CN111504965A - 一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法，其包括烟气冷凝物制备、免疫荧光标记、样品处理和检测步骤。本发明的检测方法中的操作步骤简单、便捷，检测周期短，仅需数小时即可完成检测，极大地缩短了检测周期，有利于加快相关研究的进度，节省了时间成本。本发明通过研究烟气暴露后细胞内的活性氧浓度水平，用于评估烟气暴露对细胞的氧化应激反应的影响，对烟气成分的安全性进行生物学评价，反向为安全卷烟的研发和生产提供科学参考。
Description
技术领域
本发明属于细胞内活性氧的生化分析技术领域，涉及一种细胞内超氧化物的检测方法，尤其涉及一种利用流式细胞仪检测氧自由基、活性氧的方法。
背景技术
超氧化物是含有超氧离子(O2-)的一类化合物，是氧气分子的单电子还原产物，广泛存在于自然界中。超氧离子是一个自由基，一个氧原子带有一个未成对电子，与氧气分子一样呈顺磁性。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是一类具有高化学活性的小分子基团，包括了羟基自由基、氮氧自由基、烷氧自由基和过氧化物等，细胞内过高的活性氧水平能够对细胞膜、功能蛋白以及核酸造成损伤，并可能进一步导致疾病的发生。卷烟烟气是一种重要的人居环境污染物，被证明含有大量活性氧，主要包括气相部分的烷氧自由基、氮氧自由基以及粒相部分的芳香烃自由基、醌基自由基等，这些活性氧分子进入生物体内能够影响细胞内的氧化应激反应，并最终对DNA产生不可逆的氧化损伤。
目前对活性氧的分析检测方法主要有化学发光法、紫外-可见吸收分光光度法、荧光光度法、电子自旋探针以及电化学分析等方法，其中荧光分析法由于具有高选择性、高灵敏度、以及能对活性氧物种进行实时跟踪等优点，已在生命科学、食品科学、环境科学等领域得到了广泛应用。性能优良的荧光探针是构筑相应荧光分析方法的基础。近年来，随着合成技术的不断提高，一系列具有发射波长长、光稳定性好、量子产率高的有机荧光分析被开发出来并用于细胞内活性氧物质的分析。
吸烟引起基因损伤、蛋白异常表达、外源性化合物代谢异常等多个生理反应，表观反映是多个生物效应的发生，如氧化应激、炎症反应、外源物质代谢异常等。发明人希望通过研究烟气暴露后细胞内的活性氧浓度水平，用于评估烟气暴露对细胞的氧化应激反应的影响，对烟气成分的安全性进行生物学评价，反向为安全卷烟的研发和生产提供科学参考。目前，还未有相关的研究。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种能够准确测量烟气影响下的细胞内超氧化物的检测方法。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法，其包括如下步骤：
步骤1)烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用吸烟机抽吸，收集烟气总粒相物，根据烟气总粒相物的质量加入相应体积的DMSO，得到烟气总粒相物储备液；
步骤2)免疫荧光标记：细胞铺板，过夜培养；更换含有超氧自由基检测荧光探针和过氧化氢检测荧光探针的细胞培养基继续培养，再添加步骤1)所述烟气冷凝物的细胞培养基继续培养；
步骤3)样品处理：将步骤2)培养获得的细胞使用PBS洗涤，加入70％乙醇溶液进行固定，低温过夜；使用PBS洗涤后，使用含有triton-100的PBS溶液透化，PBS清洗；加入胰酶消化，用培养基终止消化；分离出细胞并重新分散，待流式细胞仪测定；
步骤4)检测：使用流式细胞仪检测对荧光探针的染色强度进行检测，检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，用于将异常细胞群与正常细胞群分开，将异常细胞群圈出设门后，每份样品捕获分析上万个细胞。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述吸烟机抽吸用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述步骤1)中，用
剑桥滤片收集烟气总粒相物。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述步骤1)中，烟气总粒相物储备液浓度为10mg/mL。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述步骤2)中，铺板细胞密度为2.5×105cells/mL。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述步骤2)中，分离细胞的具体方式为，终止消化后，加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3-5次。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述步骤4)中，使用流式细胞仪检测在488nm和530nm条件下对荧光探针的染色强度进行检测。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述步骤2)具体为：细胞密度为2.5×105cells/mL进行铺板，过夜培养；更换含有浓度为50μM的超氧自由基检测荧光探针和过氧化氢检测荧光探针的细胞培养基继续培养一个小时，之后分别添加60μg/mL的烟气冷凝物的细胞培养基进行细胞培养1小时。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述步骤3)具体为：将步骤2)培养的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟；加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜；使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-X100的PBS溶液透化10min，再PBS清洗三次；加入胰酶消化，使用培养基终止消化；加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3次，重新分散待流式细胞仪测定。
根据本发明流式细胞仪检测人口腔表皮样细胞内氧自由基的方法的一个优选实施方式，所述步骤4)中流式细胞仪的检测条件为488nm和530nm。
本发明的检测方法中的操作步骤简单、便捷，检测周期短，仅需数小时即可完成检测，极大地缩短了检测周期，有利于加快相关研究的进度，节省了时间成本。
附图说明
图1为利用流式细胞仪检测不同抽吸模式得到的烟气冷凝物刺激下O2-在口腔细胞表面表达的结果图。
图2为利用流式细胞仪检测不同抽吸模式得到的烟气冷凝物刺激下H2O2在口腔细胞表面表达的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。除非另有说明，下列实施例中所使用的药品、试剂、仪器均可通过商业手段获得。
实施例一
采用流式细胞仪检测不同抽吸模式的烟气冷凝物暴露下细胞内O2-水平。
烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸，TPM用
剑桥滤片收集，根据TPM的质量加入相应体积的DMSO，得到最终浓度为10mg/mL的TPM储备液。
细胞培养及处理：人口腔表皮样细胞培养于含10％胎牛血清的a-MEM完全培养基中，在37℃，5％CO2条件下培养。当细胞汇合率为70％～80％时，用胰酶消解，培养基重悬制成单细胞悬液，调节细胞浓度至2.5×105个/mL，按每孔100μL接种到96孔板，过夜培养。然后加入50μM的荧光探针(BES-So-AM和BES-H2O2-Ac)培养1个小时，之后加入含有60μg/mL烟气冷凝物染毒培养1个小时。
染毒细胞处理：染毒后的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟。加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜。使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-X100的PBS溶液透化10min，PBS清洗三次。加入胰酶消化，使用培养基终止消化。加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3次，重新分散待流式细胞仪测定。
检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，将异常细胞群圈出设门，每份样品捕获分析1×104个细胞，上流式细胞仪(BD Biosciences FACSVantage,SanJose,CA,USA)检测，完成氧自由基的检测过程。
通过流式细胞仪检测不同抽吸模式得到的烟气冷凝物刺激下O2-在口腔细胞表面表达，其结果如图1所示。从图1中可知，从流式细胞仪相位图左上方的荧光强度图可以看出从KB到ISO和HCI荧光强度分布发生了变化，右侧的高荧光强度的细胞计数逐渐增加，表明O2-的细胞内浓度水平逐渐增加。在同时计数10000个细胞的情况下，荧光强度的高低依次为ISO>HCI>KB，表明在ISO模式下细胞内的O2-的浓度维持相对较高的水平。
实施例二
采用流式细胞仪检测不同抽吸模式的烟气冷凝物暴露下细胞内H2O2水平。
烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸，TPM用
剑桥滤片收集，根据TPM的质量加入相应体积的DMSO，得到最终浓度为10mg/mL的TPM储备液。
细胞培养及处理：人口腔表皮样细胞培养于含10％胎牛血清的a-MEM完全培养基中，在37℃，5％CO2条件下培养。当细胞汇合率为70％～80％时，用胰酶消解，培养基重悬制成单细胞悬液，调节细胞浓度至2.5×105个/mL，按每孔100μL接种到96孔板，过夜培养。然后加入50μM的荧光探针(BES-So-AM和BES-H2O2-Ac)培养1个小时，之后加入含有60μg/mL烟气冷凝物染毒培养1个小时。
染毒细胞处理：染毒后的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟。加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜。使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-100的PBS溶液透化10min，PBS清洗三次。加入胰酶消化，使用培养基终止消化。加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3次，重新分散待流式细胞仪测定。
检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，将异常细胞群圈出设门，每份样品捕获分析1×104个细胞，上流式细胞仪(BD Biosciences FACSVantage,SanJose,CA,USA)检测，完成氧自由基的检测过程。
通过流式细胞仪检测不同抽吸模式得到的烟气冷凝物刺激下H2O2在口腔细胞表面表达，其结果如图2所示。从图2中可知，从流式细胞仪相位图左上方的荧光强度图可以看出从KB到ISO和HCI荧光强度分布发生了变化，右侧的高荧光强度的细胞计数逐渐增加，表明烟气冷凝物刺激后，H2O2的细胞内浓度水平增加，但是HCI与ISO的增加量没有显著性差异，表明烟气冷凝物的刺激对H2O2的浓度水平增加没有选择性。
由上述实施例可以看出，本发明的检测方法中的操作步骤简单、便捷，检测周期短，仅需数小时即可完成检测，极大地缩短了检测周期，有利于加快相关研究的进度，节省了时间成本。
本发明通过细胞内氧自由基的检测，可对烟气的安全性进行评价，指导卷烟生产方对烤烟的生产调制工艺进行调整。
Claims (10)
1.一种流式细胞仪检测细胞内超氧化物的方法，其包括如下步骤：
步骤1)烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用吸烟机抽吸，收集烟气总粒相物，根据烟气总粒相物的质量加入相应体积的DMSO，得到烟气总粒相物储备液；
步骤2)免疫荧光标记：细胞铺板，过夜培养；更换含有超氧自由基检测荧光探针和过氧化氢检测荧光探针的细胞培养基继续培养，再添加步骤1)所述烟气冷凝物的细胞培养基继续培养；
步骤3)样品处理：将步骤2)培养获得的细胞使用PBS洗涤，加入70％乙醇溶液进行固定，低温过夜；使用PBS洗涤后，使用含有triton-100的PBS溶液透化，PBS清洗；加入胰酶消化，用培养基终止消化；分离出细胞并重新分散，待流式细胞仪测定；
步骤4)检测：使用流式细胞仪检测对荧光探针的染色强度进行检测，检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，用于将异常细胞群与正常细胞群分开，将异常细胞群圈出设门后，每份样品捕获分析上万个细胞。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述吸烟机抽吸用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)中，用
剑桥滤片收集烟气总粒相物。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)中，烟气总粒相物储备液浓度为10mg/mL。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤2)中，铺板细胞密度为2.5×105cells/mL。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤2)中，分离细胞的具体方式为，终止消化后，加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3-5次。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤4)中，使用流式细胞仪检测在488nm和530nm条件下对荧光探针的染色强度进行检测。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：细胞密度为2.5×105cells/mL进行铺板，过夜培养；更换含有浓度为50μM的超氧自由基检测荧光探针和过氧化氢检测荧光探针的细胞培养基继续培养一个小时，之后分别添加60μg/mL的烟气冷凝物的细胞培养基进行细胞培养1小时。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：将步骤2)培养的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟；加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜；使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-X100的PBS溶液透化10min，再PBS清洗三次；加入胰酶消化，使用培养基终止消化；加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3次，重新分散待流式细胞仪测定。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤4)中流式细胞仪的检测条件为488nm和530nm。
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| CN105758783A (zh) * | 2016-05-05 | 2016-07-13 | 苏州大学 | 一种利用流式细胞术检测人气道胰蛋白酶样蛋白酶4的方法 |
| CN108130356A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-06-08 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种用于检测胶基型嚼烟对细胞dna损伤的方法 |
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