CN111433601A - 制备具有规定的pH的水溶液的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了制备包含酸、碱和任选的一种或多种添加剂的具有规定的pH的水溶液的方法。该方法包括以下步骤：a)对于一系列不同的添加剂浓度，结合Debye Huckel理论使用Henderson‑Hasselbach方程计算溶液的酸和碱的理论浓度以具有所述规定的pH；b)对该系列的添加剂浓度，制备缓冲液样品，并测量每个添加剂浓度的实际pH；c)对于每个添加剂浓度，计算ΔpH的值，ΔpH是理论pH和实际pH之间的差；d)生成描述ΔpH与添加剂浓度的关系的数学模型；e)选择所述规定的pH和添加剂浓度；f)使用在步骤d)中生成的所述数学模型来计算对于所述规定的pH和添加剂浓度的ΔpH；g)通过将所述规定的pH和ΔpH相加来计算ΔpH校正的pH；h)结合Debye Huckel理论使用Henderson‑Hasselbach方程，使用所述ΔpH校正的pH计算酸和碱的浓度；i)使用步骤h)中计算的浓度制备溶液。
Description
本发明涉及制备水溶液，特别是缓冲溶液的方法。
缓冲溶液广泛应用于研究和制造两者中的许多工业中。虽然许多不同的缓冲溶液是可用的，但是这些溶液的关键参数是溶液的pH。由于许多缓冲溶液相对较稀，但可能需要相对较大的体积，并且进一步地，考虑到可能需要的缓冲液的范围，出于后勤原因，存储大量现成的缓冲溶液是不实际的。因此，希望能够计算给出给定pH的缓冲液组合物所需的组分比例，以便当需要这样的缓冲液时能够制备大量正确的缓冲液。虽然在基础水平上，这似乎是简单的事情，但是实际上所达到的实际pH通常不与理论一致，即使结合Debye Huckel理论使用标准Henderson-Hasselbach方程，或使用许多变体和修饰，所述变体和修饰经提出以补偿例如离子大小、离子电荷、缓冲液温度和特别是缓冲液添加剂（例如盐，特别是中性盐，离液剂，螯合剂，表面活性剂和碳水化合物）的性质和浓度的影响。已经提出了许多尝试来提供可靠的制备缓冲溶液的方法，例如WO2009/131524中提出的方法，以及其中承认的现有技术。
根据本发明的第一方面，提供了制备包含酸、碱和任选的一种或多种添加剂的具有规定的pH的水溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 对于一系列不同的添加剂浓度，结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程计算溶液的酸和碱的理论浓度以具有所述规定的pH；
b) 对该系列的添加剂浓度，制备缓冲液样品，并测量每个添加剂浓度的实际pH；
c) 对于每个添加剂浓度，计算ΔpH的值，ΔpH是理论pH和实际pH之间的差；
d) 生成描述ΔpH与添加剂浓度的关系的数学模型；
e) 选择所述规定的pH和添加剂浓度；
f) 使用在步骤d)中生成的所述数学模型来计算对于所述规定的pH和添加剂浓度的ΔpH；
g) 通过将所述规定的pH和ΔpH相加来计算ΔpH校正的pH；
h) 结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程，使用所述ΔpH校正的pH计算酸和碱的浓度；
i) 使用步骤h)中计算的浓度制备溶液。
应当认识到，在本发明第一方面的方法中，在一些实施方案中，步骤a)可以在步骤b)之前，以及在其它实施方案中，步骤b)可以在步骤a)之前进行。
根据本发明的第二方面，提供了制备包含酸、碱和任选的一种或多种添加剂的具有规定的pH的水溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 对于一系列不同的添加剂浓度，结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程计算溶液的酸、碱和添加剂的理论浓度以具有所述规定的pH；
b) 对于每个添加剂浓度，计算ΔpH的值，ΔpH是理论pH和实际pH值之间的差，优选地所述实际pH值是预先决定的值；
c) 生成描述ΔpH与添加剂浓度的关系的数学模型；
d) 选择所述规定的pH和添加剂浓度；
e) 使用在步骤c)中生成的所述数学模型来计算对于所述规定的pH和添加剂浓度的ΔpH；
f) 通过将所述规定的pH和ΔpH相加来计算ΔpH校正的pH；
g) 结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程，使用所述ΔpH校正的pH计算酸和碱的浓度；
h) 使用步骤g)中计算的浓度制备溶液。
根据本发明的第三方面，提供了制备包含酸、碱和添加剂的具有规定的pH的水溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程计算溶液的理论pH；
b) 通过将理论pH与从由数学模型确定的方程计算的pH值进行比较来计算水溶液的ΔpH校正的pH，所述数学模型是对于一系列添加剂浓度，水溶液的理论pH与实际pH值之间的差的数学模型，优选地所述实际pH值是预先决定的值；
c) 结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程，使用所述ΔpH校正的pH计算酸和碱的浓度；
d) 使用步骤c)中计算的浓度制备溶液。
可通过本发明的方法制备的水溶液最常见地是缓冲液，特别是在化学和生物技术领域中应用的缓冲液，并且最特别是在生物分子的处理中应用的缓冲液。可通过本发明的方法制备的缓冲液包括tris缓冲液[(三(羟甲基)氨基甲烷(“tris”)，与tris酸盐（例如tris.HCl）组合]；磷酸钠缓冲液(磷酸氢二钠作为碱，以及磷酸二氢钠作为酸)；磷酸钾缓冲液(磷酸氢二钾作为碱，以及磷酸二氢钾作为酸)；乙酸钠缓冲液(乙酸钠作为碱，以及乙酸作为酸；MES缓冲液(4-吗啉乙磺酸钠盐作为碱，以及4-吗啉乙磺酸作为酸)；以及HEPES缓冲液(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸钠盐作为碱，以及4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸作为酸)。
在处理生物分子的许多情况下，将溶液的pH选择为从3.5到9的范围。在许多实施方案中，将pH选择为在溶液的热力学pKa值的1个单位内。
可以存在于溶液中的添加剂是水溶性添加剂，并包括盐、离液剂、螯合剂、表面活性剂、溶剂和碳水化合物，它们的实例在化学和生物技术领域是众所周知的。可以存在两种或更多种添加剂的混合物。
可作为添加剂应用的盐包括中性盐，例如NaCl、KCl、Na2SO4和非中性盐，例如(NH4)2SO4和(NH4)3PO4。当盐作为添加剂应用时，它们通常以至多约5M，例如至多约2M的浓度应用。
可作为添加剂应用的离液剂包括尿素和盐酸胍。
可作为添加剂应用的螯合剂包括EDTA和EGTA。
可作为添加剂应用的表面活性剂特别包括非离子表面活性剂，例如烷基酚乙氧基化物，例如辛基酚乙氧基化物和壬基酚乙氧基化物，例如Triton(R) X100，和聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯80。
可作为添加剂应用的溶剂优选是水混溶性溶剂，并包括短链醇，例如甲醇、乙醇或异丙醇、乙腈、丙酮、二醇（例如乙二醇）和水混溶性聚(乙二醇)。
可作为添加剂应用的碳水化合物包括单糖，例如葡萄糖和果糖，以及寡糖，例如麦芽糖、乳糖和蔗糖。
离液剂、螯合剂、表面活性剂、溶剂和碳水化合物当存在时，通常以至多1M（例如至多500 mM，特别是至多250 mM，例如从1到100 mM）的浓度应用。
当水溶液应用于生物分子的处理中时，生物分子通常是多核苷酸或多肽，特别是重组多肽，其包括抗体和其它治疗性多肽。水溶液可应用于培养表达重组多肽的重组宿主细胞，特别是原核宿主细胞（例如大肠杆菌）和真核宿主细胞（例如CHO细胞）。水溶液特别常用于纯化在重组宿主细胞中表达的多肽。应当认识到，所述水溶液可以容易地应用于需要使用这样的水溶液的任何生物分子的分离、表达或纯化。
本发明的方法中应用的添加剂浓度范围和该范围内数据点的数量由使用者自行选择。在许多实施方案中，将最小添加剂浓度选择为低于目标溶液的添加剂浓度，并且将最大添加剂浓度选择为高于目标溶液的添加剂浓度。在某些实施方案中，本发明可应用于不含添加剂的水溶液，在这种情况下，最小添加剂浓度为零或高于目标溶液所期望的添加剂浓度，例如高于其不超过1 mM。
在许多情况下，添加剂浓度范围内的数据点的数量小于20，经常至多15，例如从5到10。
在某些实施方案中，将数据点选择为在添加剂浓度范围的下端比在该范围的上端更密切间隔。在一些情况下，至多约80%的数据点位于浓度范围的最低的25%中。在某些情况下，数据点之间的间隔通过选择范围中的最低浓度A，选择范围中的下一最低浓度B，从B中减去A，将差乘以2以计算与第三浓度的间隔以及通过将该间隔与B相加来计算C而计算。可以使用浓度C和B重复该过程，以计算所选范围内期望数量的数据点的第四数据点的浓度D等。
在其他实施方案中，数据点均匀地分布在数据范围上。
在一些实施方案中，本发明的方法可以对一系列不同浓度的给定酸和碱重复，并且生成的数据可以用于生成相对于酸和碱浓度和添加剂浓度，pH的变化的数学模型。然后，可以应用该数学模型计算其它浓度的那些酸、碱和添加剂的溶液组成，优选浓度在生成数据所应用的范围内，所述数据是用于生成数学模型的数据。
本发明的方法中应用的Henderson-Hasselbach方程通常表达为pH = pKa + log([A-]/[HA])，其中[A-]是溶液中碱组分的摩尔浓度，以及[HA]是溶液中酸组分的摩尔浓度。
Debye Huckel理论方程的任何变化都可以在本发明中应用。在许多实施方案中，所应用的方程如下。
在Henderson-Hasselbach方程中所用的pKa值优选地使用以下方程对除25℃以外的温度进行校正，pKaT：
pKaT = pKa + (dpKa/dT) x (T-25)，其中pKa是热力学pKa，并且所用的dpKa/dT的值使用本领域已知的方法计算，或选自公开文献，并且T是以℃为单位的温度。
所用的pKa值是Debye-Huckel修饰的pKa (pKa’)，其通过以下方程计算：
Debye-Huckel参数A由以下方程计算：
A = (0.4918 + 0.0006614 T+ 0.000004975 T2)，其中T是以℃为单位的温度。
离子强度I可以仅考虑添加剂的离子强度来计算，并计算以下方程：
应当认识到，由于修饰的pKa (pKa’或温度校正的pKaT’)的值依赖于离子强度，并且离子强度还取决于酸和碱的浓度，使用Debye-Huckel和Henderson-Hasselbach方程计算浓度以达到给定的pH涉及迭代计算修饰的pKa的值。重复该迭代计算，直到修饰的pKa的值小于预先决定的与修饰的pKa的先前计算的迭代的差为止。在许多情况下，将该差选择为<0.01，例如<0.001，并且优选地<0.0001。满足该差参数的修饰的pKa的值是应用于计算溶液的酸和碱浓度的值。
迭代计算过程的实例如下：
a) 使用以下方程计算温度校正的pKa (pKaT)：
pKaT = (pKa + (dpKa/dt * (T-25)))
b) 使用以下方程计算添加剂离子强度Iadd：
c) 使用步骤a)中计算的pKaT的值，使用以下方程计算对于给定的pH，由于酸和碱所致的离子强度Ib：
因此
；
并因此
；
因此
；
酸比例=酸抗衡离子比例= 
碱比例=碱抗衡离子比例= 
d) 使用由于酸、碱和添加剂所致的组合离子强度Isum = (Ib + Iadd)计算温度校正的Debye Huckel修饰的pKaT’
A = (0.4918 + 0.0006614 T+ 0.000004975 T2
e) 返回到步骤c)并再次计算离子强度，但这次用步骤d)中计算的改进的pKaT’值；
f) 再次用来自步骤e)的新的离子强度重新计算温度校正的Debye Huckel修饰的pKaT’值。
g) 重复步骤e)和f)直到收敛pKaT’的值与先前迭代中pKaT’的值的差<0.0001
h) 基于步骤g)中得到的pKaT’值，用以下方程确定酸碱比
酸比例=酸抗衡离子比例= 
碱比例=碱抗衡离子比例= 
描述ΔpH与添加剂浓度的关系的数学模型可以通过本领域已知的方法例如回归分析、机器学习或人工智能生成。
在许多优选的实施方案中，选择溶液的温度为在从10到30℃的范围内。在某些情况下，选择温度为在从12到25℃的范围内，例如18 +/- 5℃。
在许多优选的实施方案中，溶液具有至多1M，例如至多0.5M，例如至多250mM，优选至多150mM的酸和碱的浓度。在许多优选的实施方案中，溶液的浓度为从5到100 mM，例如从10到75 mM，例如25到50 mM。在进一步优选的实施方案中，溶液具有在至多3M，特别是至多2M的范围，例如在0.1 mM到1M的范围的NaCl或KCl浓度。在其它实施方案中，当添加剂是硫酸铵时，添加剂可以以至多约3到4M的浓度存在。在进一步的实施方案中，当添加剂是尿素或盐酸胍时，添加剂可以以至多约7M的浓度存在。
在一个特别优选的实施方案中，溶液是磷酸盐缓冲液，特别是磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，其浓度为10到100 mM。在另一个特别优选的实施方案中，溶液是乙酸盐缓冲液，特别是乙酸/乙酸钠缓冲液，其浓度为10到250 mM。在另一个特别优选的实施方案中，溶液是MES缓冲液，特别是4-吗啉乙磺酸/4-吗啉乙磺酸钠盐缓冲液，其浓度为10到100 mM。在另外特别优选的实施方案中，溶液是HEPES缓冲液，特别是4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸/4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸钠盐作为碱和作为酸的缓冲液，其浓度为10到100 mM。在另外特别优选的实施方案中，溶液是tris缓冲液，特别是与tris.HCl组合的tris缓冲液，其浓度为10到250 mM。在上述各特别优选的实施方案中，各溶液可另外包含至多1M的盐，该盐选自NaCl和KCl中的一种或两种。
本发明的方法可应用于制备溶液，该溶液用于其中需要规定的组成的溶液的任何应用，例如在高通量筛选、色谱法、超滤、渗滤、病毒过滤、DNA纯化、药物产品配制、制造和实验室研究中。该方法特别适用于生物分子的处理，例如用于生物制品（特别是重组蛋白）的制造和纯化有关的用途。
在许多优选的实施方案中，使用适当编程的计算机来进行以下计算：结合DebyeHuckel理论使用Henderson-Hasselbach方程的酸和碱浓度的计算以得到规定的pH；ΔpH的计算；ΔpH相对于添加剂浓度的回归分析的计算；ΔpH校正的pH的计算；以及使用ΔpH校正的pH结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程的酸和碱的浓度的计算。
在许多实施方案中，将计算机程序连接到用户界面，通常是图形用户界面，例如电子表格、网页界面或数据输入表格中的表，其中操作者可以输入期望的缓冲液的细节。这样的数据输入可包含从下拉菜单中选择酸、碱、缓冲液添加剂、pH、缓冲液的体积和缓冲液温度中的一种或多种的性质。
在某些实施方案中，当输入到数据输入中的数据落在已对其将数据输入到数据表中的一个或多个参数的范围之外时，计算机程序在用户界面中提供警报。在一些情况下，警报之一是警告，即所选pH在缓冲液的热力学pKa的所选范围之外，例如在热力学pKa的+/- 1的范围之外。如果将温度选择为在给定范围之外，例如大于约50℃，或者酸和碱的浓度在给定范围之外，例如浓度太低而不能提供有意义的缓冲溶液，则可以提供警报。
在优选的实施方案中，计算机程序向用户界面（通常是图形用户界面）提供输出，操作者可以从该界面读取制备期望的溶液所需的酸、碱和缓冲液添加剂的量。在某些非常优选的实施方案中，用户界面是HTML图形用户界面，例如HTML表格。合适的计算机程序的实例在本领域中是众所周知的，诸如Python、Java、C、C++和C#。
用于进行本发明第一方面的步骤a)和c)至h)；本发明第二方面的步骤a)至g)；或本发明第三方面的步骤a)至c)的设备（例如适当编程的计算机）形成了本发明的进一步的方面。
本发明的另一方面包含用于进行本发明第一方面的步骤a)和c)至h)；本发明第二方面的步骤a)至g)；或本发明第三方面的步骤a)至c)的计算机程序。
在进一步的方面，提供了制备水溶液的设备，其包含能够将酸和碱、一种或多种添加剂和任选的稀释剂(通常为水)进料到混合装置的计量装置，其中酸、碱和添加剂的比例通过根据本发明的第一、第二或第三方面的方法确定。优选地，酸、碱和一种或多种添加剂以溶液的形式提供给计量装置。混合装置可提供溶液至储存容器以供将来使用，或可直接提供溶液以使用，例如提供至处理设备，特别是生物处理设备，其包括色谱法、病毒灭活、过滤、重折叠、超滤、渗滤、微滤、在线调节和重折叠设备。在一些实施方案中，计量装置可操作地连接到设备（例如适当编程的计算机），并在设备的控制下操作，用于进行本发明第一方面的步骤a)和c)至h)；本发明第二方面的步骤a)至g)；或本发明第三方面的步骤a)至c)。在一些进一步的实施方案中，控制设备（例如适当编程的计算机）被整合到包含计量装置，并且优选还包含混合装置的设备中。计量装置优选包含调节通过计量装置的流量的可变流量（优选间歇流量）入口阀。最优选地，计量装置包含多个入口流量控制器，其包含至少2个入口阀，并且在许多情况下包含至多8个，例如3、4、5、6或7个入口阀。入口阀各自可以具有相同的尺寸，或者一个或多个入口阀可以具有不同的尺寸。在某些优选的实施方案中，从每个入口阀到流量控制器的出口测量的体积对于每个入口是相同的，并且非常优选的是，从每个入口阀到流量控制器的出口测量的体积和路径长度两者对于每个入口都是相同的。计量装置有利地包含位于多个入口流量控制器下游，并且最优选位于混合装置（特别是静态混合装置）上游的泵。在某些实施方案中，来自混合装置的输出由一个或多个传感器（例如pH、电导率或流量计）监测。
本发明通过以下实施例进行说明，而没有限制。
实施例1
磷酸盐缓冲液的制备
制备了具有一系列不同NaCl浓度(0、100、250、500、1000、2000 mM)和一系列不同缓冲液浓度(10、25、50、100 mM)的一系列磷酸盐缓冲液，每种情况下目标pH在20℃的温度下为pH7.0。首先结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程计算达到这些值的酸和碱的浓度。根据这些值，使用各缓冲液成分的浓缩的储备液，200mM磷酸二氢钠(酸)、200mM磷酸氢二钠(碱)和5M氯化钠，制备溶液。所用的浓度和量在下表1中给出。
表1
| 缓冲液浓度(mM) | 碱(mM) | 酸(mM) | 盐浓度(mM) | 储液碱(mL) | 储液酸(mL) | 储液5M盐体积(mL) | 水体积(mL) | |
| 1 | 10 | 4.81 | 5.19 | 0 | 2.4 | 2.6 | 0 | 95.0 |
| 2 | 25 | 13.25 | 11.75 | 0 | 6.6 | 5.9 | 0 | 87.5 |
| 3 | 50 | 28.69 | 21.31 | 0 | 14.3 | 10.7 | 0 | 75.0 |
| 4 | 100 | 61.7 | 38.3 | 0 | 30.9 | 19.2 | 0 | 50.0 |
| 5 | 10 | 5.81 | 4.19 | 100 | 2.9 | 2.1 | 2 | 93.0 |
| 6 | 25 | 14.9 | 10.1 | 100 | 7.5 | 5.1 | 2 | 85.5 |
| 7 | 50 | 30.7 | 19.3 | 100 | 15.4 | 9.7 | 2 | 73.0 |
| 8 | 100 | 63.54 | 36.46 | 100 | 31.8 | 18.2 | 2 | 48.0 |
| 9 | 10 | 6.27 | 3.73 | 250 | 3.1 | 1.9 | 5 | 90.0 |
| 10 | 25 | 15.82 | 9.18 | 250 | 7.9 | 4.6 | 5 | 82.5 |
| 11 | 50 | 31.98 | 18.02 | 250 | 16.0 | 9.0 | 5 | 70.0 |
| 12 | 100 | 64.77 | 35.23 | 250 | 32.4 | 17.6 | 5 | 45.0 |
| 13 | 10 | 6.49 | 3.51 | 500 | 3.2 | 1.8 | 10 | 85.0 |
| 14 | 25 | 16.25 | 8.75 | 500 | 8.1 | 4.4 | 10 | 77.5 |
| 15 | 50 | 32.53 | 17.47 | 500 | 16.3 | 8.7 | 10 | 65.0 |
| 16 | 100 | 64.95 | 35.05 | 500 | 32.5 | 17.5 | 10 | 40.0 |
| 17 | 10 | 6.37 | 3.63 | 1000 | 3.2 | 1.8 | 20 | 75.0 |
| 18 | 25 | 15.87 | 9.13 | 1000 | 7.9 | 4.6 | 20 | 67.5 |
| 19 | 50 | 31.55 | 18.45 | 1000 | 15.8 | 9.2 | 20 | 55.0 |
| 20 | 100 | 62.27 | 37.73 | 1000 | 31.1 | 18.9 | 20 | 30.0 |
| 21 | 10 | 5.42 | 4.58 | 2000 | 2.7 | 2.3 | 40 | 55.0 |
| 22 | 25 | 13.45 | 11.55 | 2000 | 6.7 | 5.8 | 40 | 47.5 |
| 23 | 50 | 26.59 | 23.41 | 2000 | 13.3 | 11.7 | 40 | 35.0 |
| 24 | 100 | 51.94 | 48.06 | 2000 | 26.0 | 24.0 | 40 | 10.0 |
测量表中给出的制备的缓冲液在20℃下的pH值，并计算与理论值的差作为ΔpH。结果在下表2中给出。
表2
| 测量的pH | ΔpH | |
| 1 | 7.03 | 0.03 |
| 2 | 7.02 | 0.02 |
| 3 | 7.02 | 0.02 |
| 4 | 7.02 | 0.02 |
| 5 | 6.93 | -0.07 |
| 6 | 6.95 | -0.05 |
| 7 | 6.95 | -0.05 |
| 8 | 6.96 | -0.04 |
| 9 | 6.85 | -0.15 |
| 10 | 6.87 | -0.13 |
| 11 | 6.88 | -0.12 |
| 12 | 6.87 | -0.13 |
| 13 | 6.72 | -0.28 |
| 14 | 6.74 | -0.26 |
| 15 | 6.75 | -0.25 |
| 16 | 6.73 | -0.27 |
| 17 | 6.51 | -0.49 |
| 18 | 6.5 | -0.5 |
| 19 | 6.5 | -0.5 |
| 20 | 6.48 | -0.52 |
| 21 | 6.03 | -0.97 |
| 22 | 6.03 | -0.97 |
| 23 | 6.02 | -0.98 |
| 24 | 5.99 | -1.01 |
ΔpH (y)的值相对于盐浓度(x)的线性回归分析生成方程(1)：
y = -0.0005x
应用方程(1)计算下表3中给出的各磷酸盐缓冲液A、B、C和D的盐浓度的ΔpH值，并使用如此计算的ΔpH值计算各缓冲液的ΔpH校正的pH。
然后结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程，应用每种盐浓度的ΔpH校正的pH来计算酸、碱和盐的浓度以达到这些值，并且浓度也在表3中给出。
表3
| 目标pH | 缓冲液浓度(mM) | 碱(mM) | 酸(mM) | 盐浓度(mM) | 储液碱(mL) | 储液酸(mL) | 5M盐体积(mL) | 水(mL) | |
| A | 7.0 | 20 | 11.58 | 8.42 | 50 | 5.8 | 4.2 | 1 | 89.0 |
| B | 7.0 | 60 | 48.62 | 11.38 | 750 | 24.3 | 5.7 | 15 | 55.0 |
| C | 6.5 | 50 | 25.57 | 24.43 | 500 | 12.8 | 12.2 | 10 | 65.0 |
| D | 7.5 | 25 | 21.05 | 3.95 | 100 | 10.5 | 2.0 | 2 | 85.5 |
使用表3中给出的量的储液酸、碱和盐溶液（其用于生成表1中的数据）制备缓冲液，并在20℃下测量获得的pH值。所达到的pH值在表4中给出。
表4
| 测量的pH | 目标pH | |
| A | 7.07 | 7.0 |
| B | 7.03 | 7.0 |
| C | 6.47 | 6.5 |
| D | 7.52 | 7.5 |
所有pH值都在目标值的+/- 0.1 pH单位的范围内，这表明本发明的方法的高准确度。
实施例2
乙酸盐缓冲液的制备
制备了具有一系列不同NaCl浓度(0、100、250、500、1000、2000 mM)和一系列不同缓冲液浓度(10、25、50、100 mM)的一系列乙酸盐缓冲液，每种情况下目标pH在20℃的温度下为pH4.5。首先结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程计算达到这些值的酸和碱的浓度。根据这些值，使用各缓冲液成分的浓缩的储备液，200mM乙酸 (酸)、200mM乙酸钠(碱)和5M氯化钠，制备溶液。所用的浓度和量在下表5中给出。
表5
| 缓冲液浓度(mM) | 碱(mM) | 酸(mM) | 盐浓度(mM) | 碱(mL) | 酸(mL) | 5M盐体积(mL) | 水(mL) | |
| 1 | 10 | 3.69 | 6.31 | 0 | 1.8 | 3.2 | 0 | 95.0 |
| 2 | 25 | 9.44 | 15.56 | 0 | 4.7 | 7.8 | 0 | 87.5 |
| 3 | 50 | 19.31 | 30.69 | 0 | 9.7 | 15.3 | 0 | 75.0 |
| 4 | 100 | 39.75 | 60.25 | 0 | 19.9 | 30.1 | 0 | 50.0 |
| 5 | 10 | 4.16 | 5.84 | 100 | 2.1 | 2.9 | 2 | 93.0 |
| 6 | 25 | 10.42 | 14.58 | 100 | 5.2 | 7.3 | 2 | 85.5 |
| 7 | 50 | 20.94 | 29.06 | 100 | 10.5 | 14.5 | 2 | 73.0 |
| 8 | 100 | 42.21 | 57.79 | 100 | 21.1 | 28.9 | 2 | 48.0 |
| 9 | 10 | 4.33 | 5.67 | 250 | 2.2 | 2.8 | 5 | 90.0 |
| 10 | 25 | 10.85 | 14.15 | 250 | 5.4 | 7.1 | 5 | 82.5 |
| 11 | 50 | 21.73 | 28.27 | 250 | 10.9 | 14.1 | 5 | 70.0 |
| 12 | 100 | 43.58 | 56.42 | 250 | 21.8 | 28.2 | 5 | 45.0 |
| 13 | 10 | 4.42 | 5.58 | 500 | 2.2 | 2.8 | 10 | 85.0 |
| 14 | 25 | 11.06 | 13.94 | 500 | 5.5 | 7.0 | 10 | 77.5 |
| 15 | 50 | 22.12 | 27.88 | 500 | 11.1 | 13.9 | 10 | 65.0 |
| 16 | 100 | 44.26 | 55.74 | 500 | 22.1 | 27.9 | 10 | 40.0 |
| 17 | 10 | 4.38 | 5.62 | 1000 | 2.2 | 2.8 | 20 | 75.0 |
| 18 | 25 | 10.96 | 14.04 | 1000 | 5.5 | 7.0 | 20 | 67.5 |
| 19 | 50 | 21.9 | 28.1 | 1000 | 11.0 | 14.1 | 20 | 55.0 |
| 20 | 100 | 43.75 | 56.25 | 1000 | 21.9 | 28.1 | 20 | 30.0 |
| 21 | 10 | 4.07 | 5.93 | 2000 | 2.0 | 3.0 | 40 | 55.0 |
| 22 | 25 | 10.16 | 14.84 | 2000 | 5.1 | 7.4 | 40 | 47.5 |
| 23 | 50 | 20.3 | 29.7 | 2000 | 10.2 | 14.9 | 40 | 35.0 |
| 24 | 100 | 40.51 | 59.49 | 2000 | 20.3 | 29.7 | 40 | 10.0 |
测量表中给出的制备的缓冲液在20℃下的pH值，并计算与理论值的差作为ΔpH。结果在下表6中给出。
表6
| 测量的pH | ΔpH | |
| 1 | 4.48 | -0.03 |
| 2 | 4.48 | -0.04 |
| 3 | 4.49 | -0.03 |
| 4 | 4.5 | -0.03 |
| 5 | 4.46 | -0.07 |
| 6 | 4.45 | -0.08 |
| 7 | 4.45 | -0.07 |
| 8 | 4.46 | -0.06 |
| 9 | 4.45 | -0.08 |
| 10 | 4.42 | -0.11 |
| 11 | 4.43 | -0.1 |
| 12 | 4.44 | -0.09 |
| 13 | 4.39 | -0.17 |
| 14 | 4.38 | -0.15 |
| 15 | 4.39 | -0.14 |
| 16 | 4.4 | -0.13 |
| 17 | 4.34 | -0.24 |
| 18 | 4.32 | -0.23 |
| 19 | 4.33 | -0.23 |
| 20 | 4.34 | -0.21 |
| 21 | 4.2 | -0.39 |
| 22 | 4.2 | -0.37 |
| 23 | 4.2 | -0.36 |
| 24 | 4.22 | -0.37 |
ΔpH (y)的值相对于盐浓度(x)的线性回归分析生成方程(1)：
Y = -0.0002x - 0.0516
应用方程(1)计算下表7中给出的各缓冲液E至M的盐浓度的ΔpH值，并使用如此计算的ΔpH值计算各缓冲液的ΔpH校正的pH。
然后结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程，应用每种盐浓度的ΔpH校正的pH来计算酸、碱和盐的浓度以达到这些值，并且浓度也在表7中给出。
表7
| 目标pH | 缓冲液浓度(mM) | 碱(mM) | 酸(mM) | 盐浓度(mM) | 碱(mL) | 酸(mL) | 5M盐体积(mL) | 水(mL) | |
| E | 4.5 | 20 | 8.66 | 11.34 | 50 | 4.3 | 5.7 | 1 | 89.0 |
| F | 4.5 | 60 | 32.51 | 27.49 | 750 | 16.3 | 13.7 | 15 | 55.0 |
| G | 4.0 | 50 | 12.72 | 37.28 | 500 | 6.4 | 18.6 | 10 | 65.0 |
| H | 5.0 | 25 | 18.09 | 6.91 | 100 | 9.0 | 3.5 | 2 | 85.5 |
制备具有表7中给出的浓度的缓冲液，并在20℃下测量pH。所达到的pH值在表8中给出。
表8
| 测量的pH | 目标pH | |
| E | 4.47 | 4.5 |
| F | 4.44 | 4.5 |
| G | 3.93 | 4.0 |
| H | 4.98 | 5.0 |
所有pH值都在目标值的+/- 0.1 pH单位的范围内，这表明本发明的方法的高准确度。
Claims (14)
1.制备包含酸、碱和任选的一种或多种添加剂的具有规定的pH的水溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 对于一系列不同的添加剂浓度，结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程计算溶液的酸和碱的理论浓度以具有所述规定的pH；
b) 对该系列的添加剂浓度，制备缓冲液样品，并测量每个添加剂浓度的实际pH；
c) 对于每个添加剂浓度，计算ΔpH的值，ΔpH是理论pH和实际pH之间的差；
d) 生成描述ΔpH与添加剂浓度的关系的数学模型；
e) 选择所述规定的pH和添加剂浓度；
f) 使用在步骤d)中生成的所述数学模型来计算对于所述规定的pH和添加剂浓度的ΔpH；
g) 通过将所述规定的pH和ΔpH相加来计算ΔpH校正的pH；
h) 结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程，使用所述ΔpH校正的pH计算酸和碱的浓度；
i) 使用步骤h)中计算的浓度制备溶液。
2.制备包含酸、碱和任选的一种或多种添加剂的具有规定的pH的水溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 对于一系列不同的添加剂浓度，结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程计算溶液的酸、碱和添加剂的理论浓度以具有所述规定的pH；
b) 对于每个添加剂浓度，计算ΔpH的值，ΔpH是理论pH和实际pH值之间的差，优选地所述实际pH值是预先决定的值；
c) 生成描述ΔpH与添加剂浓度的关系的数学模型；
d) 选择所述规定的pH和添加剂浓度；
e) 使用在步骤c)中生成的所述数学模型来计算对于所述规定的pH和添加剂浓度的ΔpH；
f) 通过将所述规定的pH和ΔpH相加来计算ΔpH校正的pH；
g) 结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程，使用所述ΔpH校正的pH计算酸和碱的浓度；
h) 使用步骤g)中计算的浓度制备溶液。
3.制备包含酸、碱和添加剂的具有规定的pH的水溶液的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程计算所述溶液的理论pH；
b) 通过将理论pH与从由数学模型确定的方程计算的pH值进行比较来计算所述水溶液的ΔpH校正的pH，所述数学模型是对于一系列添加剂浓度，水溶液的理论pH与实际pH值之间的差的数学模型，优选地所述实际pH值是预先决定的值；
c) 结合Debye Huckel理论使用Henderson-Hasselbach方程，使用所述ΔpH校正的pH计算酸和碱的浓度；
d) 使用步骤c)中计算的浓度制备溶液。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述水溶液是缓冲液，优选应用于处理生物分子的缓冲液。
5.根据权利要求4的方法，其中所述缓冲液选自tris缓冲液、磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、乙酸钠缓冲液、MES缓冲液和HEPES缓冲液。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述添加剂为选自NaCl、KCl、Na2SO4、(NH4)2SO4和(NH4)3PO4的盐及其混合物。
7.根据权利要求7的方法，其中所述盐的浓度至多为约2M。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将该系列的添加剂浓度的最小添加剂浓度选择为低于待制备的水溶液的添加剂浓度，并且将该系列的添加剂浓度的最大添加剂浓度选择为高于待制备的水溶液的添加剂浓度。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在该系列的添加剂浓度内的数据点的数量为从5至10。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述规定的pH选择为在溶液的热力学pKa值的1个单位内。
11.制备水溶液的设备，其包含能够将酸和碱、一种或多种添加剂和任选的稀释剂进料到混合装置的计量装置，其中所述计量装置在控制设备的控制下操作以进行权利要求1的步骤a)和c)至h)、权利要求2的步骤a)至g)、或权利要求3的步骤a)至c)。
12.根据权利要求11的设备，并且进一步包含用于进行生物处理操作的工具。
13.根据权利要求12的设备，其中所述生物处理操作包含色谱法、病毒灭活、过滤、重折叠、超滤、渗滤、微滤、在线调节或重折叠。
14.根据权利要求11至13中任一项的设备，其中所述计量装置包含位于多入口流量控制器下游并且位于混合装置上游的泵。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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