CN111500674A - 一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法 - Google Patents
一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111500674A CN111500674A CN202010316262.4A CN202010316262A CN111500674A CN 111500674 A CN111500674 A CN 111500674A CN 202010316262 A CN202010316262 A CN 202010316262A CN 111500674 A CN111500674 A CN 111500674A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- cathepsin
- mixed
- aphid
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 title claims abstract description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 103
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 64
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims abstract description 19
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 claims abstract description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 12
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 11
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims abstract description 11
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 19
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 9
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 6
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 claims description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 6
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 13
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 241000721621 Myzus persicae Species 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 101150086784 cry gene Proteins 0.000 description 4
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 206010011469 Crying Diseases 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- 235000015001 Cucumis melo var inodorus Nutrition 0.000 description 1
- 240000002495 Cucumis melo var. inodorus Species 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 231100001224 moderate toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
- C12N9/6405—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals not being snakes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
Abstract
本发明提供了一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法,包括将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白混合静置反应,得到混合酶液,将所述混合酶液与底物混合反应后,得到检测液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到检测值;以Cathepsin B酶活抑制剂和激活剂为对照,得到抑制检测值和激活检测值;当所述检测值大于等于激活检测值,或所述检测值小于等于抑制检测值时,所述苏云金杆菌Cry蛋白为抗蚜Cry蛋白;所述底物包括Z‑Arg‑Arg‑pNA和/或BSA;所述反应缓冲液包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。本发明提供的筛选方法检测结果精准,能够大批量测定,进而实现大规模筛选。
Description
技术领域
本发明属于苏云金杆菌技术领域,具体涉及一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法。
背景技术
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)制剂是迄今最为成功的微生物杀虫剂,已被广泛应用于农林卫生害虫的防治。苏云金杆菌产生的最主要杀虫活性物质是杀虫晶体蛋白(Cry蛋白),其编码基因已经被广泛应用于构建抗虫转基因植物,已成为抗鳞翅目和鞘翅目害虫的常规手段。但是,仍然有不少重要的农林卫生害虫,现有苏云金杆菌制剂及其Cry蛋白对其防效低下。尤其是蚜虫这类体型很小的刺吸式昆虫,其能够通过取食、蜜露污染、传播病毒等方式危害众多植物,造成植株生长迟缓、萎蔫,并诱发多种病毒病、黑霉病等,严重时可导致植株死亡,是重要的农林业害虫。当下,对蚜虫具有高效的Cry蛋白几乎没有,成为限制苏云金杆菌行业进一步做大做强的一大难题。
随着大规模分离苏云金杆菌尤其是高通量测定样品中的苏云金杆菌基因组序列的突飞猛进,当下已经实现了新型Cry蛋白的大规模发掘,一个研究团队一年的工作,即可超过过去三五十年全球所发掘的新型Cry蛋白的总和。苏云金杆菌领域,已经走到了需要对海量Cry蛋白进行系统的杀虫活性测定的阶段了,尤其是针对蚜虫进行筛选获得抗蚜Cry蛋白,成为一项巨大的挑战。
目前,针对蚜虫筛选抗蚜蛋白的生物测定方法有膜囊法、叶片浸润法和转基因植物法三种。叶片浸润法(植物叶片表面浸润蛋白后接上蚜虫在叶片上取食),由于用于生测的蛋白只能喷洒或浸泡在植物表面,而作为刺吸性昆虫的蚜虫它的进食方法决定了它对叶表面的蛋白无法有效摄入;膜囊法,无法确认蚜虫究竟取食了多少;转基因法,由于cry基因在植株韧皮部中的表达量不好定量,无法确定蚜虫取食了多少。而且人们在生物测定中需要考虑很多因素如蚜虫本身的生殖、生存潜能等生物学特性,还与温度、湿度和光照等主要环境因子等有关。因此,传统的筛选抗蚜Cry蛋白的方法存在着共同缺陷:不同实验室测定的数据之间差异极大导致检测结果不精准,无法大批量测定导致不能实现大规模筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一种精准的抗蚜Cry蛋白筛选方法,本发明提供的筛选方法检测结果精准,能够大批量测定,进而实现大规模筛选。
为了实现上述目的,本发明提供了以下技术方案;
本发明提供了一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法,包括:
将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白混合、静置反应,得到混合酶液,将所述混合酶液与底物混合、反应后,得到检测液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到检测值;
将反应缓冲液、蚜虫CathepsinB蛋白酶和Cathepsin B酶活抑制剂混合、静置反应,得到混合抑制剂酶液,将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后,得到抑制剂对照液,检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值,得到抑制检测值;
将反应缓冲液、蚜虫CathepsinB蛋白酶和Cathepsin B酶活激活剂混合、静置反应,得到混合激活剂酶液,将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后,得到激活剂对照液,检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值,得到激活检测值;
当所述检测值大于等于激活检测值,或所述检测值小于等于抑制检测值时,所述苏云金杆菌Cry蛋白为抗蚜Cry蛋白;
所述底物包括Z-Arg-Arg-pNA和/或BSA;
所述反应缓冲液的组分包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。
优选的,所述反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白体积比为9:4:1;
所述反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活抑制剂体积比为9:4:1;
所述反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活激活剂体积比为9:4:1。
优选的,所述将混合酶液与底物混合后,得到混合液,所述混合液中底物的浓度为2μg/ml;所述将混合抑制剂酶液与底物混合后,得到抑制剂混合液,所述抑制剂混合液中底物的浓度为2μg/ml;所述将混合激活剂酶液与底物混合后,得到激活剂混合液,所述激活剂混合液中底物的浓度为2μg/ml。
优选的,所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度为50mM/L;
所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为2.5mM/L;
所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度2.5mM/L。
优选的,所述反应缓冲液的pH值为5.5。
优选的,所述CathepsinB酶活激活剂包括谷胱甘肽。
优选的,所述CathepsinB酶活抑制剂包括E-64。
优选的,所述检测的温度为37℃。
优选的,所述静置反应的温度为37℃;所述静置反应的时间为5min;所述反应的时间为30min。
优选的,所述蚜虫Cathepsin B蛋白酶的氨基酸序列的登录号为Q64G01。
本发明提供了一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法,包括将反应缓冲液、蚜虫CathepsinB蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白混合、静置反应,得到混合酶液,将所述混合酶液与底物混合、反应后,得到检测液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到检测值;将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和CathepsinB酶活抑制剂混合、静置反应,得到混合抑制剂酶液,将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后,得到抑制剂对照液,检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值,得到抑制检测值;将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活激活剂混合、静置反应,得到混合激活剂酶液,将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后,得到激活剂对照液,检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值,得到激活检测值;当所述检测值大于等于激活检测值,或所述检测值小于等于抑制检测值时,所述苏云金杆菌Cry蛋白为抗蚜Cry蛋白;所述底物包括Z-Arg-Arg-pNA和/或BSA;所述反应缓冲液的组分包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。通过测定Cry蛋白对蚜虫细胞凋亡的关键蛋白Cathepsin B酶活是否影响及影响程度,进一步确定Cry是否抗蚜及抗蚜活性高低。利用本发明提供的的筛选方法检测结果精准,能够大批量测定,进而实现大规模筛选。
附图说明
图1为在大肠杆菌中表达桃蚜Cathepsin-B纯化结果;
图2为不同处理后的CathepsinB的酶活。
具体实施方式
本发明提供了一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法,包括:
将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白混合、静置反应,得到混合酶液,将所述混合酶液与底物混合、反应后,得到检测液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到检测值;
将反应缓冲液、蚜虫CathepsinB蛋白酶和Cathepsin B酶活抑制剂混合、静置反应,得到混合抑制剂酶液,将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后,得到抑制剂对照液,检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值,得到抑制检测值;
将反应缓冲液、蚜虫CathepsinB蛋白酶和Cathepsin B酶活激活剂混合、静置反应,得到混合激活剂酶液,将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后,得到激活剂对照液,检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值,得到激活检测值;
当所述检测值大于等于激活检测值,或所述检测值小于等于抑制检测值时,所述苏云金杆菌Cry蛋白为抗蚜Cry蛋白;
所述底物包括Z-Arg-Arg-pNA和/或BSA;
所述反应缓冲液的组分包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。
本发明将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白混合、静置反应,得到混合酶液,将所述混合酶液与底物混合、反应后,得到检测液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到检测值。在本发明中,所述反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白体积比优选为9:4:1;将所述混合酶液与底物混合后,得到混合液,所述混合液中底物的浓度优选为2μg/ml;所述静置反应的温度优选为37℃;所述静置反应的时间优选为5min;所述反应的时间优选为30min;所述检测的温度优选为37℃;所述反应缓冲液的pH值优选为5.5。
在本发明中,所述底物包括Z-Arg-Arg-pNA和/或BSA;所述反应缓冲液的组分优选包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。在本发明中,所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度优选为50mM/L;所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度优选为2.5mM/L;所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度优选为2.5mM/L。
在本发明中,所述蚜虫Cathepsin B蛋白酶的氨基酸序列的登录号优选为Q64G01,所述蚜虫Cathepsin B蛋白酶的制备方法优选包括将蚜虫CathepsinB基因克隆表达,得到混合物;将混合物进行亲和层析纯化,得到蚜虫Cathepsin B蛋白酶,更优选包括将蚜虫Cathepsin B基因去掉其N端20个氨基酸,进行克隆表达得到混合物;将所述混合物进行亲和层析纯化,得到蚜虫Cathepsin B蛋白酶;所述克隆表达的载体优选为pET-30a+,所述克隆表达的基因工程菌优选为大肠杆菌,更优选为大肠杆菌BL21(DE3);所述亲和层析纯化优选为Ni-NTAResin亲和层析纯化。
在本发明中,所述苏云金杆菌Cry蛋白的制备方法优选包括包括将苏云金杆菌Cry基因克隆表达,得到混合物;将混合物进行亲和层析纯化,得到苏云金杆菌Cry蛋白。本发明对苏云金杆菌Cry基因没有特殊要求,采用本领域常规苏云金杆菌Cry基因即可。
本发明将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活抑制剂混合、静置反应,得到混合抑制剂酶液,将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后,得到抑制剂对照液,检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值,得到抑制检测值。在本发明中,所述反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活抑制剂体积比优选为9:4:1;所述将混合抑制剂酶液与底物混合后,得到抑制剂混合液,所述抑制剂混合液中底物的浓度优选为2μg/ml;所述Cathepsin B酶活抑制剂优选包括E-64,更优选为E-64。所述静置反应的温度优选为37℃;所述反应的时间优选为30min;所述检测的温度优选为37℃;所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度优选为50mM/L;所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度优选为2.5mM/L;所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度优选为2.5mM/L;所述反应缓冲液的pH值优选为5.5。
本发明将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活激活剂混合、室温静置反应,得到混合激活剂酶液,将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后,得到激活剂对照液,检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值,得到激活检测值。所述反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活激活剂体积比优选为9:4:1;所述将混合激活剂酶液与底物混合后,得到激活剂混合液,所述激活剂混合液中底物的浓度优选为2μg/ml;所述Cathepsin B酶活激活剂优选包括谷胱甘肽。所述静置反应的温度优选为37℃;所述反应的时间优选为30min;所述检测的温度优选为37℃;所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度优选为50mM/L;所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度优选为2.5mM/L;所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度优选为2.5mM/L;所述反应缓冲液的pH值优选为5.5。
下面结合实施例对本发明提供的一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)制备蚜虫CathepsinB:
在大肠杆菌中表达桃蚜Cathepsin B,亲和层析纯化获得。所述桃蚜CathepsinB为NCBI网上登录号为Q64G01的桃蚜基因组推导的蛋白组中获取其氨基酸序列,经Signal 5.0软件分析发现桃蚜Cathepsin-B其N端20个氨基酸为信号肽,将这20个氨基酸去除后,剩余的氨基酸序列推导出DNA序列,再根据大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化后合成基因,插入到表达载体pET-30a+,随后导入大肠杆菌BL21(DE3),经发酵培养和加入IPTG诱导表达后,采用Ni-NTAResin进行亲和层析纯化,如图1所示为在大肠杆菌中表达桃蚜Cathepsin-B并纯化的电泳图。
(2)制备苏云金杆菌Cry:
从网上获得多种Cry蛋白的氨基酸序列,其余处理与步骤(1)相同,通过同源建模构建其空间模型预测其活性区,然后合成其对应的编码DNA序列,采用常规的基因克隆表达和纯化方法,在大肠杆菌中获得表达,然后经亲和层析纯化获得。
(3)将0.9mL反应缓冲液、0.4mL蚜虫Cathepsin B蛋白酶和0.1mL苏云金杆菌Cry蛋白混合、静置反应5min,得到混合酶液,将所述混合酶液与0.1mL底物混合,分别以Z-Arg-Arg-pNA和BSA为底物,得到底物浓度为2μg/ml的混合液,37℃下反应30min,得到检测液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到检测值;
(4)将0.9mL反应缓冲液、0.4mL蚜虫Cathepsin B蛋白酶和0.1mLCathepsinB酶活抑制剂混合、静置反应5min,得到混合抑制剂酶液,将所述混合抑制剂酶液与0.1mL底物混合,得到底物浓度为2μg/ml的抑制剂混合液,37℃下反应30min,得到抑制剂对照液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到抑制检测值;
(5)将0.9mL反应缓冲液、0.4mL蚜虫Cathepsin B蛋白酶和0.1mLCathepsinB酶活激活剂混合、静置反应5min,得到混合激活剂酶液,将所述混合激活剂酶液与0.1mL底物混合,得到底物浓度为2μg/ml的激活剂混合液,37℃下反应30min,得到激活剂对照液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到激活检测值;
反应缓冲液包括50mM/L乙酸钠、2.5mM/L二硫苏糖醇(DTT)和2.5mM/L乙二胺四乙酸(EDTA),pH为5.5。
试验结果如图2所示,Cry41蛋白显著激活了Cathepsin B的酶活。Cry41蛋白经测定发现其对桃蚜具有中等毒力,其LC50=32.7μg/mL,是目前抗蚜活性最高的Cry蛋白。
本发明提供了一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法,本发明提供的筛选方法检测结果精准,能够大批量测定,进而实现大规模筛选。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法,其特征在于,包括:
将反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白混合、静置反应,得到混合酶液,将所述混合酶液与底物混合、反应后,得到检测液,检测所述检测液在405nm下的吸光度值,得到检测值;
将反应缓冲液、蚜虫CathepsinB蛋白酶和Cathepsin B酶活抑制剂混合、静置反应,得到混合抑制剂酶液,将所述混合抑制剂酶液与底物混合、反应后,得到抑制剂对照液,检测所述抑制剂对照液在405nm下的吸光度值,得到抑制检测值;
将反应缓冲液、蚜虫CathepsinB蛋白酶和Cathepsin B酶活激活剂混合、静置反应,得到混合激活剂酶液,将所述混合激活剂酶液与底物混合、反应后,得到激活剂对照液,检测所述激活剂对照液在405nm下的吸光度值,得到激活检测值;
当所述检测值大于等于激活检测值,或所述检测值小于等于抑制检测值时,所述苏云金杆菌Cry蛋白为抗蚜Cry蛋白;
所述底物包括Z-Arg-Arg-pNA和/或BSA;
所述反应缓冲液的组分包括乙酸钠、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述反应缓冲液、蚜虫CathepsinB蛋白酶和苏云金杆菌Cry蛋白体积比为9:4:1;
所述反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活抑制剂体积比为9:4:1;
所述反应缓冲液、蚜虫Cathepsin B蛋白酶和Cathepsin B酶活激活剂体积比为9:4:1。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述将混合酶液与底物混合后,得到混合液,所述混合液中底物的浓度为2μg/ml;
所述将混合抑制剂酶液与底物混合后,得到抑制剂混合液,所述抑制剂混合液中底物的浓度为2μg/ml;
所述将混合激活剂酶液与底物混合后,得到激活剂混合液,所述激活剂混合液中底物的浓度为2μg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述反应缓冲液中乙酸钠的浓度为50mM/L;
所述反应缓冲液中二硫苏糖醇的浓度为2.5mM/L;
所述反应缓冲液中乙二胺四乙酸的浓度2.5mM/L。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述反应缓冲液的pH值为5.5。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Cathepsin B酶活激活剂包括谷胱甘肽。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Cathepsin B酶活抑制剂包括E-64。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述检测的温度为37℃。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述静置反应的温度为37℃;所述静置反应的时间为5min;所述反应的时间为30min。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述蚜虫Cathepsin B蛋白酶的氨基酸序列的登录号为Q64G01。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010316262.4A CN111500674A (zh) | 2020-04-21 | 2020-04-21 | 一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010316262.4A CN111500674A (zh) | 2020-04-21 | 2020-04-21 | 一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111500674A true CN111500674A (zh) | 2020-08-07 |
Family
ID=71865890
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010316262.4A Pending CN111500674A (zh) | 2020-04-21 | 2020-04-21 | 一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111500674A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113564174A (zh) * | 2021-07-16 | 2021-10-29 | 山西大学 | 苹果黄蚜Cat-B基因及其核酸干扰剂制备方法与应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101570755A (zh) * | 2008-04-29 | 2009-11-04 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种细菌源蛋白酶抑制剂新基因及其表达与应用 |
US20100333236A1 (en) * | 2007-10-30 | 2010-12-30 | Frank Van Breusegem | Insect inhibiting plant serpin mutants |
CN108181370A (zh) * | 2018-01-08 | 2018-06-19 | 太原科技大学 | 槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法 |
CN110283880A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-09-27 | 天津科技大学 | 一种测定蛋白酶活力的新方法 |
CN110305934A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-10-08 | 天津科技大学 | 一种简单便捷测定蛋白酶活力的方法 |
-
2020
- 2020-04-21 CN CN202010316262.4A patent/CN111500674A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100333236A1 (en) * | 2007-10-30 | 2010-12-30 | Frank Van Breusegem | Insect inhibiting plant serpin mutants |
CN101570755A (zh) * | 2008-04-29 | 2009-11-04 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种细菌源蛋白酶抑制剂新基因及其表达与应用 |
CN108181370A (zh) * | 2018-01-08 | 2018-06-19 | 太原科技大学 | 槐角胰蛋白酶抑制剂的制备、活性测定及抑制常数测定的方法 |
CN110283880A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-09-27 | 天津科技大学 | 一种测定蛋白酶活力的新方法 |
CN110305934A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-10-08 | 天津科技大学 | 一种简单便捷测定蛋白酶活力的方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
WOLF-DIETER FESSNER等: "《现代生物催化-高立体选择及环境友好的反应》", 30 June 2016, 中国轻工业出版社 * |
XIAO-DI ZHAO等: ""Possible Insecticidal Mechanism of Cry41-Related Toxin against Myzus persicaeby Enhancing Cathepsin B Activity"", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 * |
刘绍等: "《食品分析与检验》", 31 August 2019, 华中科技大学出版社 * |
张集琼等: "《统计学》", 31 January 2008, 中国科学技术出版社 * |
王芃等: "《食品产品分析与检验技术》", 31 January 2012, 华中科技大学出版社 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113564174A (zh) * | 2021-07-16 | 2021-10-29 | 山西大学 | 苹果黄蚜Cat-B基因及其核酸干扰剂制备方法与应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Liu et al. | Reductionist synthetic community approaches in root microbiome research | |
Carter et al. | Increasing nitrogen fixation and seed development in soybean requires complex adjustments of nodule nitrogen metabolism and partitioning processes | |
Major et al. | Functional analysis of the Kunitz trypsin inhibitor family in poplar reveals biochemical diversity and multiplicity in defense against herbivores | |
Hartl et al. | Serine protease inhibitors specifically defend Solanum nigrum against generalist herbivores but do not influence plant growth and development | |
Kamita et al. | Juvenile hormone (JH) esterase: why are you so JH specific? | |
Zhu et al. | Major putative pesticide receptors, detoxification enzymes, and transcriptional profile of the midgut of the tobacco budworm, Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae) | |
CN107435047A (zh) | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 | |
Valot et al. | Identification of membrane-associated proteins regulated by the arbuscular mycorrhizal symbiosis | |
Sańko-Sawczenko et al. | Transcriptomic changes in Medicago truncatula and Lotus japonicus root nodules during drought stress | |
CN111500674A (zh) | 一种筛选抗蚜Cry蛋白的方法 | |
CN111574599B (zh) | 一种解决杀虫毒素被昆虫肠道消化酶过度酶解的毒素改造方法 | |
Shiotsuki et al. | Induction of carboxylesterase isozymes in Bombyx mori by E. coli infection | |
CN112538494A (zh) | 一种tmprss2突变体蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法 | |
Qiu et al. | BbWor1, a regulator of morphological transition, is involved in conidium-hypha switching, blastospore propagation, and virulence in Beauveria bassiana | |
Josic et al. | Application of proteomics in biotechnology–microbial proteomics | |
Stéger et al. | The evolution of plant proton pump regulation via the R domain may have facilitated plant terrestrialization | |
Fan et al. | Comparative transcriptome analysis to unveil genes affecting the host cuticle destruction in Metarhizium rileyi | |
Dong et al. | RRFT1 (Redox Responsive Transcription Factor 1) is involved in extracellular ATP-regulated gene expression in Arabidopsis thaliana seedlings | |
Spit et al. | Microarray‐based annotation of the gut transcriptome of the migratory locust, Locusta migratoria | |
Cho et al. | Electrophoretic pattern of larval esterases in field and laboratory-selected strains of the tobacco cutworm, Spodoptera litura (Fabricius) | |
Wilson et al. | New techniques for studying competition by Rhizobia and for assessing nitrogen fixation in the field | |
Husain et al. | Transcriptome analysis of the almond moth, Cadra cautella, female abdominal tissues and identification of reproduction control genes | |
Ojha et al. | Characterization of gustatory receptor 7 in the brown planthopper reveals functional versatility | |
CN101633917A (zh) | 一种萤火虫荧光素酶及制备方法 | |
Xiao et al. | The TIR-Type NLR protein is involved in the regulation of Phelipanche aegyptiaca resistance in Cucumis melo |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200807 |