳上的额外的CH2，并且可以具有改善的生物活性或稳定性。
在一些情况下，CPP部分将比治疗部分更靠近肽结合物的N端。在其他情况下，CPP部分将比治疗部分更靠近C端。优选地，CPP部分将比治疗部分更靠近肽结合物的N端。
天然存在的或合成的序列使膜移位的能力可以通过本领域已知的常规方法进行测试，并在所附的实施例中进行说明。
本发明的肽结合物在其第二区域中还包含治疗性货物部分。货物部分是与CPP部分不天然结合的治疗性肽。在优选的实施方式中，该货物是一种Notch信号传导的抑制剂。货物部分可以衍生自天然存在的肽。或者，货物部分可以是人工设计的。
在优选的实施方式中，货物部分衍生自共激活剂Mastermind样(MAML)蛋白(SEQID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)。MAML是高度保守的。因此，任何MAML同源物都可以用在本发明的结合物、组合物或方法中。本发明中使用的MAML衍生物应能够结合NICD或CBF-1中的至少一种。本发明中使用的MAML衍生物也应抑制功能性Notch转录复合物的组装。
本文描述了可用于本发明的肽结合物的MAML(dnMAML)变体。例如，一个优选的实施方式利用了被称为dnMAML(13-74)(SEQ ID NO:9)的62-氨基酸MAML截短物。MAML(13-74)的扭折的α-螺旋与CBF-1和NICD形成稳定的三元复合物。由于SEQ ID NO:9缺少功能性Notch转录复合物组装所必需的C端部分，因此MAML(13-74)是显性负效截短。如以下实施例中报道的，该肽已显示出有效抑制Notch信号传导和肿瘤生长。因此，在一些实施方式中，肽结合物包含含有SEQ ID NO:9或其合适的变体的货物部分。
CBF-1-NICD-MAML三元复合物的已解析晶体结构确定了参与转录复合物形成的残基。这些残基在以下序列(SEQ ID NO:9)中加下划线，并且应保留在本发明的dnMAML变体中：
LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKR AGKH
剩余的氨基酸残基可以被替换。优选地，氨基酸取代本质上将是保守的。技术人员将能够使用公知常识和表1中的信息确定给定的氨基酸取代是否保守。在一些实施方式中，货物部分包含与SEQ ID NO:9至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％同一性的氨基酸序列。例如，在某些情况下，货物部分包含与SEQ ID NO:9至少80％同一性的氨基酸序列。在其他情况下，货物部分包含与SEQ ID NO:9至少90％同一性的氨基酸序列。在其他情况下，货物部分包含与SEQ ID NO:9至少95％同一性的氨基酸序列。在其他情况下，货物部分包含与SEQ ID NO:9至少98％同一性的氨基酸序列。在优选的情况下，货物部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
在优选的实施方式中，货物部分衍生自人MML。在其他情况下，货物部分可衍生自任何MAML同源物。变体货物部分可包含衍生自不同生物的等效序列。例如，dnMAML变体可以包含等同于人MAML序列的氨基酸13至74但衍生自不同生物的MAML基因的任何肽。这样的物种变体(species variant)可以衍生自表达MAML蛋白的任何生物。例如，所述物种变体可以衍生自哺乳动物，例如灵长类、啮齿动物或家畜或牲畜。变体肽还可包含此类物种变体序列的变体，例如本文所述的缺失、添加或取代的变体。
其他变体包括修饰的、异常的或非天然的氨基酸。上文描述了适用于本发明的氨基酸，包括D-氨基酸、同型氨基酸、β-同型氨基酸、N-甲基氨基酸、α-甲基氨基酸、非天然侧链变体氨基酸和其他非常见的氨基酸(例如(Cit)、羟脯氨酸(Hyp)、正亮氨酸(Nle)、3-硝基酪氨酸、硝基精氨酸、鸟氨酸(Orn)、萘丙氨酸(Nal)、Abu、DAB、蛋氨酸亚砜或蛋氨酸砜)。
肽抑制Notch信号传导的能力可以由本领域技术人员容易地测试。例如，可以在体外测量肽抑制Notch信号传导的能力。在关于MDA-MB-231细胞的实施例中描述了合适的方法。
本发明的肽结合物在结合物的第一和第二区域之间包含连接肽。优选地，该连接肽或“接头”直接连接到第一区域并且直接连接到第二区域。
肽结合物的第一和第二区域可以共价或非共价连接。应该选择合适的接头以保持CPP和货物部分的生物活性。优选地，肽结合物的第一和第二区域通过肽接头共价连接。例如，肽结合物的第一和第二区域可以通过短的柔性肽接头共价连接。
本发明的肽结合物可以包含柔性接头、刚性接头或体内可裂开的接头。除了在将功能域连接在一起(如在柔性和刚性接头中)或在体内释放游离功能域(如在体内可裂开的接头中)的基本作用外，接头还可以提供其他优势，例如改善生物学活性和实现所需的药代动力学特性(pharmacokinetic profiles)。
在某些情况下，第一区域和第二区域可以通过柔性接头连接。柔性接头通常包含小的、非极性的氨基酸(例如甘氨酸)或极性的氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)。这些氨基酸的小尺寸提供了柔韧性，并允许连接的功能域移动。例如，富含甘氨酸的接头是柔性的，其在单个蛋白质中连接多个结构域而不干扰每个结构域的功能。丝氨酸或苏氨酸的掺入可通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，因此减少了接头与蛋白质部分之间的不利相互作用。
在某些情况下，第一和第二区域通过短的柔性接头连接。天然存在的肽接头包括包含二肽甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-丝氨酸的那些。这些二肽也可以用于本发明的肽结合物的接头中。可以将任何数量的这些二肽结合以形成合适的肽接头。例如，合适的肽接头包括但不限于：Gn(其中n是任何数字，但优选1-10)；(GA)n(其中n是任何数字，但优选1-5)；(AS)n(其中n是任何数字，但优选1-5)；及其任何组合。肽接头还可以包含小的疏水性残基，包括缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和蛋氨酸。另外地或可替代地，接头可以包含谷氨酸和苯丙氨酸。例如，在一些实施方式中，连接肽包含选自G、E、F、M或A的氨基酸。在优选的实施方式中，连接肽中的氨基酸选自G、E、F、M或A。在另一个优选的实施方式中，肽接头包含氨基酸序列GEFMA或由氨基酸序列GEFMA组成。
在其他情况下，第一区域和第二区域可以通过刚性接头连接。通常，刚性接头用于禁止离散域之间的不需要的相互作用。许多天然的刚性接头显示出通过段内氢键稳定的α-螺旋结构。或者，在某些情况下，刚性接头可以富含脯氨酸。例如，接头可以具有序列(XP)n，其中X表示任何氨基酸，优选丙氨酸、赖氨酸或谷氨酸。非螺旋接头中脯氨酸的存在可以增加刚度，并可以有效分离蛋白质结构域。可以通过更改拷贝数来轻松调整接头的长度，以实现结构域之间的最佳距离。
所选择的接头应具有合适的长度和组成，以减少空间位阻并允许任何必要的域间(即，合作)相互作用。尽管较长的肽间接头通常在保留独立的结构域折叠和生物学活性方面更好，但是它们更易于被宿主细胞的蛋白酶裂解，已知会增强抗原性并可能导致肽聚集。技术人员将理解，可以根据需要调节接头的长度，以允许适当折叠或实现肽结合物的最佳生物学活性。
在某些情况下，接头可以是2至10个氨基酸长度，特别是2至10个氨基酸之间的长度。例如，接头可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸长度。在优选的实施方式中，接头为3至8个氨基酸长度，特别是长度为3至8个氨基酸残基长度。在其他优选的实施方式中，接头为5个氨基酸残基长度。
还预期第一和第二区域可以通过非肽接头连接，包括β-丙氨酸、4-氨基丁酸(GABA)、(2-氨基乙氧基)乙酸(AEA)、5-氨基戊酸(AVA)、6-氨基己酸(Ahx)、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(AEEA，mini-PEG1)、15-氨基-4,7,10,13-四氧杂戊酸-癸酸(mini-PEG3)、三氧杂环丁烷-琥珀酸(Ttds)。
本文中描述了示例性结合物。在第一实施方式中，肽结合物包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:2的细胞穿透性肽(即ANTP)；(b)第二区域，其包含Notch信号传导抑制剂，其中该抑制剂是SEQ ID NO:9定义的dnMAML(13至74)，以及(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
在第二实施方式中，肽结合物包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:3的细胞穿透肽(即具有保守取代的ANTP变体)；(b)第二区域，其包含Notch信号传导抑制剂，其中该抑制剂是SEQ ID NO:9所定义的dnMAML(13至74)；(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
在第三实施方式中，肽结合物包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:4的细胞穿透肽(即，穿透肽)；(b)第二区域，其包含Notch信号传导抑制剂，其中该抑制剂是SEQ ID NO:9所定义的dnMAML(13至74)；(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
在第四实施方式中，肽结合物包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:5的细胞穿透肽的(即具有保守取代的穿透肽变体)；(b)第二区域，其包含Notch信号传导抑制剂，其中该抑制剂是SEQ ID NO:9所定义的dnMAML(13至74)；(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
在第五实施方式中，肽结合物包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:2的细胞穿透肽(即ANTP)；(b)第二区域，其包含Notch信号传导抑制剂，其中该抑制剂是根据以下序列的dnMAML(13至74)变体：
LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH
其中带下划线的残基是保守的，并且零个、一个、两个、三个、四个、五个或五个以上的其他残基被保守取代替换；(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
在第六实施方式中，肽结合物包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:3的细胞穿透性肽(即具有保守取代的ANTP变体)；(b)第二区域，其包含Notch信号传导抑制剂，其中该抑制剂是根据以下序列的dnMAML(13至74)变体：
LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH
其中带下划线的残基是保守的，并且零个、一个、两个、三个、四个、五个或五个以上的其他残基被保守取代替换；(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
在第七实施方式中，肽结合物包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:4的细胞穿透肽(即，穿透肽)；(b)第二区域，其包含Notch信号传导抑制剂，其中该抑制剂是根据以下序列的dnMAML(13至74)变体：
LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH
其中带下划线的残基是保守的，并且零个、一个、两个、三个、四个、五个或五个以上的其他残基被保守取代替换；(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
在第八实施方式中，肽结合物包含：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:5的细胞穿透肽(即具有保守取代的穿透肽变体)；(b)包含Notch信号传导抑制剂的第二区域，其中所述抑制剂是根据以下序列的dnMAML(13至74)变体：
LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH
其中带下划线的残基是保守的，并且零个、一个、两个、三个、四个、五个或五个以上的其他残基被保守取代替换；(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
本发明的结合物中的接头，特别是示例性实施方式(1)至(8)中任一个的结合物中的接头，可以具有允许细胞穿透肽和NOTCH抑制剂正确折叠的任何长度。在优选的实施方式中，肽接头是短氨基酸序列，例如5至10个氨基酸，特别是包含残基GEFMA或由残基GEFMA组成的序列(SEQ ID NO:28)。优选地，本发明的肽结合物如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或其变体所定义，所述变体与其具有至少80％的序列同一性，更优选与其具有至少90％的序列同一性。因此，在一个优选的实施方式中，本发明的肽结合物如SEQ ID NO:10所定义。在另一个优选的实施方式中，本发明的肽结合物如SEQ ID NO:11所定义。
可以通过例如添加亲和标签、增溶标签、色谱标签、表位标签、荧光标签或允许酶促修饰的标签中的一种或多种来进一步修饰肽结合物。本领域公知的合适标签包括：Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签、组氨酸标签、Myc标签、NE标签、S标签、SBP-标签、Softag 1、Softag 3、链球菌标签、TC标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、Spy标签、Snoop标签、BCCP、谷胱甘肽-S-转移酶标签、GFP、Halo标签、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、硫氧还蛋白标签或Fc标签。例如，本发明的结合物可以包含SEQ IDNO:12(Syntana-4)。优选地，本发明的肽结合物如SEQ ID NO:12(Syntana-4)或其变体所定义，该变体与其具有至少80％的序列同一性，更优选与其具有90％的序列同一性。在一个优选的实施方式中，本发明的肽结合物如SEQ ID NO:12(Syntana-4)所定义。
在一些实施方式中，肽结合物的全长不超过190个氨基酸。例如，肽结合物可以由少于190个氨基酸，少于180个氨基酸，少于170个氨基酸，少于160个氨基酸，少于150个氨基酸，少于140个氨基酸或少于130个氨基酸组成。在优选的实施方式中，肽结合物由120至150个氨基酸组成。例如，肽结合物可包含120至150个氨基酸，优选125至138个氨基酸，例如约125个氨基酸，约130个氨基酸，约135个氨基酸，约140个氨基酸或约145个氨基酸。SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:12(Syntana-4)中定义的肽结合物分别由127和136个氨基酸残基组成。
在一些实施方式中，其中第一区域基本上由SEQ ID NO:4或其变体组成，肽结合物可以由少于110个氨基酸，少于100个氨基酸或少于90个氨基酸组成。在优选的实施方式中，肽结合物由80至100个氨基酸组成。例如，肽结合物可包含80至100个氨基酸，优选80至90个氨基酸，82至88个氨基酸或84至86个氨基酸。例如，肽结合物可以由约85个氨基酸，约90个氨基酸或约95个氨基酸组成。SEQ ID NO:11定义的示例性结合物由85个氨基酸残基组成。
制备结合物的方法
本发明的肽结合物可以通过合成或重组技术来制备。本文提供了本发明的合成的肽结合物，特别是通过固相肽合成(solid phase peptide synthesis,SPPS)制备的结合物。本文提供了使用SPPS制备本发明的结合物的方法。SPPS的详细方案也可以在实施例2中找到。这些描述的方法可以直接应用或修改，以适应手动、准连续流或全自动SPPS系统。
可以通过逐步固相合成或涉及固相片段缩合(solid-phase fragmentcondensation,SPFC)的收敛方法来制备肽结合物。
SPPS依赖于固体支持物上受保护氨基酸的迭代偶联。由于进行了广泛的优化，包括用于有效骨架或侧链保护基团的强大的活化剂的设计，非天然氨基酸(例如假脯氨酸或异酰基二肽)的设计，其最大程度地减少了侧链反应或正在生长的肽的聚集，以及强大的接头策略和固体支持物，其有助于延长和裂解，现在常规使用SPPS方案来制备最多40个氨基酸残基的肽。因此，根据一个实施方式，通过逐步固相肽合成来制备肽结合物。
或者，当合成更长的序列时，通常优选收敛方法。收敛方法利用高效的逐步SPPS创建短序列，然后将其纯化并结合在一起以形成靶肽。收敛技术可以分为保护性片段偶联和化学连接。在前一种方法中，除了要偶联的末端外，受到完全保护的片段通过涉及羧基活化的传统方法进行缩合。在后者中，高特异性反应基团被添加到未保护的肽片段中。例如，可以使用化学选择性酰胺键形成反应，包括天然化学连接(native chemical ligation,NCL)，来连接肽段。优选地，使用收敛固相肽合成来制备肽结合物。
技术人员将理解，固体支持物的性质、偶联化学、保护方案以及用于将肽锚定至支持物的键是重要的变量，并且可能影响任何SPPS方案的成功。实施例2公开了合适的所述结合物的合成策略。
在一个实施方式中，结合物通过包括以下步骤或基本上由以下步骤组成的方法合成：
1.固体支持物的官能化
2.将第一氨基酸偶联至官能化的支持物；
3.洗涤树脂；
4.反复脱保护和偶联反应；
5.监测氨基酸偶联的进度(例如，使用茚三酮或四氢呋喃)；
6.乙酰化N末端；
7.裂解
8.缩合或连接肽片段；
9.HPLC纯化；和
10.通过质谱分析目标肽
肽结合物横穿生物膜的能力取决于α-螺旋二级结构。通过重组技术产生的较早的肽结合物不能横穿生物膜。具体而言，从细菌细胞中提取并任选暴露于少量去污剂(离子和非离子)或变性剂(尿素或胍基)的肽结合物无法进入培养的细胞。
本文描述了可以纳入上述方案以防止肽聚集和结合物错误折叠的其他步骤：修饰流动相以破坏氢键(即通过添加DMSO、离液盐、非离子型去污剂或碳酸亚乙酯“MagicMixture”)，已知在高温下进行偶联反应、超声处理或减少负载在树脂上的肽的量也可以减少聚集。已经证明，由SPPS(例如使用本文描述的方案)产生的肽结合物不会聚集。此外，已经证明由SPPS产生的肽结合物折叠成功能性肽而无需另外的变性-复性步骤或分子伴侣。
治疗方法
本文提供了本发明的结合物，在通过疗法治疗人或动物体的方法中的应用。特别地，本发明提供了结合物在治疗癌症的方法中的应用。该方法包括使癌细胞与该结合物接触。该结合物包含两个部分(或区域)。在某些情况下，第一区域包含SEQ ID NO:4的细胞穿透肽或具有至少80％序列同一性的同源物。在其他情况下，第一区域包含SEQ ID NO:2的细胞穿透肽或具有至少80％序列同一性的同源物。第二区域包含作为Notch信号传导的抑制剂的肽，其为SEQ ID NO:9的肽或其与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性的同源物。在优选的实施方式中，第一和第二区域通过2-10个氨基酸，特别是2-10个之间的氨基酸的肽接头连接。
在该方法中使用的优选的结合物是以上讨论本发明的肽结合物和示例性实施方式的部分中提到的那些。
本发明还提供了结合物在治疗或抑制癌症的方法中的应用。在一些情况下，结合物可以用在靶向肿瘤起始细胞(CSC)和祖细胞的方法中。在优选的实施方式中，结合物用在靶向CSC的方法中。通过抑制CSC中的Notch信号传导，结合物可用于减少CSC的侵袭性或扩散(转移)。侵袭性与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有关。结合物可以另外地或可替代地用于预防或逆转EMT转分化的方法中。功能障碍Notch信号传导也与肿瘤相关的血管生成有关。因此，本发明的结合物还可用于靶向形成与肿瘤相关的微脉管系统的基质细胞(即，血管内皮或血管周细胞)。因此，根据一些实施方式，本发明提供了用于预防或抑制与肿瘤相关的血管生成的方法的结合物。结合物可以例如用于抑制或预防发芽血管生成、血管重塑和病理性内皮-壁细胞相互作用的方法中。
CSC似乎是大多数(即使不是全部)癌症的共同组成部分。因此，该结合物可用于治疗许多不同癌症的方法，包括血液系统恶性肿瘤、宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、口腔癌、肝细胞癌和胃癌、骨肉瘤、间皮瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤。在一个优选的实施方式中，待治疗的癌症是三阴性乳腺癌。在另一个优选的实施方式中，待治疗的癌症是T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cellacute lymphoblastic leukemia,T-ALL)。
用于治疗癌症的方法中的典型结合物可以包括：(a)第一区域，其包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5；(b)第二区域，其包含SEQ ID NO:9或其变体；(c)第一和第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。适用于治疗癌症的方法的优选结合物由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12(Syntana-4)表示。在一个特定实施方式中，用于抑制癌症的方法中的本发明的结合物具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
这些相同的结合物可用于制造治疗癌症的药物。特别地，结合物可以用于制备靶向具有不正常的Notch信号传导的癌细胞的药物。在一个优选的实施方式中，结合物可以用于制备抑制CSC中Notch信号传导的药物。这些CSC可能存在于许多不同的癌症中，包括但不限于血液系统恶性肿瘤、宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、口腔癌、肝细胞癌和胃癌、骨肉瘤、间皮瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤。
还提供了一种使用本发明的结合物治疗癌症的方法，其中该方法包括以下步骤中的至少一个：
(a)鉴定易于治疗的受试者，包括确定Notch信号通路中涉及的一种或多种基因或蛋白质的表达，其中Notch信号通路中涉及的一种或多种基因的活性或表达与正常细胞中的水平相比的变化，可诊断受试者患有癌症或具有癌症风险；和/或
(b)对有需要的受试者施用有效量的该结合物；和/或
(c)使结合物与具有不正常的Notch信号传导的癌细胞接触。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括使癌细胞(例如CSC)与本发明的结合物接触。可以通过所述方法治疗的癌症的非限制性例子包括血液系统恶性肿瘤、宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、口腔癌、肝细胞癌和胃癌、骨肉瘤、间皮瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤。
例如，在一个优选的实施方式中，该方法包括用本发明的结合物治疗诊断为患有T-ALL或三阴性乳腺癌的受试者，其中该结合物包含第一区域，该第一区域是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或与其具有至少80％序列同一性的同源物的细胞穿透肽，并且在第二区域中的肽，其为Notch信号传导的抑制剂并且是SEQ ID NO:9或与其具有至少80％序列同一性的同源物。
鉴定受试者是否易受治疗的方法涉及确定Notch信号通路中涉及的至少一种基因的表达。特别地，与正常的非病理性细胞中的表达水平相比，涉及Notch信号通路的至少一种的表达的变化，指示受试者易于使用所述结合物治疗。Notch信号传导中涉及的表达或活性蛋白的类似变化也将指示对治疗的敏感性。在某些情况下，Notch通路中涉及的基因或蛋白质选自Jagged1、Jagged2δ样4、E-钙黏着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1、Hes5或其组合。
还描述了监测治疗患有癌症或有癌症风险的受试者的治疗方案的方法，其包括确定Notch信号通路中涉及的一种或多种基因的活性或表达。一方面，Notch信号通路涉及的基因选自Jagged1、Jagged2Delta样4、E-钙黏着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1、Hes5或其组合。
本发明的方法还可以通过例如在培养基中或在固体支持物上离体接触细胞样品来进行。替代地或另外，所述方法可以在体内进行，例如，通过将癌细胞样品移植到测试动物(例如裸鼠)中，并向测试动物给药所述测试剂或组合物。体内测定的一个优点是可以在活体动物中评估测试剂的有效性，从而更接近于模拟临床情况。由于体内分析方法通常较为昂贵，因此在使用体外方法鉴定“先导”试剂后，体内分析方法可以特别用作二次筛选。
药物组合物
本发明的结合物可以被配制成药物组合物。该药物组合物可用于治疗方法，特别是用于或治疗或预防与异常Notch信号传导有关的疾病、病症或症状的方法。例如，该药物组合物可以用于治疗癌症的方法。本发明的药物组合物可以另外地或可替代地用于制造治疗癌症的药物。本发明还提供了一种治疗或预防癌症的方法，其中该方法包括向需要治疗或预防癌症的受试者给药包含本发明的肽结合物的药物组合物。
本文公开，组合物中的结合物可具有1至50mg/mL的浓度。例如，结合物可以为2-40mg/mL，3-30mg/mL，4-20mg/mL或5-10mg/mL。优选地，结合物可以为4-20mg/mL。更优选地，结合物可以为5-10mg/mL。例如，结合物的浓度可以为约1mg/mL，约2mg/mL，约3mg/mL，约4mg/mL，约5mg/mL，约6mg/mL，约7mg/mL，约8mg/mL，约9mg/mL或约10mg/mL。
包含本发明的肽结合物的组合物的配制可以使用标准的药物配制化学和方法进行，所有这些对于熟练的技术人员都是容易获得的。除了本发明的肽结合物之外，本发明的组合物还包含药学上可接受的载体，特别是以下至少一种：药学上可接受的溶剂、赋形剂或辅助化合物。溶剂、赋形剂和辅助物质通常是在接受组合物的个体中不诱导免疫应答的药剂，并且可以在没有异常毒性的情况下给药。药学上可接受的溶剂、赋形剂或辅助化合物的选择将取决于预期的给药途径、标准药学实践和已知技术。Remington的PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中提供了药学上可接受的赋形剂、介质和辅助物质的详尽探讨。
用于配制给药于受试者的药剂的药学上可接受的溶剂是本领域众所周知的。用于肠胃外给药(即静脉推注、静脉内输注、肌内、腹膜内或皮下注射)的优选组合物为无菌水溶液的形式，例如水、生理缓冲盐水或林格氏溶液。可以使用的其他溶剂包括乙二醇、甘油、油(例如橄榄油)或可注射的有机酯。肠胃外给药的组合物可任选地包含其他物质，例如盐或单糖，以确保该组合物与血液等渗。
或者，可以将本发明的肽结合物包封，吸附至颗粒载体或与颗粒载体结合。合适的颗粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的PLG微粒。参见，例如，Jeffery et al.(1993)Pharm.Res.10:362-368。也可以使用其他颗粒体系和聚合物，例如聚合物，例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，以及这些分子的结合物。
用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
除活性成分外，药物组合物还可包含生理上可接受的赋形剂，其例如用作分散剂、湿润剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂、螯合剂、pH缓冲物质或增加吸收的化合物。生理上可接受的赋形剂包括例如碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，以及抗氧化剂，例如抗坏血酸或谷胱甘肽。
药物组合物还可包含一种或多种另外的辅助化合物，例如诊断试剂、营养物质、毒素或治疗剂，例如癌症化疗剂和/或维生素。
药物组合物可以以无菌可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或出售。可注射的组合物可以单位剂型制备、包装或出售，例如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中。在另一个实施方式中，活性成分以干燥或冻干的形式(例如粉末或颗粒)提供，用合适的介质(例如，生理缓冲盐水)重构，然后将重构的组合物进行肠胃外给药。
一旦配制，就可以使用多种已知途径和技术将组合物递送至受试者体内。例如，组合物可以作为在油性或水性介质中的可注射溶液、悬浮液或乳剂提供，并通过使用常规针头和注射器或使用液体喷射注入系统肠胃外、皮下、表皮、皮内、肌内、动脉内、腹膜内、静脉内注射给药。溶液、悬浮液或乳剂也可以通过适用于呼吸或肺部给药的细分喷雾器来给药。如果将本发明的肽结合物配制成糊剂或可植入的缓释或可生物降解的制剂，则可将组合物局部给药于皮肤或粘膜组织，例如经鼻、气管内、肠、直肠或阴道。其他给药方式包括口服给药、栓剂以及主动或被动透皮递送技术。合适的给药途径可以由熟练的从业者根据待治疗的特定症状、疾病或状况来确定。给药可以在感兴趣的部位或组织局部进行，也可以是全身性的。
适当的有效量可以由本领域技术人员容易地确定。这样的量将落在可以通过常规试验确定的相对较宽的范围内。组合物可以包含约0.1％至约99.9％的肽结合物，并且可以使用本领域技术人员已知的方法直接给药于受试者，或者可替代地，离体递送至源自受试者的样品。
将肽结合物或组合物以与剂量制剂相容的量和对治疗有效的量给药于受试者。适当的有效量将落在相对较宽的范围内，但是可以由本领域技术人员通过常规试验容易地确定。“Physicians Desk Reference”和“Goodman and Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics”对于确定所需量很有用。如本文所用，术语本发明的肽的“治疗有效剂量”是指足以减少Notch信号传导和/或减少或至少部分抑制肿瘤生长的剂量。
例如，当配制用于肠胃外给药时，组合物可以以1-50mg/mL，2-40mg/mL，3-30mg/mL，4-20mg/mL或5-10mg/mL的结合物浓度给药。优选地，结合物可以4-20mg/mL的浓度给药。更优选地，结合物可以5-10mg/mL的浓度给药。例如，结合物的浓度可以为约1mg/mL，约2mg/mL，约3mg/mL，约4mg/mL，约5mg/mL，约6mg/mL，约7mg/mL，约8mg/mL，约9mg/mL或约10mg/mL。
可以基于受试者的质量(kg)或表面积(m2)来计算给药于受试者的结合物的量(mg)。例如，治疗有效量的结合物可以以1-80mg/kg的剂量给药。例如，结合物可以2-80mg/kg，例如10-70mg/kg，20-60mg/kg，30-50mg/kg或40mg/kg的剂量给药。优选地，治疗有效量的结合物以20-60mg/kg的剂量给药。更优选地，治疗有效量的结合物以30-50mg/kg的剂量给药。
例如，用于肠胃外给药(例如皮下给药)的结合物或组合物可以以1-80mg/kg的剂量给药。例如，结合物可以2-80mg/kg，例如10-70mg/kg，20-60mg/kg，30-50mg/kg或40mg/kg的剂量给药。优选地，用于肠胃外给药的结合物或组合物可以20-60mg/kg的剂量给药。更优选地，用于肠胃外给药的结合物或组合物可以以30-50mg/mL的剂量给药。
或者，肽结合物的剂量可以在0.1-40mg/kg之间，例如1-40mg/kg，10-35mg/kg，15-30mg/kg，例如约20mg/kg。对于本发明的某些肽结合物，使用的剂量可以更高，例如80mg/kg或更高。对于本发明的一些肽结合物，所使用的剂量可以高于40mg/kg。
这样的剂量可以液体制剂的形式，以合适的浓度提供提供，该浓度允许以适当体积通过所选择的途径给药。
给药剂量将取决于许多因素，包括组合物的性质、给药途径以及给药方案的时间表和时间。本发明的肽结合物或组合物可以在相对较短的时间内通过输注以单剂量的形式给药于受试者，或者可以使用分步治疗方案来给药，其中在较长的时间段内多次给药。例如，在一个实施方式中，单次给药单剂量。在一个替代的实施方式中，在相同的时间但是例如在不同的部位向受试者给药多个剂量。在另一个实施方式中，在多个时间给药多个剂量。例如，在一个优选的实施方式中，本发明的肽结合物以每3天约20mg/kg的剂量给药。这样的多剂量可以分批给药，即在同一时间在不同部位多次给药，或可以单独给药，在多个时间中的每一个给药一次(任选在多个部位)。可以使用这种给药方案的任何组合。
该组合物可以配制在单位剂量或多剂量密封的容器中。单位剂量可以包含1mg-200mg，例如2mg-180mg，3mg-160mg，4mg-140mg，5mg-120mg，或6mg-100mg，7-80mg，8-60mg，9-40mg或10-20mg的结合物。优选地，单位剂量可以包含8-60mg的结合物。更优选地，单位剂量可以包含10-20mg的结合物。剂量可以液体制剂的形式，以合适的浓度提供，该浓度允许以适当体积通过所选择的途径给药。例如，在将结合物皮下给药的情况下，剂量可以配制为0.5-5mL，例如1mL-2mL的体积。或者，当结合物要静脉内给药时，剂量可以配制为5-200mL，例如10-150mL，15-100mL或20-50mL的体积。优选地，可以将结合物配制为10-150mL的体积。更优选地，可以将结合物配制为20-50mL的体积。
本领域技术人员将知道，调节Notch信号通路中一种或多种基因的活性或表达以治疗受试者癌症所需的肽结合物或治疗剂的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和总体健康状况以及给药途径和给药治疗次数。考虑到这些因素，技术人员将根据需要调整特定剂量。通常，首先使用I期和II期临床试验确定药物组合物的配方以及给药途径和频率。
本发明的肽结合物或组合物的递送可以单独使用或与其他治疗或治疗组分组合使用。可以与本文所述的药剂组合使用的化疗剂的实例包括但不限于小分子抗癌药(例如紫杉烷、铂类似物(顺铂卡铂、奥沙利铂)柔红霉素和其他蒽环类药物及其聚合物、放线菌素、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine,CA)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、氟尿苷(floxuridine,5-FUdR)、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、秋水仙碱、长春新碱、长春碱、依托泊苷、替尼泊苷、伊立替康、PARP抑制剂、己烯雌酚及其他激素和类似物)、大分子抗癌药物，例如单克隆抗体(例如曲妥珠单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗)或抗体-药物结合物(例如曲妥珠单抗艾美坦辛(trastuzumab emtansine)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin))。在一些实施方式中，大分子抗癌药是酪氨酸激酶抑制剂(例如，ado-曲妥珠单抗、阿法替尼、阿西替尼、波舒替尼、卡博替尼、克唑替尼、达沙替尼、艾美坦辛、厄洛替尼、拉帕替尼、依鲁替尼、伊马替尼、马赛替尼(mastinib)、米哚妥林(midostaurin)、尼罗替尼、帕唑帕尼、帕妥珠单抗(pertuzumab ponatinib)、帕纳替尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、曲妥珠单抗或凡德替尼)，在其他实施方式中，本发明的肽和组合物与所有新的免疫肿瘤疗法(例如嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法)一起施用。在一些实施方式中，检查点抑制剂是PD-1和PD-L1抑制剂。在一些实施方式中，检查点抑制剂是纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗。本发明的肽和组合物还可以与抗炎药(例如非甾体抗炎药和皮质类固醇)或抗病毒药(例如利巴韦林、维达拉滨、阿昔洛韦和更昔洛韦)一起给药。两种或更多种组合的化合物可以分别、同时或顺序地给药。
本发明尤其涉及与Notch信号通路的异常活化有关的疾病或其他状况的治疗。这些治疗可用于对Notch信号通路异常活化敏感的任何动物。例如，待治疗的受试者可以是以下亚门的任何成员，包括但不限于人类和其他灵长类，包括非人类灵长类，例如黑猩猩和其他猿类和猴子类；牲畜，例如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家禽，野生鸟类和野味鸟类，例如鸡、火鸡和其他鸡类鸟、鸭、鹅等。在优选的实施方式中，受试者将是人类。在替代实施方式中，受试者将是家畜、实验室受试者或宠物。因此，本发明的分子或组合物可用于治疗任何此类物种。以上术语并不表示特定年龄。因此，成人和新生儿都将被覆盖。
还提供了适合用于治疗癌症的肽结合物或药物组合物，其以试剂盒的形式包装，优选地在容器中。试剂盒可包含一系列成分以进行治疗。例如，试剂盒可以包含冻干形式的本发明的肽结合物，合适的无菌、无热原性溶剂(例如磷酸盐缓冲盐水)和一种或多种其他治疗剂。或者，该试剂盒可以包含适于肠胃外给药的制剂形式的本发明的药物组合物，以及一种或多种其他治疗剂。试剂盒可以任选地包括其他合适的试剂、对照或说明书。
实施例
提供以下实施例以进一步说明本发明的优点和特征，但无意限制本发明的范围。尽管它们是可能使用的典型方法，但也可以使用本领域技术人员已知的其他过程、方法或技术。
实施例-1：(参考实施例)ANTP-MAML(TR4)的重组制备。
裂解表达ANTP构建体的大肠杆菌细胞(US 8748112)，并通过阳离子交换(图3a)或尺寸排阻色谱(图3c)纯化ANTP肽。根据第一种方法，将细胞提取物应用于10mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中的阳离子交换柱。用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中的1M NaCl梯度洗脱ANTP肽。纯度经计算至少为80％，产量超过10mg/L细菌培养物。当使用离子交换的Superdex-75尺寸排阻色谱法纯化时，该肽的纯度至少为95％。使用抗组氨酸印迹确认了肽的身份(分别为图3b和图3d)。在190和270nm之间测量纯化的ANTP的圆二色性光谱。当溶解于浓度为1mg/ml的10mM磷酸钠缓冲液(pH 7)中时，分离出的ANTP会正确折叠，如其二级结构所示(图4)。
使用基于pET的T7表达载体在BL21(DE3)、JM109(DE3)或Rosetta感受态细胞中制备了重组ANTP-dnMAML(13-74)融合蛋白(WO 2009/044173)。表达了少量的重组ANTP-dnMAML肽并形成了不溶的细胞内聚集体(包涵体)。使用标准方案从细菌中提取包涵体(例如Triton-X100提取)。然后将提取的重组肽溶解(例如，使用6M GuHCl)。然后，在变性条件下，在8M尿素中通过IMAC纯化重组ANTP-dnMAML，并使用众所周知的重折叠方法，通过逐步透析将其重折叠到PBS缓冲液中(图5)。平均而言，肽产量至少为0.1mg/L细菌培养物。
尝试在其他宿主生物中或更大规模地制备重组ANTP-dnMAML肽均未成功。已经发现重组的ANTP-dnMAML不能正确折叠并因此与细胞的膜成分相关联，从而导致不溶性和细胞毒性。还尝试了使用Pichia pastoris的重组表达，但是产量低并且大多数材料是不溶的。哺乳动物表达系统的使用也不成功。例如，用在基于pCMV的启动子控制下表达的ANTP-dnMAML构建体转染的CHO细胞无法表达ANTP-dnMAML(图6)。该结果可能是重组蛋白诱导的毒性的结果。
对于以下体内研究，通过SDS-PAGE估计重组ANTP-dnMAML(即TR4)的纯度约为20％。
在小鼠中建立的乳腺癌异种移植物(MDA-MB-231)用于评估TR4的体内效力。将小鼠分成两组，每两天18次，注射PBS作为对照，或注射重组ANTP/DN-MAML融合蛋白(每组n＝6)。用PBS处理的对照小鼠发生了迅速生长的肿瘤(图7)。
在具有免疫能力的小鼠中研究了重组ANTP/DN-MAML的免疫原性。每天一次，用不含佐剂的重组ANTP/DN-MAML(0.2ml，2.5mg/ml)静脉免疫动物，每天一次，持续5天。在4个月内每周对小鼠放血一次，并通过ELISA监测免疫反应。将血样在PBS中按1:10、1:100和1:1000稀释，并通过ELISA在天然重组ANTP/DN-MAML(50pg/ml包被)上监测免疫反应，并使用抗小鼠抗体进行检测。结果表明，重组ANTP/DN-MAML不能以每周2.5mg的剂量在具有免疫能力的小鼠中引起免疫反应。
为了确定最大耐受剂量，当小鼠达到12周龄时开始重组ANTP/DN-MAML尾静脉给药。持续监测小鼠的低血糖休克或药物副作用的迹象，如果体重减轻超过15％，则将其杀死。从4mg/kg/天开始测试各种剂量。发现ANTP/DN-MAML的57mg/kg/天是最大耐受剂量。在此剂量下，小鼠食欲不振、体重减轻和低血糖症。通过在注射后三天杀死该动物来终止该实验。
实施例2：使用固相肽合成法合成肽结合物的方法
铯盐法
可以使用多种技术将第一残基附着到树脂上。下述方法与Merrifield树脂的使用兼容。将羧酸溶解在甲醇(5mL/mmol)中，加水(0.5mL/mmol)。用20％碳酸铯水溶液滴定溶液至pH 7.0。将混合物蒸发至干燥。加入DMF(2.5mL/mmol)并蒸发至干燥(45℃)。加入第二份DMF(2.5mL/mmol)，蒸发至干燥(45℃)。在定轨摇床上设置一个带有加热罩和温度计的烧瓶。将树脂在DMF中溶胀(每克树脂6-8mL)。加入干燥的羧酸铯盐(基于树脂的氯取代基为1.0当量)。铯盐必须完全干燥才能获得满意的结果。将混合物在50℃摇动24小时。过滤树脂。用DMF，然后50％(v/v)的DMF水溶液，然后50％(v/v)的甲醇水溶液，最后是甲醇彻底洗涤树脂。真空干燥树脂至恒重。
Fmoc-氨基酸与Rink、PAL或Sieber树脂的连接
在圆底烧瓶中，将树脂悬浮在20％v/v哌啶/DMF中(每克树脂约15mL)。在另一个烧瓶中，以最小量的DMF溶解1.5至2.5当量(相对于树脂)的Fmoc-氨基酸。加上相等的HOBt。搅拌混合物直至HOBt溶解。如果HOBt不能完全溶解，添加DMF使其溶解。向Fmoc-氨基酸/HOBt混合物中加入1.0当量(相对于氨基酸)DIC。为烧瓶配备干燥管。使混合物在室温下静置10分钟。将活化的氨基酸溶液添加到树脂中，并在烧瓶上配备干燥管。在室温下用机械振荡器将混合物搅动2至3小时。取出少量树脂样品，然后用DCM洗涤。使用Kaiser测试法测试游离氨基。如果有游离氨基，则向反应烧瓶中加入1当量的乙酸酐和吡啶，并混合30分钟。在细孔烧结玻璃漏斗中过滤树脂，用DMF洗涤3次，然后用DCM洗涤3次，最后用甲醇洗涤3次。在每次洗涤中，使用足够的溶剂使树脂成浆。最终甲醇洗涤后，真空干燥树脂至恒重。可以从树脂的重量增加来估计树脂的取代。
标准耦合程序
本文描述了一种去除Boc保护基的方法，该方法包括以下步骤：使用每克树脂1mL的TFA/DCM，将树脂悬浮在50％(v/v)TFA/二氯甲烷(dichloromethane,DCM)中。在室温下摇动树脂30分钟。过滤树脂。用DCM(1mL/gm树脂)洗涤树脂3次。用5％(v/v)二异丙基乙胺(diisopropylethylamine,DIPEA)/DCM)(1mL/gm树脂)洗涤树脂3次以除去TFA。
本文描述了一种去除Fmoc保护基的方法，该方法包括以下步骤：将树脂放入圆底烧瓶中，并在DMF中添加20％(v/v)哌啶(约10mL/gm树脂)。将混合物在室温下摇动30分钟。过滤树脂，并用几份DMF洗涤。
还介绍了一种标准的封盖程序，该程序包括以下步骤：过滤并用DMF洗涤树脂几次。将树脂悬浮在DMF溶液中，该溶液包含乙酸酐(基于树脂取代基为50当量)和吡啶(基于树脂取代基为50当量)。DIPEA可以代替吡啶。在室温下轻轻摇动30分钟。过滤并用DMF洗涤树脂。执行Kaiser测试。如果Kaiser测试结果不是阴性，请重复该封盖程序。
监测固相反应
Kaiser测试是对伯胺的非常敏感的测试。它通常在SPPS中用于确定偶联反应是否完成。茚三酮与肽树脂的脱保护的N末端胺基反应生成强烈的蓝色。Kaiser测试对于检测仲胺不可靠。因此，如果N-末端氨基酸是脯氨酸、哌啶酸或四氢异喹啉-3-羧酸，则使用另一种测试，例如Isatin测试或Chloranil测试。
Figure BDA0002465788690000221
Figure BDA0002465788690000231
用49mL吡啶(从茚三酮中新蒸馏)稀释1.0mL上述溶液。
Kaiser测试程序：
在试管中取10-15颗树脂珠，并贴上标签S。取试管S和另一个标为R的空试管(参考)。在每个试管中添加：2至3滴试剂A；2至3滴试剂B；和2至3滴试剂C。将两个试管在110℃加热5分钟，然后将颜色与参考样品进行比较。
标准HF裂解法
将涂有特氟龙的搅拌棒和肽树脂放入HF装置的反应容器中。加入适当的清除剂混合物。将盖子固定在反应容器上，并在干冰/甲醇浴中冷却至少5分钟。对于每0.2mmol的底物树脂，将10mL HF蒸馏至反应容器中。收集HF时，将温度保持在-5℃至0℃之间。搅拌裂解混合物时，将温度保持在0℃至5℃之间30至60分钟。如果底物包含精氨酸(Tos)，裂解可能需要2个小时。反应时间结束后，在氮气流下蒸发HF。过滤树脂并用少量TFA洗涤。合并滤液。减压蒸发得到粗产物。
肽的EHPLC纯化和MS验证
根据合成肽的使用方式，从树脂裂解并分离出的粗肽可能足够纯。如果合成的肽需要HPLC纯化，则在C-18肽柱上从0％到70％乙腈的30分钟梯度洗脱通常会提供纯度令人满意的肽。长肽或相对疏水的肽也可以在C-4或C-8柱上纯化。HPLC溶剂应包含0.1％的三氟乙酸(TFA)，它可作为离子配对试剂并改善肽峰的形状。合适的含水缓冲液反相HPLC是0.15％的TFA水溶液。合适的有机缓冲液反相HPLC是0.10％的TFA乙腈溶液。
如果粗肽中含有洗脱接近产物的杂质，则较浅的梯度(例如0％-30％乙腈或10％-40％乙腈)可以提供更好的分离效果。
粗肽应溶解在最小体积的0.1％TFA水溶液中。如果该肽不溶于稀TFA，则它可能溶于含0.1％TFA的6M盐酸胍中。(可以通过将1克胍溶解在1毫升水中来制备6M盐酸胍溶液)。胍盐在柱的空隙体积中洗脱，而肽稍后洗脱。
将肽溶液注入HPLC色谱柱，并在220nm处监测色谱柱的洗脱液。收集肽洗脱时的馏分。测试馏分并将所有仅包含纯肽的馏分合并。可将合并的馏分冻干以分离纯化的肽。
肽的分子量应使用已知方法通过质谱法(例如通过ESI-QQQ、与ESI-QQQ偶联的HPLC)进行验证。
通过将上述肽的干燥质量与根据以下公式计算的理论产率进行比较，可计算出产率百分比：
理论产率(mg)＝(sresin)(mresin)(MW产物)
其中sresin是以mmol/g计的树脂取代基，mresin是以g计的树脂干质量，MW产物是以mg/mmol计的产物的分子量。
实施例3：ANTP-MAML(Syntana-4)的合成制备
通过SPPS合成Syntana-4(SEQ ID NO:12)。出乎意料的是，该方法产率高且肽结合物有功能。全长肽结合物通过反相HPLC纯化，使用的水流动相由0.1％TFA的水溶液组成，有机的流动相由0.1％的TFA的乙腈溶液组成，其中有机缓冲剂的比例从22％到55％增加超过20分钟。洗脱的结合物的纯度至少为97％。随后将肽冻干并在-20℃下储存。
通过质谱分析结合物。预期的MW是16896，观察到的是16982(图8)，表明已制成正确的肽序列。
将10mg Syntana-4肽溶解在7ml组织培养级PBS中，轻轻涡旋并在4℃放置48小时。这相当于1mg/ml的净肽(70％的肽含量)。可溶性肽的产率大于95％。将样品等分并冷冻保存，并在各种实验中冷藏。
通过圆二色性(circular dichroism,CD)分析重组ANTP和Syntana-4以评估螺旋含量。所有样品都给出了特征性的α-螺旋图案。由于已知会干扰CD的高盐含量，在较低的波长下会看到CD光谱的某些失真。ANTP在PBS缓冲液中显示出典型的高α-螺旋肽结构的两倍极小值(double minima)(图9a)。当溶解于4种缓冲液之一中时，即PBS(图9b)、0.9％非缓冲盐水(图9c)、HEPES缓冲液(图9d)和1mM Tris-HCL pH 7.5、5％PEG(图9e)，Syntana-4肽恢复了类似的50-60％的高α-螺旋结构，与预测的65％结构一致。
实施例4：Syntana-4可以浓缩至至少5mg/mL
在实施例1中，重组ANTP/DNMAML(TR4)以不纯制剂的形式给药于小鼠。使用SDS-PAGE，实施例1中给药于小鼠的TR4的纯度估计为约20％。因此，这些实验中使用的TR4的浓度被高估了。相反，发明人已经证明，如实施例1所述制备的TR4在PBS缓冲液中不能被浓缩至超过0.5mg/mL而不会显示出聚集的迹象(可见沉淀)。
相反，Syntana-4的纯度很高(99％)。纯Syntana-4也是稳定的，从其二级结构观察浓度为1mg/mL和5mg/mL时可溶于PBS缓冲液(图10)，并具有线性浓度依赖性的特征性α-螺旋图。对照样品，AntP和dnMAML也显示出α-螺旋结构特性。确定相对蛋白质浓度和聚集的其他方法在本领域中是已知的，包括液相色谱法、多角度光散射、分析超离心和光谱技术。
实施例5：染料与Syntana-4的缀合
ANTP的分子结构(使用Swiss PDB Viewer使用已解析的NMR结构和可从RCSB蛋白质数据库https://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1SAN获得的数据文件生成)显示暴露的赖氨酸残基和一个适合荧光标记的暴露的半胱氨酸残基(图11)。
将市售的荧光染料(图12)与Syntana-4缀合。在1mg/ml Syntana-4肽样品上进行飞行员缀合(Pilot conjugations)。将100μg Syntana-4肽溶解在PBS中，并用10mM TCEP处理以还原硫醇1小时。样品在Zeba柱中脱盐，并与每种染料的20倍摩尔过量反应。用40倍的游离半胱氨酸淬灭未反应的染料，并通过Zeba脱盐柱纯化。紫外可见光谱用于确定缀合质量和峰吸收移位(图13)。
Syntana-4-IR、Syntana-4-Cy5和Syntana-4-Cy5.5均发出了预期的荧光。Syntana-4肽-IR染料峰(箭头2)在690nm处，在所需的620nm区域中有一个较小的峰。峰很尖，指示可溶的结合物，但是肽峰(280nm)不那么尖。Cy5结合物峰位于600nm和650nm(箭头，2)处。峰很尖，指示可溶的结合物，但肽峰(箭头，1,280nm)不那么尖。Cy5.5结合物峰在630nm和680nm处(箭头，2)。峰很尖，指示可溶结合物，而肽峰(箭头，1,280nm)比其他两种染料结合物更尖。
在荧光下观察的SDS PAGE凝胶显示Syntana-4肽-IR染料结合物最亮，但具有副反应产物。Cy5.5和Cy5结合物更清洁，并显示出荧光性质。
Syntana-4可以成功缀合到基于马来酰亚胺的染料上(图13)，显示出Syntana-4游离的巯基是可及的。Syntana-4-IR、Syntana-4-Cy5和Syntana-4-Cy5.5发出预期的荧光。
实施例6：肿瘤生长抑制
给16只BALB/c裸鼠(6-8周龄)皮下接种在冰冷的50％DMEM介质/FCS+50％基质中的200万MDA-MB231肿瘤细胞。监测这些肿瘤并且当其长到大约24-100mm3(直径大约4-5mm)时使用。将小鼠随机分组(在Syntana-4治疗中6只，在化学疗法中5只，盐水处理5只)。
对16只小鼠进行如下处理：
Figure BDA0002465788690000251
在治疗方案结束时，将动物剔除并解剖。去除胃肠道，并用无菌生理盐水溶液洗涤。解剖肿瘤并分成两部分。将一半肿瘤在液氮中速冻，并用于制备用于Notch基因的Q-PCR的mRNA。将另一半肿瘤石蜡包埋并切片(5-10μm)到载玻片上。经Syntana-4处理的4种肿瘤产生了令人满意的组织碎片用于评估。
肿瘤大小计算为(LxWxW)/2，并绘制为从开始治疗当天起的百分比变化(图14)。在两个独立的实验中，与标准化疗(紫杉醇)相比，Syntana-4能够延迟肿瘤的生长。使用考虑到生长进度(重复措施)的方差分析(ANOVA)，与对照组(紫杉醇和生理盐水)相比，肿瘤的生长减少具有统计学意义。
第14、16和18天的Syntana-4数据点为(Students T-检验)
比较 第14天P-值 第16天P-值 第18天P-值
生理盐水vs Syntana-4 0.01，明显 0.04，明显 0.03，明显
化疗药vs Syntana-4 0.14，不明显 0.12，不明显 0.04，明显
响应的显着性的P值(双向方差分析)为
比较 P-值 显著差异？
生理盐水vs Syntana-4 0.006 是
化疗药vs Syntana-4 0.11 否
实施例7：药效学研究
进行RT-定量PCR以评估Syntana-4对Notch靶基因以及Notch-1和Notch-4基因表达的影响。使用RNAEasy QIAGEN试剂盒从速冻切除的肿瘤组织中提取mRNA。使用RocheFirst Strand DNA合成试剂盒，可从0.5μg总RNA中制备cDNA。下表总结了与对照(生理盐水处理)动物相比，四种经Syntana-4处理的肿瘤的基因表达的倍数变化。还使用内部GAPDH标准对基因表达水平进行了标准化(图15)。
对HES5和HEY2的评估可用于提供肿瘤组织中Syntana-4活性的强大药效学读数。这提供了靶基因转录抑制的证据。基因表达分析表明，在用Syntana-4治疗的MDA-MB231异种移植肿瘤中，HES5和HEY2基因始终被下调。对其他测试基因有可变的影响。与Hes-2(最多3倍)相比，Hes-5似乎受到的影响更大(mRNA表达降低6到20倍)。
实施例8：经Syntana处理的肿瘤的免疫组织化学
使用Ki67抗体测定法进行免疫组织化学染色，以评估Syntana-4对肿瘤细胞增殖能力的影响(图16)。根据下表将肿瘤暴露于Syntana-4或生理盐水。
Figure BDA0002465788690000261
Ki67染色在对照肿瘤中超过80％的细胞中呈阳性(箭头)。对于MDA-MB-231异种移植模型，这是预期的。1-2号和1-4号肿瘤有中等但显著的减少，其中40-60％的细胞显示Ki67阳性染色(粗体箭头)。因此，与用生理盐水对照治疗的任何区域没有减少相比，用Syntana-4治疗的肿瘤区域中的细胞增殖显著减少。
实施例9.Syntana-4引起MDA-MB-231细胞凋亡
通过膜联蛋白V-DAPI染色鉴定和定量凋亡细胞。将细胞以15,000个细胞/孔接种，并在48小时后分三份用Syntana-4、ANTP或阿霉素处理。72小时后，通过流式细胞仪分析细胞。正如作用机制所预期的那样，Syntana-4导致凋亡增加(图17a，右上象限图)。由直方图计算出凋亡细胞占所收集细胞总数的百分比。
实施例10.Syntana-4引起MDA-MB-231细胞生长抑制
用Syntana-4、GSI-1抑制剂或ANTP处理MDA-MB-231细胞后，对细胞增殖进行了定量。将细胞以5000个细胞/孔接种，并在48小时后处理。暴露测试试剂72小时，并通过CellTitre-96测定法(Promega)测量细胞增殖。每个点是平均值±SD。1％DMSO(对于GSI-1)的载体溶液对细胞没有影响(Abs＝0.85)。未经处理的对照Abs＝0.89。单向方差分析用于统计比较。使用单向方差分析测试，在经Syntana-4处理的细胞中显示出增殖受到显著抑制(图18)。
序列表
<110> 阿纳斯塔西斯生物技术有限公司
<120> 肽结合物
<130> N411490GB
<150> GB 1713700.1
<151> 2017-08-25
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 同源结构域共有序列
<400> 1
Arg Arg Arg Lys Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Tyr Gln Leu Leu Glu Leu
1 5 10 15
Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile
20 25 30
Glu Leu Ala His Ser Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile Trp
35 40 45
Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
50 55 60
<210> 2
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 触角足同源结构域的氨基酸序列
<400> 2
Arg Lys Arg Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu
1 5 10 15
Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile
20 25 30
Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp
35 40 45
Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn
50 55 60
<210> 3
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 具有保守取代的触角足同源结构域的氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(38)
<223> 其中 X 是 K 或 R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> 其中 X 是 A, C, G 或 S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(60)
<223> 其中 X 是 R 或 K
<400> 3
Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Gln Thr Tyr Thr Xaa Tyr Gln Thr Leu Glu Leu
1 5 10 15
Glu Xaa Glu Phe His Phe Asn Xaa Tyr Leu Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Ile
20 25 30
Glu Ile Ala His Ala Leu Xaa Leu Thr Glu Xaa Gln Ile Xaa Ile Trp
35 40 45
Phe Gln Asn Xaa Xaa Met Xaa Trp Xaa Xaa Glu Asn
50 55 60
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 穿透肽
<400> 4
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 穿透肽变体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 其中 X 是 R 或 K
<400> 5
Xaa Gln Ile Xaa Ile Trp Phe Gln Asn Xaa Xaa Met Xaa Trp Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 6
<211> 1016
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 6
Met Val Leu Pro Thr Cys Pro Met Ala Glu Phe Ala Leu Pro Arg His
1 5 10 15
Ser Ala Val Met Glu Arg Leu Arg Arg Arg Ile Glu Leu Cys Arg Arg
20 25 30
His His Ser Thr Cys Glu Ala Arg Tyr Glu Ala Val Ser Pro Glu Arg
35 40 45
Leu Glu Leu Glu Arg Gln His Thr Phe Ala Leu His Gln Arg Cys Ile
50 55 60
Gln Ala Lys Ala Lys Arg Ala Gly Lys His Arg Gln Pro Pro Ala Ala
65 70 75 80
Thr Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Arg Leu Asp Ala Ala Asp
85 90 95
Gly Pro Glu His Gly Arg Pro Ala Thr His Leu His Asp Thr Val Lys
100 105 110
Arg Asn Leu Asp Ser Ala Thr Ser Pro Gln Asn Gly Asp Gln Gln Asn
115 120 125
Gly Tyr Gly Asp Leu Phe Pro Gly His Lys Lys Thr Arg Arg Glu Ala
130 135 140
Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Ser Asn Gly Leu Pro Pro Ala Ser Pro
145 150 155 160
Leu Gly Gln Ser Asp Lys Pro Ser Gly Ala Asp Ala Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Lys His Ser Leu Gly Leu Asp Ser Leu Asn Lys Lys Arg Leu Ala
180 185 190
Asp Ser Ser Leu His Leu Asn Gly Gly Ser Asn Pro Ser Glu Ser Phe
195 200 205
Pro Leu Ser Leu Asn Lys Glu Leu Lys Gln Glu Pro Val Glu Asp Leu
210 215 220
Pro Cys Met Ile Thr Gly Thr Val Gly Ser Ile Ser Gln Ser Asn Leu
225 230 235 240
Met Pro Asp Leu Asn Leu Asn Glu Gln Glu Trp Lys Glu Leu Ile Glu
245 250 255
Glu Leu Asn Arg Ser Val Pro Asp Glu Asp Met Lys Asp Leu Phe Asn
260 265 270
Glu Asp Phe Glu Glu Lys Lys Asp Pro Glu Ser Ser Gly Ser Ala Thr
275 280 285
Gln Thr Pro Leu Ala Gln Asp Ile Asn Ile Lys Thr Glu Phe Ser Pro
290 295 300
Ala Ala Phe Glu Gln Glu Gln Leu Gly Ser Pro Gln Val Arg Ala Gly
305 310 315 320
Ser Ala Gly Gln Thr Phe Leu Gly Pro Ser Ser Ala Pro Val Ser Thr
325 330 335
Asp Ser Pro Ser Leu Gly Gly Ser Gln Thr Leu Phe His Thr Ser Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Ala Asp Asn Pro Ser Pro Asn Leu Met Pro Ala Ser Ala
355 360 365
Gln Ala Gln Asn Ala Gln Arg Ala Leu Ala Gly Val Val Leu Pro Ser
370 375 380
Gln Gly Pro Gly Gly Ala Ser Glu Leu Ser Ser Ala His Gln Leu Gln
385 390 395 400
Gln Ile Ala Ala Lys Gln Lys Arg Glu Gln Met Leu Gln Asn Pro Gln
405 410 415
Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gly Gln Met Ser Thr Trp Gln Gln
420 425 430
Thr Gly Pro Ser His Ser Ser Leu Asp Val Pro Tyr Pro Met Glu Lys
435 440 445
Pro Ala Ser Pro Ser Ser Tyr Lys Gln Asp Phe Thr Asn Ser Lys Leu
450 455 460
Leu Met Met Pro Ser Val Asn Lys Ser Ser Pro Arg Pro Gly Gly Pro
465 470 475 480
Tyr Leu Gln Pro Ser His Val Asn Leu Leu Ser His Gln Pro Pro Ser
485 490 495
Asn Leu Asn Gln Asn Ser Ala Asn Asn Gln Gly Ser Val Leu Asp Tyr
500 505 510
Gly Asn Thr Lys Pro Leu Ser His Tyr Lys Ala Asp Cys Gly Gln Gly
515 520 525
Ser Pro Gly Ser Gly Gln Ser Lys Pro Ala Leu Met Ala Tyr Leu Pro
530 535 540
Gln Gln Leu Ser His Ile Ser His Glu Gln Asn Ser Leu Phe Leu Met
545 550 555 560
Lys Pro Lys Pro Gly Asn Met Pro Phe Arg Ser Leu Val Pro Pro Gly
565 570 575
Gln Glu Gln Asn Pro Ser Ser Val Pro Val Gln Ala Gln Ala Thr Ser
580 585 590
Val Gly Thr Gln Pro Pro Ala Val Ser Val Ala Ser Ser His Asn Ser
595 600 605
Ser Pro Tyr Leu Ser Ser Gln Gln Gln Ala Ala Val Met Lys Gln His
610 615 620
Gln Leu Leu Leu Asp Gln Gln Lys Gln Arg Glu Gln Gln Gln Lys His
625 630 635 640
Leu Gln Gln Gln Gln Phe Leu Gln Arg Gln Gln His Leu Leu Ala Glu
645 650 655
Gln Glu Lys Gln Gln Phe Gln Arg His Leu Thr Arg Pro Pro Pro Gln
660 665 670
Tyr Gln Asp Pro Thr Gln Gly Ser Phe Pro Gln Gln Val Gly Gln Phe
675 680 685
Thr Gly Ser Ser Ala Ala Val Pro Gly Met Asn Thr Leu Gly Pro Ser
690 695 700
Asn Ser Ser Cys Pro Arg Val Phe Pro Gln Ala Gly Asn Leu Met Pro
705 710 715 720
Met Gly Pro Gly His Ala Ser Val Ser Ser Leu Pro Thr Asn Ser Gly
725 730 735
Gln Gln Asp Arg Gly Val Ala Gln Phe Pro Gly Ser Gln Asn Met Pro
740 745 750
Gln Ser Ser Leu Tyr Gly Met Ala Ser Gly Ile Thr Gln Ile Val Ala
755 760 765
Gln Pro Pro Pro Gln Ala Thr Asn Gly His Ala His Ile Pro Arg Gln
770 775 780
Thr Asn Val Gly Gln Asn Thr Ser Val Ser Ala Ala Tyr Gly Gln Asn
785 790 795 800
Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gln Gln His Asn Lys Gly Thr Leu
805 810 815
Asn Pro Gly Leu Thr Lys Pro Pro Val Pro Arg Val Ser Pro Ala Met
820 825 830
Gly Gly Gln Asn Ser Ser Trp Gln His Gln Gly Met Pro Asn Leu Ser
835 840 845
Gly Gln Thr Pro Gly Asn Ser Asn Val Ser Pro Phe Thr Ala Ala Ser
850 855 860
Ser Phe His Met Gln Gln Gln Ala His Leu Lys Met Ser Ser Pro Gln
865 870 875 880
Phe Ser Gln Ala Val Pro Asn Arg Pro Met Ala Pro Met Ser Ser Ala
885 890 895
Ala Ala Val Gly Ser Leu Leu Pro Pro Val Ser Ala Gln Gln Arg Thr
900 905 910
Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Thr Ala Pro Gln Gln Gly Leu
915 920 925
Pro Gly Leu Ser Pro Ala Gly Pro Glu Leu Gly Ala Phe Ser Gln Ser
930 935 940
Pro Ala Ser Gln Met Gly Gly Arg Ala Gly Leu His Cys Thr Gln Ala
945 950 955 960
Tyr Pro Val Arg Thr Ala Gly Gln Glu Leu Pro Phe Ala Tyr Ser Gly
965 970 975
Gln Pro Gly Gly Ser Gly Leu Ser Ser Val Ala Gly His Thr Asp Leu
980 985 990
Ile Asp Ser Leu Leu Lys Asn Arg Thr Ser Glu Glu Trp Met Ser Asp
995 1000 1005
Leu Asp Asp Leu Leu Gly Ser Gln
1010 1015
<210> 7
<211> 1096
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 7
Gly Arg Ala Glu Ser Ser Asp Arg Glu Arg Glu Ser Thr Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Val Gln His Gly Gln Gly Ala Arg Lys Ala Gly Lys His
20 25 30
Thr Lys Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ser Gln Ala Ala Ala Thr Ala Ala Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro Asp Tyr His His His His Gln Gln His Leu Leu Asn
65 70 75 80
Ser Ser Asn Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ile Asn Gly Glu Gln Gln Pro
85 90 95
Pro Ala Ser Thr Pro Gly Asp Gln Arg Asn Ser Ala Leu Ile Ala Leu
100 105 110
Gln Gly Ser Leu Lys Arg Lys Gln Val Val Asn Leu Ser Pro Ala Asn
115 120 125
Ser Lys Arg Pro Asn Gly Phe Val Asp Asn Ser Phe Leu Asp Ile Lys
130 135 140
Arg Ile Arg Val Gly Glu Asn Leu Ser Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gln
145 150 155 160
Ile Asn Asn Gly Gln Ser Gln Ile Met Ser Gly Thr Leu Pro Met Ser
165 170 175
Gln Ala Pro Leu Arg Lys Thr Asn Thr Leu Pro Ser His Thr His Ser
180 185 190
Pro Gly Asn Gly Leu Phe Asn Met Gly Leu Lys Glu Val Lys Lys Glu
195 200 205
Pro Gly Glu Thr Leu Ser Cys Ser Lys His Met Asp Gly Gln Met Thr
210 215 220
Gln Glu Asn Ile Phe Pro Asn Arg Tyr Gly Asp Asp Pro Gly Glu Gln
225 230 235 240
Leu Met Asp Pro Glu Leu Gln Glu Leu Phe Asn Glu Leu Thr Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Pro Met Ser Asp Leu Glu Leu Glu Asn Met Ile Asn Ala
260 265 270
Thr Ile Lys Gln Asp Asp Pro Phe Asn Ile Asp Leu Gly Gln Gln Ser
275 280 285
Gln Arg Ser Thr Pro Arg Pro Ser Leu Pro Met Glu Lys Ile Val Ile
290 295 300
Lys Ser Glu Tyr Ser Pro Gly Leu Thr Gln Gly Pro Ser Gly Ser Pro
305 310 315 320
Gln Leu Arg Pro Pro Ser Ala Gly Pro Ala Phe Ser Met Ala Asn Ser
325 330 335
Ala Leu Ser Thr Ser Ser Pro Ile Pro Ser Val Pro Gln Ser Gln Ala
340 345 350
Gln Pro Gln Thr Gly Ser Gly Ala Ser Arg Ala Leu Pro Ser Trp Gln
355 360 365
Glu Val Ser His Ala Gln Gln Leu Lys Gln Ile Ala Ala Asn Arg Gln
370 375 380
Gln His Ala Arg Met Gln Gln His Gln Gln Gln His Gln Pro Thr Asn
385 390 395 400
Trp Ser Ala Leu Pro Ser Ser Ala Gly Pro Ser Pro Gly Pro Phe Gly
405 410 415
Gln Glu Lys Ile Pro Ser Pro Ser Phe Gly Gln Gln Thr Phe Ser Pro
420 425 430
Gln Ser Ser Pro Met Pro Gly Val Ala Gly Gly Ser Gly Gln Ser Lys
435 440 445
Val Met Ala Asn Tyr Met Tyr Lys Ala Gly Pro Ser Ala Gln Gly Gly
450 455 460
His Leu Asp Val Leu Met Gln Gln Lys Pro Gln Asp Leu Ser Arg Ser
465 470 475 480
Phe Ile Asn Asn Pro His Pro Ala Met Glu Pro Arg Gln Gly Asn Thr
485 490 495
Lys Pro Leu Phe His Phe Asn Ser Asp Gln Ala Asn Gln Gln Met Pro
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Ser Val Leu Pro Ser Gln Asn Lys Pro Ser Leu Leu His Tyr Thr Gln
515 520 525
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
530 535 540
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
545 550 555 560
Gln Ser Ser Ile Ser Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Ser Ile
565 570 575
Ser Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
580 585 590
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ser Ser
595 600 605
Gln Pro Ala Gln Ser Leu Pro Ser Gln Pro Leu Leu Arg Ser Pro Leu
610 615 620
Pro Leu Gln Gln Lys Leu Leu Leu Gln Gln Met Gln Asn Gln Pro Ile
625 630 635 640
Ala Gly Met Gly Tyr Gln Val Ser Gln Gln Gln Arg Gln Asp Gln His
645 650 655
Ser Val Val Gly Gln Asn Thr Gly Pro Ser Pro Ser Pro Asn Pro Cys
660 665 670
Ser Asn Pro Asn Thr Gly Ser Gly Tyr Met Asn Ser Gln Gln Ser Leu
675 680 685
Leu Asn Gln Gln Leu Met Gly Lys Lys Gln Thr Leu Gln Arg Gln Ile
690 695 700
Met Glu Gln Lys Gln Gln Leu Leu Leu Gln Gln Gln Met Leu Ala Asp
705 710 715 720
Ala Glu Lys Ile Ala Pro Gln Asp Gln Ile Asn Arg His Leu Ser Arg
725 730 735
Pro Pro Pro Asp Tyr Lys Asp Gln Arg Arg Asn Val Gly Asn Met Gln
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Pro Thr Ala Gln Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ile Ser Leu Asn Ser
755 760 765
Asn Gln Ala Leu Ala Asn Pro Val Ser Thr His Thr Ile Leu Thr Pro
770 775 780
Asn Ser Ser Leu Leu Ser Thr Ser His Gly Thr Arg Met Pro Ser Leu
785 790 795 800
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805 810 815
Gln Pro Asn Thr Tyr Ser Val Thr Ser Gly Met Asn Gln Leu Thr Gln
820 825 830
Gln Arg Asn Pro Lys Gln Leu Leu Ala Asn Gln Asn Asn Pro Met Met
835 840 845
Pro Arg Pro Pro Thr Leu Gly Pro Ser Asn Asn Asn Asn Val Ala Thr
850 855 860
Phe Gly Ala Gly Ser Val Gly Asn Ser Gln Gln Leu Arg Pro Asn Leu
865 870 875 880
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885 890 895
Ile Thr Ser Asn Thr Thr Ala Pro Asn Trp Ala Ser Gln Glu Gly Thr
900 905 910
Ser Lys Gln Gln Glu Ala Leu Thr Ser Ala Gly Val Arg Phe Pro Thr
915 920 925
Gly Thr Pro Ala Ala Tyr Thr Pro Asn Gln Ser Leu Gln Gln Ala Val
930 935 940
Gly Ser Gln Gln Phe Ser Gln Arg Ala Val Ala Pro Pro Asn Gln Leu
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
Gln Leu Ser Thr Gln Ile Leu Pro Asn Leu Asn Gln Ser Gly Thr Gly
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Gln Asn Asp Asn Met Gly Pro Ala Leu Asn Ser Asp Ala Asp Phe
1055 1060 1065
Ile Asp Ser Leu Leu Lys Thr Glu Pro Gly Asn Asp Asp Trp Met
1070 1075 1080
Lys Asp Ile Asn Leu Asp Glu Ile Leu Gly Asn Asn Ser
1085 1090 1095
<210> 8
<211> 1133
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 8
Met Gly Asp Phe Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Asn Gly Ser Ser Ile
1 5 10 15
Cys Ile Asn Ser Ser Leu Asn Ser Ser Leu Gly Gly Ala Gly Ile Gly
20 25 30
Val Asn Asn Thr Pro Asn Ser Thr Pro Ala Ala Pro Ser Ser Asn His
35 40 45
Pro Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Val Pro Lys His Ser Thr Val Val Glu Arg Leu Arg Gln Arg
65 70 75 80
Ile Glu Gly Cys Arg Arg His His Val Asn Cys Glu Asn Arg Tyr Gln
85 90 95
Gln Ala Gln Val Glu Gln Leu Glu Leu Glu Arg Arg Asp Thr Val Ser
100 105 110
Leu Tyr Gln Arg Thr Leu Glu Gln Arg Ala Lys Lys Ser Gly Ala Gly
115 120 125
Thr Gly Lys Gln Gln His Pro Ser Lys Pro Gln Gln Asp Ala Glu Ala
130 135 140
Ala Ser Ala Glu Gln Arg Asn His Thr Leu Ile Met Leu Gln Glu Thr
145 150 155 160
Val Lys Arg Lys Leu Glu Gly Ala Arg Ser Pro Leu Asn Gly Asp Gln
165 170 175
Gln Asn Gly Ala Cys Asp Gly Asn Phe Ser Pro Thr Ser Lys Arg Ile
180 185 190
Arg Lys Asp Ile Ser Ala Gly Met Glu Ala Ile Asn Asn Leu Pro Ser
195 200 205
Asn Met Pro Leu Pro Ser Ala Ser Pro Leu His Gln Leu Asp Leu Lys
210 215 220
Pro Ser Leu Pro Leu Gln Asn Ser Gly Thr His Thr Pro Gly Leu Leu
225 230 235 240
Glu Asp Leu Ser Lys Asn Gly Arg Leu Pro Glu Ile Lys Leu Pro Val
245 250 255
Asn Gly Cys Ser Asp Leu Glu Asp Ser Phe Thr Ile Leu Gln Ser Lys
260 265 270
Asp Leu Lys Gln Glu Pro Leu Asp Asp Pro Thr Cys Ile Asp Thr Ser
275 280 285
Glu Thr Ser Leu Ser Asn Gln Asn Lys Leu Phe Ser Asp Ile Asn Leu
290 295 300
Asn Asp Gln Glu Trp Gln Glu Leu Ile Asp Glu Leu Ala Asn Thr Val
305 310 315 320
Pro Glu Asp Asp Ile Gln Asp Leu Phe Asn Glu Asp Phe Glu Glu Lys
325 330 335
Lys Glu Pro Glu Phe Ser Gln Pro Ala Thr Glu Thr Pro Leu Ser Gln
340 345 350
Glu Ser Ala Ser Val Lys Ser Asp Pro Ser His Ser Pro Phe Ala His
355 360 365
Val Ser Met Gly Ser Pro Gln Ala Arg Pro Ser Ser Ser Gly Pro Pro
370 375 380
Phe Ser Thr Val Ser Thr Ala Thr Ser Leu Pro Ser Val Ala Ser Thr
385 390 395 400
Pro Ala Ala Pro Asn Pro Ala Ser Ser Pro Ala Asn Cys Ala Val Gln
405 410 415
Ser Pro Gln Thr Pro Asn Gln Ala His Thr Pro Gly Gln Ala Pro Pro
420 425 430
Arg Pro Gly Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Pro Ala Ala Val Thr Val Ala
435 440 445
Gly Ser Ala Ser Gly Pro Val Ala Val Pro Ser Ser Asp Met Ser Pro
450 455 460
Ala Glu Gln Leu Lys Gln Met Ala Ala Gln Gln Gln Gln Arg Ala Lys
465 470 475 480
Leu Met Gln Gln Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
485 490 495
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Ser Asn Gln Thr Ser
500 505 510
Asn Trp Ser Pro Leu Gly Pro Pro Ser Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Phe
515 520 525
Thr Ala Glu Lys Pro Asn Ser Pro Met Met Tyr Pro Gln Ala Phe Asn
530 535 540
Asn Gln Asn Pro Ile Val Pro Pro Met Ala Asn Asn Leu Gln Lys Thr
545 550 555 560
Thr Met Asn Asn Tyr Leu Pro Gln Asn His Met Asn Met Ile Asn Gln
565 570 575
Gln Pro Asn Asn Leu Gly Thr Asn Ser Leu Asn Lys Gln His Asn Ile
580 585 590
Leu Thr Tyr Gly Asn Thr Lys Pro Leu Thr His Phe Asn Ala Asp Leu
595 600 605
Ser Gln Arg Met Thr Pro Pro Val Ala Asn Pro Asn Lys Asn Pro Leu
610 615 620
Met Pro Tyr Ile Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
625 630 635 640
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Gln Leu Gln Ala Pro Arg
645 650 655
Ala His Leu Ser Glu Asp Gln Lys Arg Leu Leu Leu Met Lys Gln Lys
660 665 670
Gly Val Met Asn Gln Pro Met Ala Tyr Ala Ala Leu Pro Ser His Gly
675 680 685
Gln Glu Gln His Pro Val Gly Leu Pro Arg Thr Thr Gly Pro Met Gln
690 695 700
Ser Ser Val Pro Pro Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Gly Ala Ser Pro
705 710 715 720
Ala Gly Pro Gly Phe Leu Gly Ser Gln Pro Gln Ala Ala Ile Met Lys
725 730 735
Gln Met Leu Ile Asp Gln Arg Ala Gln Leu Ile Glu Gln Gln Lys Gln
740 745 750
Gln Phe Leu Arg Glu Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ile
755 760 765
Leu Ala Glu Gln Gln Leu Gln Gln Ser His Leu Pro Arg Gln His Leu
770 775 780
Gln Pro Gln Arg Asn Pro Tyr Pro Val Gln Gln Val Asn Gln Phe Gln
785 790 795 800
Gly Ser Pro Gln Asp Ile Ala Ala Val Arg Ser Gln Ala Ala Leu Gln
805 810 815
Ser Met Arg Thr Ser Arg Leu Met Ala Gln Asn Ala Gly Met Met Gly
820 825 830
Ile Gly Pro Ser Gln Asn Pro Gly Thr Met Ala Thr Ala Ala Ala Gln
835 840 845
Ser Glu Met Gly Leu Ala Pro Tyr Ser Thr Thr Pro Thr Ser Gln Pro
850 855 860
Gly Met Tyr Asn Met Ser Thr Gly Met Thr Gln Met Leu Gln His Pro
865 870 875 880
Asn Gln Ser Gly Met Ser Ile Thr His Asn Gln Ala Gln Gly Pro Arg
885 890 895
Gln Pro Ala Ser Gly Gln Gly Val Gly Met Val Ser Gly Phe Gly Gln
900 905 910
Ser Met Leu Val Asn Ser Ala Ile Thr Gln Gln His Pro Gln Met Lys
915 920 925
Gly Pro Val Gly Gln Ala Leu Pro Arg Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu
930 935 940
Gln Ser Leu Met Gly Thr Val Gln Gln Gly Ala Gln Ser Trp Gln Gln
945 950 955 960
Arg Ser Leu Gln Gly Met Pro Gly Arg Thr Ser Gly Glu Leu Gly Pro
965 970 975
Phe Asn Asn Gly Ala Ser Tyr Pro Leu Gln Ala Gly Gln Pro Arg Leu
980 985 990
Thr Lys Gln His Phe Pro Gln Gly Leu Ser Gln Ser Val Val Asp Ala
995 1000 1005
Asn Thr Gly Thr Val Arg Thr Leu Asn Pro Ala Ala Met Gly Arg
1010 1015 1020
Gln Met Met Pro Ser Leu Pro Gly Gln Gln Gly Thr Ser Gln Ala
1025 1030 1035
Arg Pro Met Val Met Ser Gly Leu Ser Gln Gly Val Pro Gly Met
1040 1045 1050
Pro Ala Phe Ser Gln Pro Pro Ala Gln Gln Gln Ile Pro Ser Gly
1055 1060 1065
Ser Phe Ala Pro Ser Ser Gln Ser Gln Ala Tyr Glu Arg Asn Ala
1070 1075 1080
Pro Gln Asp Val Ser Tyr Asn Tyr Ser Gly Asp Gly Ala Gly Gly
1085 1090 1095
Ser Phe Pro Gly Leu Pro Asp Gly Ala Asp Leu Val Asp Ser Ile
1100 1105 1110
Ile Lys Gly Gly Pro Gly Asp Glu Trp Met Gln Glu Leu Asp Glu
1115 1120 1125
Leu Phe Gly Asn Pro
1130
<210> 9
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> dnMAML(13-74)
<400> 9
Leu Pro Arg His Ser Ala Val Met Glu Arg Leu Arg Arg Arg Ile Glu
1 5 10 15
Leu Cys Arg Arg His His Ser Thr Cys Glu Ala Arg Tyr Glu Ala Val
20 25 30
Ser Pro Glu Arg Leu Glu Leu Glu Arg Gln His Thr Phe Ala Leu His
35 40 45
Gln Arg Cys Ile Gln Ala Lys Ala Lys Arg Ala Gly Lys His
50 55 60
<210> 10
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ANTP-dnMAML结合物
<400> 10
Arg Lys Arg Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu
1 5 10 15
Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile
20 25 30
Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp
35 40 45
Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Met
50 55 60
Ala Leu Pro Arg His Ser Ala Val Met Glu Arg Leu Arg Arg Arg Ile
65 70 75 80
Glu Leu Cys Arg Arg His His Ser Thr Cys Glu Ala Arg Tyr Glu Ala
85 90 95
Val Ser Pro Glu Arg Leu Glu Leu Glu Arg Gln His Thr Phe Ala Leu
100 105 110
His Gln Arg Cys Ile Gln Ala Lys Ala Lys Arg Ala Gly Lys His
115 120 125
<210> 11
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 穿透肽-dnMAML结合物
<400> 11
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Glu Asn Gly Glu Phe Met Ala Leu Pro Arg His Ser Ala Val Met Glu
20 25 30
Arg Leu Arg Arg Arg Ile Glu Leu Cys Arg Arg His His Ser Thr Cys
35 40 45
Glu Ala Arg Tyr Glu Ala Val Ser Pro Glu Arg Leu Glu Leu Glu Arg
50 55 60
Gln His Thr Phe Ala Leu His Gln Arg Cys Ile Gln Ala Lys Ala Lys
65 70 75 80
Arg Ala Gly Lys His
85
<210> 12
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> His-ANTP-dnMAML结合物 (Syntana-4)
<400> 12
Met His His His His His His Gly Ser Arg Lys Arg Gly Arg Gln Thr
1 5 10 15
Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His Phe Asn
20 25 30
Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala Leu Cys
35 40 45
Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys
50 55 60
Trp Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Met Ala Leu Pro Arg His Ser Ala
65 70 75 80
Val Met Glu Arg Leu Arg Arg Arg Ile Glu Leu Cys Arg Arg His His
85 90 95
Ser Thr Cys Glu Ala Arg Tyr Glu Ala Val Ser Pro Glu Arg Leu Glu
100 105 110
Leu Glu Arg Gln His Thr Phe Ala Leu His Gln Arg Cys Ile Gln Ala
115 120 125
Lys Ala Lys Arg Ala Gly Lys His
130 135
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-TAT
<400> 13
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln
1 5 10
<210> 14
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MPG
<400> 14
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PEP-1
<400> 15
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Cys
20
<210> 16
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EB1
<400> 16
Leu Ile Lys Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg
1 5 10 15
Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys
20
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 转运蛋白
<400> 17
Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hCT(18-32)
<400> 18
Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
1 5 10 15
<210> 19
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> KLA
<400> 19
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AGR
<400> 20
Cys Ala Gly Arg Arg Ser Ala Tyr Cys
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LyP-2
<400> 21
Cys Asn Arg Arg Thr Lys Ala Gly Cys
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> REA
<400> 22
Cys Arg Glu Ala Gly Arg Lys Ala Cys
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LSD
<400> 23
Cys Leu Ser Asp Gly Lys Arg Lys Cys
1 5
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HN-1
<400> 24
Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu
1 5 10
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTP
<400> 25
Ala Pro Trp His Leu Ser Ser Gln Tyr Ser Arg Thr
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HAP-1
<400> 26
Ser Phe His Gln Phe Ala Arg Ala Thr Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 239P-1
<400> 27
Ser Asn Asn Asn Val Arg Pro Ile His Ile Trp Pro
1 5 10
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接肽
<400> 28
Gly Glu Phe Met Ala
1 5

Claims (24)

1.一种肽结合物，包含：
a.第一区域，其包含SEQ ID NO:4的细胞穿透肽或与其具有至少80％序列同一性的同源物；结合到
b.第二区域，所述第二区域包含肽，所述肽为Notch信号通路的抑制剂并且具有SEQ IDNO:9序列，或包括与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性的同源物；和
c.在所述第一和所述第二区域之间的连接肽，其长度为2至10个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的结合物，其中所述肽结合物的总长度不超过190个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的结合物，所述第一区域包含SEQ ID NO:2的细胞穿透肽，或包括与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的同源物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的结合物，其中所述第一区域是SEQ ID NO:2或SEQID NO:3。
5.根据权利要求4所述的结合物，其中所述第一区域是SEQ ID NO:2。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的结合物，其中所述第二区域是SEQ ID NO:9或根据以下序列的变体：
LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEARYEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH
且其中带下划线的残基是保守的，并且零个、一个、两个、三个、四个、五个或至多15个其他残基被保守取代替换。
7.根据权利要求6所述的结合物，其中所述第二区域是SEQ ID NO:9。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的结合物，其中所述连接肽为2至7个氨基酸长度。
9.根据权利要求7所述的结合物，其中所述连接肽包含选自G、E、F、M或A的氨基酸。
10.根据权利要求9所述的结合物，其中所述连接肽是GEFMA。
11.根据权利要求1所述的结合物，其包含SEQ ID NO:10。
12.根据权利要求1所述的结合物，其包含SEQ ID NO:12。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的结合物和药学上可接受的载体。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述结合物的浓度为1-50mg/mL。
15.权利要求1-12中任一项所述的结合物或权利要求13或14所述的组合物在通过疗法治疗人或动物体的方法中的应用。
16.根据权利要求15所述的结合物或药物组合物的应用，所述应用为所述结合物或药物组合物在治疗癌症或抑制在癌症干细胞或祖细胞中Notch信号通路的方法中的应用。
17.根据权利要求15或16所述的结合物或药物组合物的应用，其中给药至接受治疗的受试者的所述结合物的浓度为1-50mg/mL。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的结合物或药物组合物的应用，其中所述结合物或组合物是经皮下给药的。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的结合物或药物组合物的应用，其中所述结合物配制成包含1mg-200mg的所述结合物的单位剂量。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的结合物或药物组合物的应用，其中所述方法包括将所述结合物或组合物与化疗药物共同给药或相继给药。
21.根据权利要求1-12中任一项所述的结合物或根据权利要求13或14所述的药物组合物在制造用于治疗癌症或抑制癌症干细胞或祖细胞中的Notch信号通路的药物中的应用。
22.一种治疗癌症或抑制在癌症干细胞或前体细胞中Notch信号通路的方法，其包括向有此需要的受试者给药根据权利要求1至12中任一项所述的结合物或根据权利要求13或14所述的药物组合物。
23.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的结合物或根据权利要求13或14所述的药物组合物，以及一种或多种适合同时给药、相继给药或单独给药的其他治疗剂。
24.一种使用固相肽合成方法制备如权利要求1-12中任一项所定义的肽结合物的方法。
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