CN111433607A - 用于妊娠的系统、方法、设备和诊断测试 - Google Patents

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Abstract

在至少一些实施方案中，本发明是用于监测对妊娠女性特异性的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)感染的系统、方法、设备和诊断测试。监测通过检查来自妊娠女性的样品(通常是血液样品)中针对已知恶性疟原虫(P.falciparum)蛋白VAR2CSA的抗体的存在来进行。优选地，该抗体与p5和/或p8特异性结合。

Description

用于妊娠的系统、方法、设备和诊断测试
发明领域
本发明是用于疟原虫属(Plasmodium)物种的妊娠特异性血清学监测的系统、方法、设备和诊断测试，并且特别地，涉及用于监测对妊娠女性特异性的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)感染的此类系统、方法、设备和诊断测试。
发明背景
被发育晚期的恶性疟原虫(P.falciparum)血液寄生物(parasite)感染的RBC(红细胞)未见于外周循环中，因为它们粘附至内皮衬里(endothelial lining)上的受体。这种粘附被称为封存(sequestration)，是通过寄生物编码的插入感染的RBC(IRBC)的膜中的克隆变异表面抗原(VSA)介导，并且被认为是一种可能为避免脾清除而演化的免疫逃避策略。
最充分表征的VSA由var基因编码。该基因家族(每个基因组包含约60个成员)编码变异蛋白恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)，PfEMP1位于被恶性疟原虫感染的红细胞的表面上，在那里PfEMP1介导粘附。
特定寄生物在一定时间仅表达一种PfEMP1，但是在每代中，子代寄生物的一部分可以通过未知过程转换为表达替代的PfEMP1种类。不同的PfEMP1分子具有不同的受体特异性，并且以相互排斥的方式在不同var基因产物的表达之间的克隆转换允许寄生物修改其粘附特性，这继而决定寄生物可以在哪种组织中封存。
妊娠期间的恶性疟原虫感染与胎盘中被寄生的红细胞(PE)的封存相关，并且促成低出生体重婴儿和新生儿死亡率(Brabin B.J.等人2004 Placenta 25:359-378)。胎盘分离物在功能上是不同的，因为它们不结合CD36，而是结合硫酸软骨素A(CSA)(Fried M.&Duffy P.E.1996Science 272:1502-1504)。Miller等人的US20090130136证明VAR2CSA确实包含CSA结合结构域并因此与CSA结合。胎盘中CSA丰富，但在任何其他器官中并不丰富。感染妊娠女性的恶性疟原虫寄生物通过胎盘进行感染，并且因此一般只能够有效地感染妊娠女性。
感染了疟疾的妊娠女性产生针对恶性疟原虫红细胞膜蛋白VAR2CSA(350kDa)的抗体，所述VAR2CSA与合胞体滋养层中的CSA结合[9]。例如，如German Perez等人的EP2548572A2中指出的，作为红细胞阶段蛋白，VAR2CSA不太适合作为疫苗生产的靶，因为它不能够阻断新的或另外的感染。尽管如此，由于VAR2CSA是妊娠女性特异性的，已经考虑将它用于开发针对恶性疟原虫的指向妊娠女性的疫苗(参见例如Ndam等人的US9540425)。
近年来，在许多地区疟疾传播已经有所下降，导致了疟疾消除可能在许多国家实现的乐观主义(WHO 2016)。随着传播下降，监测变得愈加重要，并且用于估计社区中疟疾暴露的度量标准(metric)需要解释随空间和时间的动态变化，这对指导干预措施的策略规划、实施和评估至关重要。
传统上，监测通常依赖于卫生服务的病例报告、昆虫学评估和寄生物血症时点患病率。然而，随着传播下降趋向于消除，这些度量标准难以应用、成本高且信息量少。相比之下，血清学作为流行病学工具最近变得更有吸引力[1,2]，而且新的抗原靶的发现是消灭疟疾研究议程(MalERA)上的一个研究优先项，通过改进的高通量筛查技术被促进[3,4]。当前使用的血清监测测定(基于社区的血清转化率)[5]并未被设计成在个体水平检测恶性疟原虫暴露的短期或逐渐的变化。这主要是由于报道的针对容易获得的血液期(blood-stage)抗原的抗体应答的快速获得和长半衰期。这强化了以下观点：血清监测工具可以通过选择免疫原性较弱且更短寿命的新抗原进行改进[3,4,6]。此外，基于家庭的横断面调查费时、操作要求高且成本高，并且在传播变低后，所需的样本量使其用于常规监测目的难以实行[7]。为了克服此限制，常规监测可以着手处理容易接近的群体，这些群体对传播的变化特别敏感，并且代表社区中的疟疾负担(即，学龄儿童或接受产前服务的妊娠女性)[8]。
针对VAR2CSA的抗体以胎次(parity)依赖性方式产生(即，随着连续妊娠期间的暴露而增加)[10]，并且受到影响暴露于恶性疟原虫的风险的诸如以下的变化因素的影响：季节、与河流的接近程度[11]、IPTp的使用[12]或经杀昆虫剂处理的蚊帐(net)[ITN]的使用[13]。VAR2CSA的相对低的血清学多样性[14]和对胎盘寄生物的单次或非常有限地暴露后抗体的产生[15]支持这种抗原用于传播的血清学估计的适用性。此外，示出了在妊娠女性中的恶性疟原虫阳性率(prevalence)与在儿童中检测到的感染阳性率(prevalence ofinfection)强烈相关[8，16]。
发明概述
在至少一些实施方案中，本发明是用于监测对妊娠女性特异性的恶性疟原虫感染的系统、方法、设备和诊断测试。监测通过检查来自妊娠女性的样品(通常是血液样品)中针对已知恶性疟原虫蛋白VAR2CSA的抗体的存在来进行。优选地，该抗体与p5和/或p8特异性结合。
p5(aa)：
CRKCGHYEEKVPTKLDYVPQFLRWLTEWIEDLYREKQNLIDDMERHREECT
p8(aa)：DEVCNCNESEISSVGQAQTSGPSSNKTCITHSSIKANKKKVCKDVKLG
出乎意料地，本申请的发明人已经发现针对VAR2CSA的抗体具有广泛变化的半衰期。某些抗体具有相对长的半衰期，意味着这类抗体的存在实际上可指示在较早的妊娠期间而不是在当前妊娠期间的暴露。然而，确定女性的当前妊娠期间是否发生暴露存在明显益处。不希望受到封闭式列表的限制，这些益处包括能够在总体人群中追踪对疟疾的暴露，这可以例如为控制和根除工作提供指导，包括估计疟疾负担/传播的水平、作为社区中寄生物阳性率的代表并监测疟疾传播的不存在；特别地，追踪对妊娠女性的此类暴露，因为尽管疟疾风险增加，出于对胎儿的安全考虑，在早期妊娠期间许多抗疟疾药物是不推荐的；指导医疗工作，以帮助在子宫内暴露于疟疾感染后出生的儿童；以及确定妊娠女性是否充当疟疾的宿主(reservoir)。
不希望受到封闭式列表的限制，由于以下原因选择了p5和p8：首先，在经历了检测到的感染的女性中，分娩时抗体应答高度增加，这与相对于其他抗原估计的达到两倍抗体水平的短时间一致。其次，根据在莫桑比克报道的出现第二次妊娠的半衰期和达到血清阴性化的时间低于平均时间，抗体并未随着女性胎次的增加而增加。第三，在分娩时血清阳性率不低于在特定妊娠期间检测到的感染阳性率，而是与其相似。
鉴定了免疫反应性和暴露依赖性的新VAR2CSA肽，该肽具有能够提供关于疟疾随时间和空间变化的信息的抗体应答。此外，鉴定了适于在产前诊所就诊的妊娠女性中确认零发病率的肽，所述产前诊所作为用于周围社区疟疾监测的哨点(sentinel)。此外，还评估了基于VAR2CSA的血清学的值，以检测与用不同抗疟疾药的间歇性预防治疗的使用相关的对恶性疟原虫暴露的近期减少。
根据至少一些实施方案，受试者中的抗体水平可以任选地以多种不同方式测量，包括但不限于，基于珠的测定(例如
Figure BDA0002389344840000041
或
Figure BDA0002389344840000042
技术)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白微阵列和发光免疫沉淀系统(LIPS)。所有以上提及的方法产生对抗体的连续测量。
附图简述
图1A-1示出了研究概况；
图1A-2至图1B示出了VAR2CSA肽的免疫反应性和暴露依赖性。A)点图示出了在莫桑比克妊娠女性中针对蛋白阵列和肽阵列测量的归一化中值荧光强度(nMFI)。点代表每个妊娠女性的nMFI，红线对应于几何平均值，并且T条代表95％CI。红色虚线代表来自牛血清白蛋白(BSA)的平均nMFI加3个标准差(BSA反应性阈值)。B)在莫桑比克妊娠女性和西班牙妊娠女性中测量的nMFI的比率(黑色圆形)。条代表来自西班牙妊娠女性的血清阳性率。T条对应于95％置信区间(CI)。红色虚线代表5％血清阳性率阈值。
图2A示出了VAR2CSA肽能够反映莫桑比克的疟疾趋势。在莫桑比克妊娠女性中，通过将2010年期间收集的样品与2003-2005年期间收集的样品相比，测量了归一化的中值荧光强度(nMFI)的比率，对应于疟疾下降的趋势(图的底部)。在莫桑比克妊娠女性中，通过将2011-2012年期间收集的样品与2010年期间收集的样品相比，测量了nMFI的比率，对应于增加的趋势。针对重组蛋白和肽，对抗体进行了测量。将所有回归根据治疗、胎次、年龄和HIV进行调整。T条对应于95％CI，红色表示p值>0.1。
图3.引发快速产生且寿命期有限的IgG应答的VAR2CSA肽。A)在妊娠期间检测到至少一次感染的莫桑比克妊娠女性(n＝49)与未检测到感染的莫桑比克妊娠女性(n＝160)相比，在分娩时测量的归一化的中值荧光强度(nMFI)的比率。如果在任何时间点收集的外周血或胎盘血液样品通过显微术或qPCR检测呈阳性，如果通过医院被动病例检测(PCD)检测到恶性疟原虫，或者如果来自纵向队列的女性的子集呈组织学阳性(现状(active)、慢性或既往)，则认为女性在妊娠期间被感染。B)具有不同寄生物密度(低于或高于200)的莫桑比克妊娠女性在分娩时测量的nMFI的比率。C)达到两倍抗体水平的时间(T2x)。D)抗体水平的半衰期。E)达到抗体血清阴性化的时间(TSN)。F)莫桑比克多次妊娠女性(n＝175)与莫桑比克初次妊娠女性(n＝64)相比，在分娩时测量的nMFI的比率。E)在239名莫桑比克妊娠女性中测量的分娩时的血清阳性率(条)。红色虚线表示妊娠期间检测到的总感染阳性率，而绿色线表示仅在分娩时检测到的阳性率。将所有回归根据治疗、胎次、年龄和HIV进行调整。使用结合高斯随机截距的对数线性混合效应回归模型分析了T2x、半衰期和TSN，并将结果表示为以周计的时间。T条对应于95％CI。
图3H示出了妊娠期间的抗体动态。
图4A-图4D按年度示出了莫桑比克妊娠女性中分娩时的恶性疟原虫的(血清)阳性率。A图、B图和C图分别示出了针对VAR2CSA肽、重组蛋白和非VAR2CSA抗原的血清阳性率。通过多重基于珠的免疫测定测量在分娩时收集的血浆样品中的抗体(2004年n＝67，2005年n＝81，2010年n＝177，2011年n＝244，且2012年n＝272)，并且通过有限混合模型(FMM)获得了基于VAR2CSA的抗原的血清阳性率，或通过阴性对照手段获得了非VAR2CSA抗原的血清阳性率。D图示出了在分娩时收集的外周血和胎盘血两者中通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测量的感染阳性率。P值基于针对人类免疫缺陷病毒(HIV)状态、胎次、年龄和治疗进行调整的多变量分析。T条代表95％置信区间。
图4E示出了贝宁(高传播)和莫桑比克(低传播)的血清阳性率除以qPCR阳性率。
图5：按国家的妊娠女性中恶性疟原虫的(血清)阳性率。A图、B图和C图分别示出了针对VAR2CSA肽、重组蛋白和非VAR2CSA抗原的血清阳性率。通过多重基于珠的免疫测定测量在分娩时收集的血浆样品中的抗体(HIV阴性者：贝宁n＝854，加蓬n＝131，莫桑比克＝485，且坦桑尼亚n＝31；HIV感染者：莫桑比克n＝362，且肯尼亚n＝296)，并且通过有限混合模型(FMM)获得了基于VAR2CSA的抗原的血清阳性率，或通过阴性对照手段获得了非VAR2CSA抗原的血清阳性率。D图示出了在分娩时收集的外周血和胎盘血两者中通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测量的感染阳性率(HIV阴性者：贝宁n＝307，加蓬n＝89，莫桑比克n＝332，并且坦桑尼亚n＝31；HIV感染者：莫桑比克n＝322，并且肯尼亚n＝273)。P值基于针对胎次、年龄和治疗进行调整的多变量分析。T条代表95％置信区间。
图6按间歇性预防治疗干预组示出了妊娠女性中恶性疟原虫的(血清)阳性率。A图、B图和C图分别示出了针对VAR2CSA肽、重组蛋白和非VAR2CSA抗原的血清阳性率。通过多重基于珠的免疫测定测量在分娩时收集的血浆样品中的抗体(HIV阴性者：甲氟喹[MQ]n＝996，磺胺多辛-乙胺嘧啶[SP]n＝505；HIV感染者：MQ n＝317，并且安慰剂n＝342)，并且通过有限混合模型(FMM)获得了基于VAR2CSA的抗原的血清阳性率，或通过阴性对照手段获得了非VAR2CSA抗原的血清阳性率。D图示出了在分娩时收集的外周血和胎盘血两者中通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测量的感染阳性率(HIV阴性者：MQ n＝490，SP n＝262；HIV感染者：MQ n＝283，并且安慰剂n＝313)。P值基于针对胎次和年龄进行调整的多变量分析。T条代表95％置信区间。
图7按贫血状态示出了妊娠女性中恶性疟原虫的(血清)阳性率。A图、B图和C图分别示出了针对VAR2CSA肽、重组蛋白和非VAR2CSA抗原的血清阳性率。通过多重基于珠的免疫测定测量在分娩时收集的血浆样品中的抗体(HIV阴性者：贫血者[A]n＝571，非贫血者[非A]n＝889；HIV感染者：贫血者n＝242，并且非贫血者n＝417)，并且通过有限混合模型(FMM)获得了基于VAR2CSA的抗原的血清阳性率，或通过阴性对照手段获得了非VAR2CSA抗原的血清阳性率。D图示出了在分娩时收集的外周血和胎盘血两者中通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测量的感染阳性率(HIV阴性者：贫血者[A]n＝289，非贫血者[非A]n＝463；HIV感染者：贫血者n＝214，并且非贫血者n＝378)。P值基于针对胎次、年龄和治疗进行调整的多变量分析。T条代表95％置信区间。
图8示出了DBL1X-ID1的3D模型，该模型示出了选择的肽。(A)DBL1X-ID1的带状呈现，示出了以蓝色着色的p5和以橙色着色的p8。(B)DBL1X-ID1的空间感觉呈现，示出了以蓝色着色的p5和以橙色着色的p8。(C)DBL1X-ID1的空间感觉呈现，示出了通过BepiPred预测的以蓝色着色的p5表位(p5E)和以橙色着色的p8表位(p8E)。
至少一些实施方案的描述
在至少一些实施方案中，本发明是用于监测对妊娠女性特异性的恶性疟原虫感染的系统、方法、设备和诊断测试。监测通过检查来自妊娠女性的样品(通常是血液样品)中针对已知恶性疟原虫蛋白VAR2CSA的抗体的存在来进行。优选地，该抗体与p5和/或p8特异性结合。
在暴露于疟疾的妊娠女性中检测针对VAR2CSA(被恶性疟原虫疟疾寄生物用来封存在胎盘中的寄生物抗原[1])的妊娠特异性抗体，可以告知近期感染(妊娠期间)。因此，它可以被用于：
1.估计疟疾负担/传播的水平：抗体的存在指示女性在妊娠期间被感染(血清学是感染的历史记录)。与在普通人群中的其他血清学方法相比[2,3]，VAR2CSA血清学方法的优点是它允许监测疟疾负担的近期变化(在一次妊娠期间)。当由于疟疾发病率大幅下降导致阳性率低时，测量针对VAR2CSA的抗体对检测循环寄生物可以比检测主动感染物(即寄生物本身)更有效[4]。因此，该工具对于疟疾消除活动的监测可以非常有用。
2.社区中寄生物阳性率的代表：使用该血清学方法在妊娠女性中进行的疟疾估计可以被用作为一般人群中疟疾数量的指标。与在社区中进行运筹复杂的横断面调查相比，产前诊所处的妊娠女性的相对容易的接近性将减少监测成本，当疟疾传播已经下降到其不再是公共卫生关切的程度并且工作变得更加放松时，其增加长期可持续性[5]。
3.监测由消除活动导致的疟疾传播的不存在：证明没有感染[6]需要高样本量来得出该地区中没有寄生物的结论。鉴于妊娠女性感染疟疾的高风险[4]，如果感染存在，通过该血清学方法对妊娠女性进行靶向取样将增加检测到感染的可能性，以及确认不存在感染的置信度(基于风险的监测)。在妊娠女性中通过VAR2CSA血清学得到的阴性结果(即，未检测到抗体)可以被用作疟疾消除(无循环寄生物)的信号。
4.评估妊娠女性是否是疟疾传播的宿主：由于与抗疟疾药相关的安全性考虑，减少疟疾传播的社区化学疗法活动通常将妊娠女性排除在外，特别是在妊娠的前三个月期间。因此，使用该血清学方法可以告知妊娠女性中这些宿主的存在。
5.检测疟疾在消除工作的目标环境中的再次出现：在妊娠女性中针对VAR2CSA的抗体水平的增加将指示疟疾的潜在再现，并且因此被用于及时指导控制传播增加的方法。
6.评估控制、预防和消除工具的影响：针对VAR2CSA的抗体应答的降低可以指示较低的寄生物负担，并且因此表明干预方案组合(intervention packages)效果良好。相反，抗体应答的增加可以被用作疟疾控制工具并非最佳的预警信号。
7.鉴定具有高疟疾负担的局部地理区域(热点)：对于VAR2CSA血清学测试具有阳性结果的妊娠女性可以指示其居住地区中的疟疾传播，并且然后被用于这些地区中疟疾控制消除的靶向工作。
8.鉴定处于风险的妊娠：已经描述了在妊娠初期(此时胎儿正在发育)感染的影响比分娩时更大[7-9]。阳性VAR2CSA血清学方法可以被用作妊娠期间早期感染的指示，并且因此指示低出生体重或早产的较高风险。
9.指导针对疟疾的妊娠特异性疫苗的设计：由于VAR2CSA是用于疫苗开发的潜在的靶[10]，血清学测试可以被用于指导疫苗的成功免疫接种(如果疫苗达到被用作公共卫生工具的程度)，并有助于理解妊娠期间免疫保护的基础。
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实施例1-抗体选择
方法
伦理学声明
本研究由巴塞罗那的Hospital Clínic(西班牙)的伦理委员会、Institut deRecherche pour le Développement的ComitéConsultatif de Déontologie et
Figure BDA0002389344840000101
(法国)、疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control andPrevention)(美国)、以及参与本研究的每个疟疾流行国家的国家伦理审查委员会批准。从所有参与者获得了书面知情同意。
研究地点和人群
被纳入本研究的女性是在以下妊娠期间间歇性预防治疗(IPTp)的2项临床试验期间招募的：2003-2005年之间(Clinical trials.gov NCT00209781)[17]在莫桑比克，以及2010-2012年之间(NCT00811421)[18,19]在莫桑比克而且还有贝宁、加蓬、肯尼亚和坦桑尼亚。2003-2005年之间招募的女性接受了两个剂量的磺胺多辛-乙胺嘧啶(SP)[17]；并且2010-2012年之间招募的女性如果是HIV阴性的，则接受了两个剂量的甲氟喹(MQ)或SP[19]，或者如果她们是HIV阳性的且正在接受甲氧苄啶-磺胺甲噁唑预防治疗，则接受了三个剂量的MQ或安慰剂[18]。所有被纳入本研究的女性都接受了用长效杀虫剂处理过的蚊帐。在分娩时，使用快速诊断测试评估了HIV血清状态，并使用移动设备(HemoCue、Hemocontrol和Sysmex KX分析仪)确定了毛细血管血液样品中的血红蛋白。在分娩时收集了来自胎盘的母体侧的组织样品以及母体外周血、胎盘血样品。制备了在滤纸上的干血液点(50μl)，并将血液收集到EDTA真空采血管中并离心，将血浆储存在-20℃。在妊娠期间从纵向队列收集了多于一份外周血液样品，该纵向队列包括2011-2012年期间招募的莫桑比克女性的一部分[18,19]。在研究时，根据国家指南来治疗临床疟疾发作。在这两项临床试验中，通过使用相似的方案和程序，使由于汇集来自这两项临床试验的数据而产生的偏差最小化。最后，作为对照，从在2010年期间在巴塞罗那Hospital Clinic招募的分娩时的妊娠女性收集了49份血浆样品。
在莫桑比克，妊娠女性中疟疾感染的阳性率从2003年至2010年大幅下降，并且然后轻微增加，直至2012年[20]。由疟疾地图集项目(Malaria Atlas Project)地质统计预测模型[21]得出的患有恶性疟原虫感染的2-10岁儿童的估计比例在2003-2005年为29％，在2010年为5％，并且在2011-2012年为9％，与先前测量一致。从2003年至2012年报道的在曼希萨特区医院(
Figure BDA0002389344840000111
District Hospital)观察到的小于五岁的儿童的临床疟疾病例获得了相似的阳性率(在2003-2005年为32％，在2010年为8％，并且在2011-2012年为14％，未公布的数据)。
抗原
使用的重组蛋白是VAR2CSA Duffy结合样结构域(DBL3X、DBL5ε和DBL6ε，来自3D7虫株)[11,22]、顶端膜抗原1(AMA1，来自3D7虫株)[23]、裂殖子表面蛋白-1，19-kDa，(MSP119，来自3D7虫株)[24]，以上均在ICGEB(印度新德里)生产。破伤风梭菌(Clostridiumtetani)，破伤风毒素，购自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,Texas)。我们设计了25个合成肽，覆盖了VAR2CSA的保守区域和半保守区域[25]。还包括64个氨基酸(NVDP[NANP]15)的环子孢子肽(pCSP)[26]。肽由Gl Biochem(Xangai，中国)合成，并且通过HPLC和质谱法估计中值纯度为79％(范围：71％-91％)。
寄生物学确定
根据标准的质量控制程序[27-29]，读取了厚血膜和薄血膜以及胎盘活组织检查，用于疟原虫属物种检测。通过靶向18S核糖体RNA(rRNA)的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)测定[30,31]的手段以一式二份测试了滤纸上的血液中恶性疟原虫的存在和密度。既往胎盘感染被定义为疟色素(即，疟原虫色素)存在而胎盘组织学检查未检测到寄生物，而慢性胎盘感染被定义为疟色素存在以及检测到寄生物[20]。如果外周血或胎盘血样品通过显微术或qPCR检测呈阳性，或者如果组织学呈阳性(现状或慢性)，则被定义为分娩时的恶性疟原虫感染。如果在任何时间点收集的外周血或胎盘血样品通过显微术或qPCR检测呈阳性，如果通过医院被动病例检测(PCD)检测到恶性疟原虫，或者如果来自纵向队列的女性的子集呈组织学阳性(现状、慢性或既往)，则被定义为妊娠期间感染。
基于珠的免疫测定
使用xMAPTM技术和
Figure BDA0002389344840000121
100/200TM系统(
Figure BDA0002389344840000122
Corp.,Austin,Texas)，构建了两个多重悬浮阵列组，来定量针对恶性疟原虫重组蛋白和合成肽的IgG应答。选择具有不同光谱特征的
Figure BDA0002389344840000123
微球(磁性羧基化聚苯乙烯微粒，5.6μm)用于每种蛋白(DBL3X、DBL5ε、DBL6ε、AMA1和MSP119)、肽(25种VAR2CSA肽和pCSP)、破伤风毒素和牛血清白蛋白(BSA)。遵循
Figure BDA0002389344840000124
公司的方案的修改，将抗原共价偶联至珠[25]。蛋白和肽的多重阵列通过将等体积的包被的珠汇集在一起来制备。将血浆样品或DBS洗脱产物以1:400稀释用于蛋白阵列并以1:100稀释用于肽阵列，以一式两份进行分析。除了用于评估背景水平的空白(没有样品的孔)以外，每个测定板中包括包含来自感染疟疾的莫桑比克妊娠女性的23种血浆的超免疫血浆汇集物(HIP-VAR2CSA)。每个光谱特征读取至少50个微球，并将结果输出为粗中值荧光强度(MFI)。将一式两份进行平均并减去背景MFI。分析了总计224个板，并且蛋白阵列的测定内变异(来自每个板20个血浆样品的重复的平均CV)的范围为从1.4％至7.3％，而肽阵列为从2.5％至12.4％。蛋白阵列的测定间变异(224个板之间的阳性汇集物[HIP-VAR2CSA]的变异性)为5％，而肽阵列为26％。通过将每个样品的减去背景的MFI与同一板中阳性汇集物的值相乘，并除以所有板中阳性汇集物的中值，将结果归一化(nMFI)，来解释板与板之间的变异。
滤纸上的血滴的重构
如先前描述的从来自加蓬、坦桑尼亚和肯尼亚的DBS洗脱抗体[25,32]。简言之，为了获得相当于1:50血浆稀释的浓度的洗脱血液蛋白，用200μl
Figure BDA0002389344840000125
测定缓冲液(过滤的PBS[磷酸盐缓冲盐水]中1％BSA、0.05％叠氮化钠)从直径约3mm的四个点洗脱抗体。基于点重构的目视检查(微红色背景下的白色点)来考虑适当的洗脱，通过分光光度法来测量足够的血红蛋白水平(高于最高四分位数[7.4mg/l]的具有不适当的视觉效果的样品)，并且通过
Figure BDA0002389344840000126
在洗脱产物(高于最低四分位数[11563,5nMFI])中测量高抗破伤风毒素nMFI[25]。使用来自49名西班牙妊娠女性的新鲜红细胞(血型为O，假设血细胞比容为约50％)和冷冻血浆人工制备了对照血滴。在巴塞罗那，将滤纸储存在-20℃，避免潮湿。
蛋白3D模型
DBL1X-ID1的3D结构通过向HHPred服务器(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)提交3D7序列(具有由[33]限定的结构域限制)来计算。选择对应于VarO虫株的DBL1α结构域(蛋白数据库(Protein Data Bank)[PDB]2yk0[34])、具有最高HHPred评分的结构，以在MODELLER中基于默认比对进行同源性建模。分子图以UCSF Chimera 1.5.3版来生成[35]。
定义和统计分析
将女性分类为初次妊娠(首次妊娠)和多次妊娠(至少一次先前妊娠)。将年龄分类为小于20岁、20岁至24岁、或者25岁或高于25岁[11]。贫血被定义为在分娩时血红蛋白水平低于11mg/l[36]。
抗体的存在或不存在对于妊娠特异性抗原(VAR2CSA肽和重组结构域)通过有限混合模型(FMM)来定义[25,32]且对于一般疟疾抗原(AMA1、MSP119和pCSP)通过来自巴塞罗那的妊娠女性的IgG应答的平均值加3个标准差(SD)来定义。如果nMFI平均值高于BSA识别(平均BSA+3SD)，则证实免疫反应性。
测定内变异被计算为在每个板中分析的重复的平均变异系数(CV＝SD/平均值*100％)。测定间变异被计算为在所有板中重复的阳性汇集物中测量的每个多重阵列中包含的所有抗原的中值MFI的CV，随后归一化。
通过nMFI的对数变换将数据拟合为正态分布。将参与者的基线特征和寄生物学结果在研究时间和区域之间通过单变量分析(Fisher检验用于二元结果，或t-Student检验用于连续结果)进行比较。当西班牙妊娠女性中的血清阳性率为5％或更高时，认为应答不限于疟疾。
使用线性回归模型来比较来自莫桑比克和西班牙的妊娠女性的抗体水平。通过根据治疗、胎次、年龄和HIV进行调整的线性回归模型(将2010年与2003-2005年进行比较，对应于疟疾下降的趋势，而2011-2012年与2010年的比较对应于增加的趋势)分析了在莫桑比克抗体水平模拟疟疾趋势的能力。
以根据年龄、胎次、HIV和治疗进行调整的线性回归模型评估了妊娠期间的恶性疟原虫感染对分娩时的抗体的影响。通过根据年龄、胎次、HIV和治疗进行调整的线性回归模型评估了由于寄生物密度(低于或高于200)导致的抗体水平变化。
使用结合高斯随机截距的对数线性混合效应回归模型分析了感染对抗体水平的调节效应。假设单一指数模型，这导致对抗体动态(增加或衰减)比率的估计。达到两倍抗体水平的时间(T2x)和半衰期分别由估计比率和95％置信区间界限以周为单位来计算，所述估计比率和95％置信区间界限从不依赖于招募时的抗体状态而在随访时罹患恶性疟原虫感染的受试者(Ab[-或+]/Pf+)和招募时呈血清阳性而随访时未检测到感染的受试者(Ab+/Pf-)的混合效应模型获得[37,38]。在增长率为负值(比率低于1)或衰减率为正值(比率高于1)的情况下，计算的T2x或半衰期被报道为无穷大。相似地，这些受试者随着衰减达到血清逆转的时间是使用血清阳性截止值与招募时平均抗体滴度的比率来计算的，即平均滴度需要减少多少倍才能等于截止值。
通过根据年龄、HIV和治疗进行调整的线性回归模型证实了分娩时胎次(多次妊娠对比初次妊娠)对抗体水平的影响。
通过根据胎次、年龄和治疗进行调整的逻辑回归模型在国家(贝宁、加蓬和莫桑比克未感染HIV，肯尼亚和莫桑比克感染HIV)之间、IPTp干预组(MQ与SP，未感染HIV；MQ与安慰剂，感染HIV)之间和贫血状态之间对血清阳性率进行了比较。
通过将相互作用项纳入回归模型中来评估HIV感染或胎次对关联的影响。
统计分析用Stata/SE软件(12.0版；StataCorp)和Graphpad Prism(6版，Graphpad,Inc)来进行。小于0.05的P值被认为指示统计显著性。
结果
1.样本量和描述
在来自妊娠女性的2729份样品(1849份血浆和880份DBS)中对抗体进行了测量，样品是在从2003年至2012年的妊娠期间间歇性预防治疗疟疾的两项临床试验的背景下在分娩时收集的(图1A-1)。表1A示出了被纳入分析的女性的一些特征。
表1A-被纳入分析的女性(按HIV状态和试验进行的样本描述)
Figure BDA0002389344840000151
PG，初次妊娠；MG，多次妊娠；SP，磺胺多辛-乙胺嘧啶；MQ，甲氟喹；IPTp，妊娠期间间歇性预防治疗；qPCR，定量聚合酶链式反应；
#显微术或qPCR或组织学检测呈阳性(现状或慢性)。
$在外周血和胎盘血中进行qPCR和显微术评估
*HIV未感染者缺失数据：莫桑比克(153个qPCR，4个显微术和组织学)；贝宁(547个qPCR，127个显微术和组织学)；
加蓬(42个qPCR，3个显微术和组织学)
**HIV感染者缺失数据：莫桑比克(40个qPCR，31个显微术和组织学)；肯尼亚(23个qPCR，13个显微术和组织学)
Ψ40％的HIV未感染者和12％的HIV感染者在妊娠期间被随访
缩写如下：PG，初次妊娠；MG，多次妊娠；SP，磺胺多辛-乙胺嘧啶；MQ，甲氟喹；IPTp，妊娠期间间歇性预防治疗；qPCR，定量聚合酶链式反应；#显微术或qPCR或组织学检测呈阳性(现状或慢性)。
$在外周血和胎盘血中进行qPCR和显微术评估
*HIV未感染者缺失数据：莫桑比克(153个qPCR，4个显微术和组织学)；贝宁(547个qPCR，127个显微术和组织学)；加蓬(42个qPCR，3个显微术和组织学)
**HIV感染者缺失数据：莫桑比克(40个qPCR，31个显微术和组织学)；肯尼亚(23个qPCR，13个显微术和组织学)
Ψ40％的HIV未感染者和12％的HIV感染者在妊娠期间被随访
因为抗体的不当洗脱，来自422份DBS样品的结果被排除。在最终被纳入分析的总计2307名妊娠女性中(表1)，1567名(68％)为HIV阴性者，并且740名(32％)为HIV感染者。在来自HIV阴性的女性的样品中，854份(55％)为来自贝宁的血浆，551份(35％)为来自莫桑比克的血浆，131份(8％)为来自加蓬的DBS，以及31份(2％)为来自坦桑尼亚的DBS；而444份(60％)血浆和296份(40％)DBS分别来自HIV感染的莫桑比克和肯尼亚女性。在莫桑比克女性中，148名(55％为HIV感染者)来自2003年和2005年之间进行的一项试验，并且847名(43％为HIV感染者)来自2010年和2012年之间进行的第二项试验，以及来自贝宁、加蓬、坦桑尼亚和肯尼亚的所有女性被纳入本研究。参与第二项试验的总计239名莫桑比克妊娠女性在妊娠期间被随访，并在妊娠期间收集了2份血浆样品，以及在分娩时收集了1份血浆样品(分析了总计696份血浆；除了21名女性在妊娠和分娩期间均仅收集了1份血浆样品)。被纳入本研究的女性在基线特征方面是相似的，所有5600名女性都参与了随机试验(在表1B中示出)。
表1B-参与间歇性预防治疗试验的女性和未被纳入本研究的女性的特征
Figure BDA0002389344840000171
PG，初次妊娠；MG，多次妊娠：SP，磺胺多辛-乙胺嘧啶；MQ，甲氟喹；IPTp，妊娠期间间歇性预防治疗：
qPCR，定量聚合酶链式反应：
#显微术或qPCR或组织学检测呈阳性(现状或慢性)。
＄在外周血和胎盘血中进行qPCR和显微术评估
*HIV未感染者缺失数据：742个qPCR，134个显微术和组织学
**HIV感染者缺失数据：63个qPCR，44个显微术和组织学
缩写如下：PG，初次妊娠；MG，多次妊娠；SP，磺胺多辛-乙胺嘧啶；MQ，甲氟喹；IPTp，妊娠期间间歇性预防治疗；qPCR，定量聚合酶链式反应；
#显微术或qPCR或组织学检测呈阳性(现状或慢性)。
$在外周血和胎盘血中进行qPCR和显微术评估
*HIV未感染者缺失数据：742个qPCR，134个显微术和组织学
**HIV感染者缺失数据：63个qPCR，44个显微术和组织学
2.能够反映2003年和2012年之间莫桑比克疟疾趋势的被来自暴露于疟疾的妊娠女性的抗体识别的VAR2CSA肽的选择及应答
来自2003年和2012年之间分娩的641名莫桑比克妊娠女性的IgG，以高于BSA识别的水平(来自每种疟疾抗原的平均nMFI高于来自BSA的平均nMFI加3个SD)识别以下各项：22/25 VAR2CSA肽(例外：p24、p29和p33)、所有VAR2CSA重组蛋白(DBL3X、DBL5ε、DBL6ε)，以及所有非VAR2CSA恶性疟原虫抗原(AMA1、MSP119和pCSP)(图1A-2，表2A)。
表2A示出了能够反映2003年和2012年之间莫桑比克疟疾趋势的被来自暴露于疟疾的妊娠女性的抗体识别的VAR2CSA肽的选择及应答。
表2A-VAR2CSA肽的选择
Figure BDA0002389344840000181
PW，妊娠女性；Mz，莫桑比克；Bcn，巴塞罗那；SeroPrev，血清阳性率；CI，置信区间
*线性回归，根据胎次、年龄、治疗和HIV进行调整
缩写：PW，妊娠女性；Mz，莫桑比克；Bcn，巴塞罗那；SeroPrev，血清阳性率；CI，置信区间
*线性回归，根据胎次、年龄、治疗和HIV进行调整
莫桑比克妊娠女性的抗体水平高于从未暴露于疟疾的西班牙妊娠女性(N＝49)(在所有情况下p＜0.05)，唯一的例外为DBL6ε(比率[95％CI]＝1.11[0.82；1.49]；p＝0.503)(图1B，上图；表2A)。在西班牙妊娠女性中获得的大多数抗原的血清阳性率低于5％，除了p18、p22、p29、p35、p42、pCSP和DBL6ε高于5％(6％至14％)(图1B，下图；表2A)。
在分娩时针对所有疟疾抗原测量的抗体水平能够反映2003年和2010年之间恶性疟原虫感染的急剧减少。在VAR2CSA肽中，针对p8的抗体水平显示出最高的下降(调整后的比率和95％置信区间[AR-CI 95％]＝0.44[0.34，0.58])，紧接着是针对p5的抗体(AR-CI95％＝0.47[0.36，0.60])，而针对p11的抗体显示出最低的下降(AR-CI 95％＝0.79[0.65，0.96])；在所有情况下p<0.05。观察到针对以下的IgG水平也有相同的模拟下降的能力：DBL3x(AR-CI 95％＝0.36[0.25，0.53]；p<0.001)，DBL5ε(AR-CI 95％＝0.32[0.22，0.48]；p<0.001)，DBL6ε(AR-CI 95％＝0.57[0.46，0.71]；p<0.001)和非VAR2CSA恶性疟原虫抗原(AMA1：AR-CI 95％＝0.70[0.59，0.83]和pCSP：AR-CI 95％＝0.49[0.34，0.71]；p<0.001)(图2，下图；表2A)。
针对所分析的25种VAR2CSA肽中的8种的IgG水平能够反映从2010年至2011-2012年疟疾阳性率的轻微增加(AR-CI95％范围为从p29的1.24[1，1.52]至p5的1.61[1.30，2]；在所有情况下p<0.05)，并且观察到针对另外2种肽的IgG水平的相似增加(p6：AR-CI 95％＝1.23[0.97，1.56]；p＝0.093；p8：AR-CI 95％＝1.24[0.98，1.58；p＝0.071)，尽管不是统计上显著的。在这3年期间，没有观察到针对VAR2CSA重组结构域和非VAR2CSA抗原的IgG水平的显著增加(在所有情况下p>0.1)(图2，上图；表2A)。
综上所述，选择了7种VAR2CSA肽(p1、p5、p6、p8、p12、p20和p37)，因为它们具有免疫反应性(平均抗体水平高于BSA识别率)，与西班牙妊娠女性相比被莫桑比克妊娠女性以更高水平识别(在西班牙妊娠女性中血清阳性率低于5％)，并且抗体水平能够反映莫桑比克的疟疾阳性率的下降(从2003年至2010年)和轻微增加(从2010年至2012年)。
3.引发快速产生且寿命期有限的IgG应答的VAR2CSA肽的选择
在来自2011年和2012年之间在妊娠期间追踪的239名莫桑比克妊娠女性的总计696份血浆中，对妊娠期间和分娩时针对25种VAR2CSA肽、重组结构域(DBL3X、DBL5ε、DBL6ε)和非VAR2CSA抗原(AMA1、MSP119和pCSP)的IgG进行了测量。
与妊娠期间未检测到感染的女性相比，妊娠期间具有至少一次检测到的感染的女性在分娩时测量的针对所有疟疾抗原的抗体水平有所增加(在所有情况下p<0.05)(表2B)。
表2B-引发快速产生且寿命期有限的IgG应答的VAR2CSA肽的选择
Figure BDA0002389344840000211
缩写：CI，置信区间；MG，多次妊娠；PG，初次妊娠
*根据年龄、胎次、治疗和HIV感染进行调整的线性回归
**根据胎次、年龄、治疗和HIV感染进行调整的对数线性回归模型
***根据疟疾感染、年龄、治疗和HIV感染进行调整的线性回归
在7种VAR2CSA肽中，针对以下的IgG水平显示出最高的增加：p5(AR-CI 95％＝2.15[1.39，3.31)；p<0.001)，p8(AR-CI 95％＝2.17[1.46，3.23]；p<0.001)和p37(AR-CI95％＝2.13[1.39，3.29]；p<0.001)(图3A)。对于DBL3x(AR-CI 95％＝8.83[5.33，14.62]；p<0.001)和DBL5ε(AR-CI 95％＝15.06[8.29，27.37]；p<0.001)观察到高得多的增加(图3A)。
不同的寄生物密度(低：每微升<200个基因组[n＝36]和高：每微升>200个基因组[N＝31])对针对所有抗原的抗体水平没有影响(P>0.05)，不依赖于收集时间(图3B；表2B)。
在7种肽中获得的达到两倍抗体水平(在随访中在26名经历感染的女性中测量)的估计时间(T2x)(以周为单位)的范围为从p5的23.24(95％CI＝16.16，41.38；p＝<0.001)至p6的37.58(95％CI＝21.77，137.40；p＝0.007)。在重组结构域中，DBL3X的T2x为20.77(95％CI＝13.44，45.70；p<0.001，DBL5ε的T2x为16.25(95％CI＝10.91，31.83；p<0.001)，以及DBL6ε的T2x为27.77(95％CI＝19.76，46.72；p<0.001)(图3C)。与对基于VAR2CSA的抗原观察到的相反，大多数女性在招募和随访时对非VAR2CSA抗原呈血清阳性(图3H)，导致针对AMA1、MSP119和pCSP的IgG水平的Tx2统计不显著(p>0.05)。
在招募时呈血清阳性且随访时未经历恶性疟原虫感染的女性组中，估计了针对每种抗原的抗体水平的半衰期(T1/2)和达到血清阴性化的时间(TSN)(以周为单位)(样本量的范围为从DBL6ε的N＝22至MSP119的N＝182)。在7种肽中，对于以下的肽获得了快速抗体下降：p8(T1/2：28.65周，95％CI＝19.61；53.15和TSN：65.61周，95％CI＝44.91，121.70；p<0.001)，随后为p12(T1/2：46.08[26.99，157.30]和TSN：78.95[46.25，269.54]；p＝0.006)和p6(T1/2：49.2[25.89；494.21]和TSN：77.44[40.75，777.82]；p＝0.03)，并且然后为p37(T1/2：64.77[30.62；∞]和TSN：145.45[68.76，∞]；p＝0.079)和p5(T1/2：69.3[33.68；∞]和TSN：141.17[68.62，∞]；p＝0.064)，尽管对最后两种肽没有高度的统计显著性(图3D、图3E；表2B)。与肽相比，半衰期和血清阴性化之间的差异在以下中更高：DBL3X T1/2：51.97[29.01，249.53]和TSN：138.85[77.49，666.65]；p＝0.013)和DBL5ε(T1/2：34.57[21.64，85.94]和TSN：122.28[76.54；304.00]；p＝0.001)(图3D、图3E；表2B)。在非VAR2CSA抗原中，只有MSP119显示出半衰期和血清阴性化的统计显著性(T1/2：66.99[36.04，474.23]和TSN：385.42[207.36，2728.50]；p＝0.023)(图3D、图3E；表2B；图3H)。
对于6种VAR2CSA肽，在分娩时测量的抗体水平没有随着女性的胎次增加而增加(p>0.1)，唯一的例外是p20(AR-CI 95％＝1.51[0.98，2.32]；p<0.065)，轻微增加(图3F；表2B)。报道了在多次妊娠中针对以下的抗体水平的较高增加：DBL3X(AR-CI 95％＝2.22[1.10，4.51]；p<0.028)和DBL5ε(AR-CI 95％＝3.72[1.61，8.59]；p<0.002)，与针对这些抗原估计的达到血清阴性化的长时间相一致(图3E、图3F；表2B)。
最后，分娩时的血清阳性率相似(p1(23％)、p5(26％)、p8(26％)和p20(21％))且不低于妊娠期间检测到的感染阳性率21％(图3G；表2B)。重组结构域显示出为妊娠期间检测到的感染阳性率2倍高的血清阳性率(DBL3X为45％，并且DBL5ε为50％；除了DBL6ε为12％)，并且非VAR2CSA抗原显示出为妊娠期间检测到的感染阳性率4倍高的血清阳性率(MSP119和AMA1为89％，以及pCSP为64％)(图3G；表2B)。
综上所述，由于以下原因选择了p5和p8：首先，在经历了检测到的感染的女性中，分娩时抗体应答高度增加，这与相对于其他抗原估计的达到两倍抗体水平的短时间一致。其次，根据在莫桑比克报道的出现第二次妊娠的半衰期和达到血清阴性的时间低于平均时间，抗体并未随着女性胎次的增加而增加；第三，在分娩时血清阳性率不低于在特定妊娠期间检测到的感染阳性率，而是与其相似。
4.选择的VAR2CSA肽鉴定疟疾暴露在时间和空间上的差异的性能
通过qPCR评估的分娩时外周血和胎盘血中的疟疾感染的阳性率从2003-2005年的26％下降至2010年的2％(调整的优势比和95％CI(AOR-CI95％)＝0.05[0.01，0.16]；p<0.001)，并且在2011-2012年轻微增加至6％(AOR-CI 95％＝3.71[1.08，12.78]；p＝0.0379)。
表3A按年度示出了莫桑比克妊娠女性中分娩时的恶性疟原虫的(血清)阳性率。
Figure BDA0002389344840000241
针对p5和p8的血清阳性率分别从2003-2005年的29％和34％显著下降至2010年的10％和16％(p<0.001，调整的)，并在2012年轻微增加至22％和27％(对于p5是显著的[p＝0.004]，并且对于p8观察到相似的增加[p＝0.091；调整的]，尽管不是统计显著的)(图4；表3A)。另一方面，针对以下观察到高得多的血清阳性率：重组结构域(例如DBL5ε：在2003-2005年为69％，在2010年为49％，以及在2011-2012年为55％)和非VAR2CSA抗原(例如MSP119：在2003-2005年为94％，在2010年为94％，以及在2011-2012年为87％)。通过血清阳性率来反映下降或增加的能力不被女性的HIV感染或胎次所改变(p-相互作用>0.05；唯一例外为胎次对针对MSP119的血清阳性率的作用)(表3A)。
通过qPCR评估的分娩时外周血和胎盘血中的恶性疟原虫阳性率在未感染HIV的女性中，在贝宁为41％，在加蓬为10％，并且在莫桑比克为6％；而在感染HIV的女性中，在肯尼亚为8％，并且在莫桑比克为3％。在未感染HIV的女性中，针对p5和p8的血清阳性率观察到相似的趋势：在贝宁分别为41％和42％；在加蓬分别为23％和25％；以及在莫桑比克分别为13％和16％(p<0.001，调整的)。在感染HIV的女性中，在肯尼亚针对p8的血清阳性率高于莫桑比克(17％对比9％；p<0.001，调整的)，但没有观察到针对p5的血清阳性率的差异(在肯尼亚和莫桑比克为6％；p＝0.894)。另一方面，在所有国家针对以下观察到高得多的血清阳性率：重组结构域(例如DBL5ε：在HIV未感染者中，在贝宁为89％，在加蓬为37％，并且在莫桑比克为45％；而在HIV感染者中，在肯尼亚为31％，并且在莫桑比克为36％)和非VAR2CSA抗原(例如MSP119：在HIV未感染者中，在贝宁为99％，在加蓬为84％，并且在莫桑比克为89％；而在HIV感染者中，在肯尼亚为88％，并且在莫桑比克为85％)。
表3B按国家示出了妊娠女性中恶性疟原虫的(血清)阳性率。
Figure BDA0002389344840000261
血清阳性率区分高疟疾传播(贝宁)和低疟疾传播(莫桑比克)的能力并不被胎次所改变，唯一的例外为HIV感染的女性中针对DBL3x的血清阳性率(表3B)。在莫桑比克(低传播)分娩时血清阳性率和qPCR阳性率之间的差异远高于贝宁(高传播)(图4E)。
此外，居住在未观察到疟疾感染的坦桑尼亚地区的妊娠女性(所有HIV未感染者)针对VAR2CSA抗原呈血清阴性，并且几乎一半的女性针对AMA1(42％)和MSP119(48％)呈血清阳性(图5；表3B)。
5.选择的VAR2CSA肽鉴定疟疾暴露的近期变化的性能
针对选择的肽的血清阳性率与在接受用MQ进行IPTp的未感染HIV的女性与接受SP的女性相比中观察到的暴露的减少相关(p<0.05)。表3C按间歇性预防治疗干预组示出了妊娠女性中恶性疟原虫的(血清)阳性率。
Figure BDA0002389344840000281
与接受安慰剂的感染HIV的女性相比，在接受MQ的感染HIV的女性中观察到了相似的差异，尽管不是统计显著的(图6；表3C)。贫血的未感染HIV的女性显示出针对选择的肽的血清阳性率比非贫血女性低(p<0.05)(图7)。
表3D按贫血状态示出了妊娠女性中恶性疟原虫的(血清)阳性率。
Figure BDA0002389344840000291
胎次不改变观察到的IPTp或贫血在血清阳性率中的作用(表3C和表3D)。总之，针对VAR2CSA重组结构域或针对非VAR2CSA抗原，均未观察到妊娠女性的IPTp干预组之间和贫血状态之间的血清阳性率差异。
6.选择的肽的表面暴露、表位预测和变异性
将p5和p8氨基酸区段映射到DBL1X-ID1的3D结构上显示，与较多暴露于表面的p8相比，p5位于蛋白表面上较少暴露的区域(图8A、图8B)。根据现有数据库记录，p5和p8中预测的B细胞表位对应于两种肽的较暴露的区域，在BepiPred中具有在75％和91％之间的特异性(图8C)。
结论
基于针对p5和p8的抗体的VAR2CSA血清学方法检测出a)疟疾随时间和空间的变化，b)IPTp干预产生的近期暴露的变化，c)在qPCR为阴性的坦桑尼亚地区的感染的不存在。此外，在妊娠女性中，基于p5和p8的血清阳性率与通过qPCR检测的感染的阳性率相似。该血清监测工具可以被用于产前诊所就诊的妊娠女性，以提供关于变化的信息，并监测消除活动导致的疟疾传播的不存在。

Claims (4)

1.一种诊断测试，所述诊断测试用于监测对妊娠女性特异性的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)感染，所述诊断测试包括检查来自所述妊娠女性的样品中针对VAR2CSA的抗体的存在。
2.如权利要求1所述的测试，其中所述样品包括血液样品。
3.如权利要求1或2所述的测试，其中所述检查所述样品包括测试所述样品中具有足够短的半衰期的抗体，以确定所述感染是否在当前妊娠期间发生。
4.如权利要求3所述的测试，其中所述抗体与p5和/或p8特异性结合。
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