CN111402954A - 一种辨识与预测空间辐射损伤防护药靶相关人类基因的方法 - Google Patents

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CN111402954A CN201910001278.3A CN201910001278A CN111402954A CN 111402954 A CN111402954 A CN 111402954A CN 201910001278 A CN201910001278 A CN 201910001278A CN 111402954 A CN111402954 A CN 111402954A
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Abstract

本发明公开了一种辨识与预测空间辐射损伤防护药靶相关人类基因的方法。该方法包括如下步骤：对人细胞进行辐射，得到辐射前组、辐射后组和药物处理组；建立基因表达谱并进行整合，选取辐射后组与辐射前组相比，药物处理组与辐射后组相比表达量均发生变化且调节方向相反的基因；从中辨识差异表达基因激活子网，选取子网中与辐射后组相比，药物处理组表达量差异倍数在2以上的基因。本发明从表达谱和网络分析角度辨识与空间辐射损伤防护相关的关键基因，以此为基础可建立系统完整的药物筛选与评价体系，通过计算方法对药物发现方案进行理性设计，为大规模实验筛选提供线索，降低成本，使空间辐射损伤防护药物研发进入理性设计和实验筛选相结合阶段。

Description

一种辨识与预测空间辐射损伤防护药靶相关人类基因的方法
技术领域
本发明属于空间辐射物理与辐射损伤防护领域，具体涉及一种辨识与预测空间辐射损伤防护药靶相关人类基因的方法。
背景技术
空间辐射严重危害航天员健康，是制约人类空间探索的重要因素之一。在飞船交互对接、航天员出舱活动、空间站在轨建设运行和长期载人飞行等任务的完成过程中，航天员面临连续暴露于复杂空间辐射环境的健康危害。空间辐射可能引起放射性白内障，促进阿尔茨海默氏病的发展和动脉粥样硬化，导致血管损伤，增加多种癌症和心脑血管疾病的风险。高剂量空间辐射甚至可能导致急性放射损伤和急性放射病的发生。空间辐射中含有一定比例的生物效应更强的重离子成分，具有高能量、强穿透力、高电荷等特点，更容易穿透一般的物理防护材料，辐射威胁高于其它射线。为保障航天员健康高效工作，需进一步提升对空间辐射，尤其是其中重离子成分的认识与医学防护技术。
目前已经发现一些化合物可能降低空间辐射的有害生物效应对人体健康的影响。比如抗氧化剂对辐射危险因素具有一定的防护效能，如抗氧化剂MitoQ在电离辐射暴露期间可有效清除自由基、活性氧，减轻分子损伤，改善细胞应答。烟酸(维生素B3)、硫胺(维生素B1)、辅酶Q10和硒等药物可阻止或减轻航天飞行中的各种电离辐射引起的生物损伤效应。其次，激素类化合物如临床用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌的他莫昔芬可以抑制重离子诱导的癌效应，具有类似作用的化合物还有视黄苷酸醋酸盐。一些蛋白酶抑制剂也可抑制射线引起的有害效应，例如金属蛋白酶抑制剂ilomastat通过促进血液和免疫细胞的恢复提高辐射后实验动物的存活率。包曼-伯克(Bowman-Birk)型大豆蛋白酶抑制剂在抑制癌扩散中特别有效，有望成为抑制重离子和质子诱导的癌效应的有效药物。此外，针对γ射线、X射线和中子射线已开发出一些防护药物，主要包括胱胺、半胱胺、取代四氢噻唑衍生物、中草药和植物提取物如芦荟多糖、灵芝多糖、猴菇多糖等。尽管如此，目前尚缺乏特异对抗空间辐射损伤有效的药物防护技术。
现有抗空间辐射药物及其研发技术存在如下缺陷：采用细胞因子、激素和食物核苷酸对空间辐射相关疾病进行治疗效果非常有限，且对航天员来说不便于使用。他莫西芬和视黄苷酸醋酸盐具有较为明显的毒性和副作用。而针对γ射线、X射线和中子射线具有较好疗效的药物，尚缺乏它们对重离子辐射损伤防护效应的系统性评价研究。其他具有抗辐射损伤作用的化合物普遍存在药物品种少、疗效有限、毒副作用较大、作用机理不明确等问题。另一方面，传统的药物筛选技术存在研发周期漫长、耗资巨大、风险较高、成功率很低的问题。因此，对于空间辐射，至今仍缺乏安全有效的特异性防护剂和成熟高效的药物筛选研发技术平台。
近年来，系统生物学、网络药理学的快速发展为特异对抗空间辐射药物的研发提供了新的思路。随着计算生物学和大数据分析的兴起，可用于药靶发现的数据库资源迅速增加，比如OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、TTD(Therapeutic TargetDatabase)、DrugBank和GEO(Gene Expression Omnibus)等。此外，高通量测序技术、网络分析技术和多种组学快速发展，为药靶辨识与药物研发提供了新途径和新方案，为基于系统生物学和网络药理学的药物开发提供了新技术和新策略。
发明内容
为了有效地解决上述问题，本发明旨在建立一种基于基因表达谱和激活子网辨识算法的精确识别空间辐射中重离子辐射损伤防护药靶相关基因的方法，从而为特异对抗空间辐射药物的筛选奠定坚实的基础。
第一方面，本发明要求保护一种筛选潜在空间辐射损伤防护相关人类基因的方法。
本发明所提供的筛选潜在空间辐射损伤防护相关人类基因的方法可包括如下步骤：
(a)用现有辐射损伤防护药物对人类靶细胞进行处理，药物处理后进行模拟空间辐射，得到如下三组细胞：辐射前组，即未经所述辐射损伤防护药物处理且未进行所述模拟空间辐射的所述人类靶细胞；辐射后组，即未经所述现有辐射损伤防护药物处理但进行了所述模拟空间辐射的所述人类靶细胞；药物处理组，即经所述现有辐射损伤防护药物处理且进行了所述模拟空间辐射的所述人类靶细胞；
(b)针对步骤(a)中的三组细胞分别建立各自的基因表达谱；
(c)对步骤(b)所建立的三组细胞的基因表达谱进行整合分析，将整合所得全部基因映射于人类蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络上，从能够映射到所述人类蛋白质相互作用网络上的基因中选取所述辐射后组与所述辐射前组相比，所述药物处理组与所述辐射后组相比表达量均发生变化且表达量调节方向相反的基因；
(d)从步骤(c)中所选取的基因中辨识与所述辐射后组相比，所述药物处理组显著差异表达基因激活子网；
(e)从步骤(d)所得显著差异表达基因激活子网中选取与所述辐射后组相比，所述药物处理组的表达量差异倍数在2以上(不包括2)的基因，即为最终筛选所得的潜在空间辐射损伤防护相关人类基因。
进一步地，步骤(a)中，所述人类靶细胞可为正常人淋巴母细胞、正常人外周血细胞等对辐射敏感的细胞。在本发明的具体实施方式中，所述人类靶细胞具体为正常人淋巴母细胞AHH-1。
进一步地，步骤(a)中，所述模拟空间辐射可为重离子辐射或γ射线辐射。所述重离子辐射可为碳离子辐射。在本发明的具体实施方式中，所述碳离子辐射具体为0.5Gy和2Gy剂量碳离子(12C)照射，所述照射的时间具体根据辐射剂量率而定。
进一步地，步骤(a)中，所述现有辐射损伤防护药物可为已上市或实验中确认的对电离辐射损伤具有防护作用的化合物，如适应症中包含“急性放射病治疗、肿瘤放疗副作用治疗”等的药物。在本发明的具体实施方式中，所述现有辐射损伤防护药物具体为尼尔雌醇(523)或2-溴-异香兰素(VND3207)。相应的，采用所述现有辐射损伤防护药物(523或VND3207)在照射前0.5h处理所述人类靶细胞。具体的，将药物处理组的AHH-1细胞接种于96孔板，每孔200μl细胞悬液(4×103个细胞)，照射前0.5h加入辐射损伤防护药物(523或VND3207)。
进一步地，步骤(b)中，可按照包括如下步骤的方法针对所述三组细胞分别建立各自的基因表达谱：以所述三组细胞的cDNA分子为样本，利用人类全基因组表达芯片获得所述三组细胞的基因表达种类和表达量数据。在本发明的具体实施方式中，所述人类全基因组表达芯片具体为illumina生产的基因芯片，货号为BD-103-0204。
进一步地，步骤(c)中，可按照如下原则对所述三组细胞的基因表达谱进行整合分析：
(c1)对于所述辐射前组进行两组平行重复实验，去除两组P值均大于0.05的基因，要求所述辐射前组的两组平行重复实验的基因表达量至少有一个大于0，否则去除该基因；
对于所述辐射后组进行两组平行重复实验，去除两组P值均大于0.05的基因，要求所述辐射后组的两组平行重复实验的基因表达量至少有一个大于0，否则去除该基因；
对于所述药物处理组进行两组平行重复实验，去除两组P值均大于0.05的基因，要求所述药物处理组的两组平行重复实验的基因表达量至少有一个大于0，否则去除该基因；
所述P值是在一组实验中对同一个基因的表达量进行多次重复实验测量所得数据计算得到的P值。在本发明的具体实施例中，所述P值是在一组实验中对同一个基因的表达量进行3次重复实验测量所得数据计算得到的P值；
(c2)去除不含有GeneSymbol信息的人类基因；
确定是否含有GeneSymbol信息的方法具体如下：如果某基因的ID不是GeneSymbol，运用The Database for Annotation，Visualization and IntegratedDiscovery(DAVID)v6.7在线工具中的Gene ID Conversion进行转化，无法转化的基因认为不含有GeneSymbol，将其剔除。
(c3)整合所述辐射前组、辐射后组和药物处理组的平行实验数据，对于仅有一组平行实验数据满足P值小于0.05、表达量大于0的基因，取该组结果为基因表达量；对于两组平行实验数据P值都小于0.05且表达量都大于0的基因，取两次实验结果的平均值作为基因表达量；对于同一个基因不同探针或转录本得到的数据，所述辐射前组、所述辐射后组和所述药物处理组都取最大值。
进一步地，步骤(c)中，所述映射是指在人类蛋白质相互作用网络中寻找整合所得基因，如能找到，保留该基因；如果找不到，删除该基因。所述将整合所得全部基因映射于人类蛋白质相互作用网络上的具体方法可为在Office Excel办公软件中使用VLOOKUP函数，即可判断整合所得全部基因是否出现在人类蛋白质相互作用网络中。具体的映射方法为：以基因为网络结点，基因间相互作用为网络的边，节点的颜色表示基因表达量调节方向：红色表示所述药物处理组与所述辐射后组相比上调表达，绿色表示所述药物处理组与所述辐射后组相比下调表达。节点大小表示与辐射后组相比，药物处理组基因表达量变化的倍数。
本发明所使用的人类蛋白质相互作用网络可按照如下方法获得：从HumanProtein Reference Database(HPRD)数据库(网址是http://www.hprd.org)中下载人类蛋白质相互作用关系，获得用于构建人类蛋白质相互作用网络的数据，去除冗余蛋白进行整合，得到所述人类蛋白质相互作用网络。
进一步地，步骤(c)中，所述辐射后组与所述辐射前组相比，所述药物处理组与所述辐射后组相比表达量均发生变化且表达量调节方向相反的基因包括如下基因：所述辐射后组与所述辐射前组相比下调表达且所述药物处理组与所述辐射后组相比上调表达的基因、所述辐射后组与所述辐射前组相比上调表达且所述药物处理组与所述辐射后组相比下调表达的基因。
进一步地，步骤(d)中，可运用插件jActiveModules(jActiveModules是Cytoscape软件的插件)从步骤(c)中所选取的基因中辨识与所述辐射后组相比，所述药物处理组显著差异表达基因激活子网。在本发明的具体实施方式中，具体是按照包括如下步骤的方法实现的：
(d1)在Cytoscape软件的Apps中的App Manager中下载jActiveModules插件；
(d2)在Apps或Control Panel中启动jActiveModules插件；
(d3)在Numeric Node Attributes中，勾选Reverse sig按钮，其他参数维持默认值；
(d4)在Advanced中，设置Number of Modules可行性范围为1-10，最佳值为5，其他参数维持默认值；
(d5)点击Search按钮运行。
进一步地，步骤(e)中，从步骤(d)所得显著差异表达基因激活子网中选取与所述辐射后组相比，所述药物处理组的表达量差异倍数在2以上(且与所述辐射前组相比，所述辐射后组的表达量差异倍数在1以上)的基因，即为最终筛选所得的潜在空间辐射损伤防护相关人类基因。
第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述方法筛选得到的潜在空间辐射损伤防护相关人类基因。
第三方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述方法筛选得到的潜在空间辐射损伤防护相关人类基因在作为候选空间辐射损伤防护药物作用靶点中的应用。
进一步地，在本发明中，利用前文第一方面中所述方法筛选得到的潜在空间辐射损伤防护相关人类基因(视辐射剂量和处理药物的不同)具体为如下中任一种或几种：PPM1A(5494)、GMEB1(10691)、GDI1(2664)、CUL5(8065)、TSC22D1(8848)、RIF1(55183)、PDCD6IP(10015)、PRKAA1(5562)、JAK1(3716)、CREB1(1385)、ATXN2L(11273)、CASP3(836)、IFI16(3428)、PSMD11(5717)、SMN1(6606)、TFE3(7030)、GTF2A1(2957)、BDP1(55814)、KRT18(3875)、C1orf103(PUBMED：12477932)、RIN1(9610)、ATRX(546)、RAPSN(5913)、SMAD7(4092)、PFN1(5216)。上述基因中，除C1orf103外，其余基因括号中为ENTREZ_GENE_ID。
更进一步地，采用0.5Gy剂量12C照射前经523药物处理的正常人淋巴母细胞AHH-1的潜在辐射损伤防护相关基因如表1所示；采用0.5Gy剂量12C照射前经VND3207药物处理的正常人淋巴母细胞AHH-1的潜在辐射损伤防护相关基因如表2所示；采用2Gy剂量12C照射前经523药物处理的正常人淋巴母细胞AHH-1的潜在辐射损伤防护相关基因如表3所示；采用2Gy剂量12C照射前经VND3207药物处理的正常人淋巴母细胞AHH-1的潜在辐射损伤防护相关基因如表4所示。
上述方法在筛选空间辐射损伤防护药物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明有益效果：由于已知化合物的数量繁多，完全通过实验筛选已知化合物研发新药的成本依然太高。而特效药物研发的首要任务是找到有效的防护分子靶标，本发明正是基于基因差异表达和分子网络分析方法，建立了一种以计算生物学和系统生物学途径理性辨识空间辐射损伤防护分子靶标的方法，从基因表达谱和分子网络的角度发现与空间辐射损伤防护相关的关键基因，以此为基础建立系统完整的药物筛选与评价技术体系，通过计算预测的方法对药物发现方案进行理性设计，可以为大规模实验筛选提供线索，进一步降低成本，使得空间辐射损伤防护药物研发进入理性设计和实验筛选相结合的阶段。
附图说明
图1为应用基因表达芯片技术获得无药和加药情形下不同剂量辐射前后的基因表达谱数据的技术途径示意图。
图2为经523药物处理0.5Gy剂量12C照射后反映基因表达量变化情况的分子网络，红色节点表示表达量上调的基因，绿色节点表示表达量下调的基因。节点的大小与基因表达量变化的倍数相关，对于表达量变化倍数大于2的节点，标注其基因名。
图3为运用jActiveModules插件辨识显著差异表达基因激活子网的参数设置。
图4为0.5Gy剂量12C照射前经523药物干预的显著差异表达基因激活子网。Numberof Modules设置为5，运行程序后辨识得到5个激活子网，a-e分别表示这5个显著差异表达基因激活子网。
图5为碳离子(12C)照射后RIF1基因的蛋白表达量变化情况，*表示P<0.05。a是0.5Gy剂量12C辐射的情形，其中2h和8h点与辐射前组比较差异有统计学意义，p值均小于0.05；b是2Gy剂量12C辐射的情形，其中2h点与辐射前组比较差异有统计学意义，p＝0.029。
图6为碳离子(12C)照射后RIF1基因的mRNA相对表达量变化情况，*表示P<0.05。a是0.5Gy剂量12C辐射的情形，其中2h、4h、24h点与辐射前组比较差异有统计学意义，p值均小于0.05；b是2Gy剂量12C辐射的情形，其中辐射后各时间点与辐射前组比较差异有统计学意义，p值均小于0.05。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的正常人淋巴母细胞AHH-1是美国模式培养物集存库(ATCC)的产品，货号AHH-1(
Figure BDA0001933650410000061
CRL-8146TM)。
下述实施例中所用的空间辐射损伤防护药物523，名称为尼尔雌醇，通用名称为523片。2015年收入中国药典，记载于文献“(1)H NMR metabolic profiling analysisoffers evaluation of Nilestriol treatment in ovariectomised rats.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的空间辐射损伤防护药物VND3207，名称是2-溴-异香兰素，记载于专利号为ZL 2005 1 0093043.X，名称为2-溴-异香兰素在制备抗癌和/或辐射、化疗增敏药物中的应用的专利文件中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、筛选潜在辐射损伤防护相关人类基因
一、辐射前后及药物干预后基因表达谱的建立
1、辐射及药物干预处理
根据是否对正常人淋巴母细胞进行辐射以及辐射前是否进行药物干预分为如下三组实验：
辐射前组(对照组)：未经药物处理且未进行辐射的正常人淋巴母细胞AHH-1；
辐射后组：分别以0.5Gy和2Gy剂量的碳离子(12C)照射且未经药物处理的正常人淋巴母细胞AHH-1；照射结束后4h，分别收集细胞，得到辐射后组细胞；
药物干预组(药物处理组)：照射前0.5h用空间辐射损伤防护药物(523、VND3207)对细胞进行处理(在0.5Gy剂量辐射前0.5h分别用523、VND3207对细胞进行干预，同样，在2.0Gy剂量辐射前0.5h也分别用523、VND3207对细胞进行干预)，照射结束后4h分别收集细胞，得到药物干预组细胞。具体处理方法如下：将正常人淋巴母细胞AHH-1接种于96孔板，每孔200μl(4×103个细胞)细胞悬液(细胞悬液是将AHH-1细胞与含有10％胎牛血清的DMEM培养液混匀得到的)，辐射前0.5h分别向细胞悬液中加入523或VND3207，使523在细胞悬液中的终浓度为5mg/kg，VND3207在细胞悬液中的终浓度为50mg/kg。辐射后继续培养4h，得到药物处理组细胞。
2、基因表达谱的建立
利用基因芯片技术检测步骤1获得的各组细胞(辐射前组、辐射后组、药物干预组)的基因表达量。具体方法如下：分别提取各组细胞的总RNA，反转录得到cDNA分子。以反转录cDNA分子为样本，利用商业化人全基因组表达芯片(购买厂家：illumina，货号：BD-103-0204)检测三组细胞中的基因表达量，分别获得辐射前组、碳离子(12C)辐射后组和药物干预组的细胞基因表达量。
二、基因差异表达网络的构建
以下技术方案的描述以523药物干预、0.5Gy剂量12C照射为例说明基因差异表达网络的构建步骤。
提取辐射前组、0.5Gy剂量碳离子(12C)辐射后组和523药物干预组的AHH-1细胞基因表达量数据进行整合分析。具体方法如下：
1、对辐射前组进行两组平行重复实验，去除两组P-value(P值)(此处P值是对同一个基因表达量3次重复实验测量所得数据计算得到的P值)均大于0.05的基因，同时去除不满足如下条件的基因：辐射前组的两个平行重复实验的基因表达量中至少有一个大于0。
对0.5Gy剂量碳离子(12C)辐射组也同样进行两组平行重复实验，去除两组P-value(P值)(此处P值是对同一个基因表达量3次重复实验测量所得数据计算得到的P值)均大于0.05的基因，同时去除不满足如下条件的基因：0.5Gy剂量碳离子(12C)辐射后组的两个平行重复实验的基因表达量中至少有一个大于0。
对523药物干预组也同样进行两组平行重复实验，去除两组P-value(P值)(此处P值是对同一个基因表达量3次重复实验测量所得数据计算得到的P值)均大于0.05的基因，同时去除不满足如下条件的基因：523药物干预组的两个平行重复实验的基因表达量中至少有一个大于0。
此外，按照上述方法保留的基因中，去除不含有GeneSymbol信息的人类基因。确定是否含有GeneSymbol信息的方法如下：如果某基因的ID不是GeneSymbol，运用TheDatabase for Annotation，Visualization and Integrated Discovery(DAVID)v6.7在线工具中的Gene ID Conversion进行转化，无法转化的基因认为不含有GeneSymbol，将其剔除。
2、整合辐射前组、0.5Gy剂量碳离子(12C)辐射后组和523药物干预组平行实验数据，对于仅有一组平行实验数据满足P-value(P值)小于0.05、表达量大于0的基因，取该组结果作为基因表达量；对于两组平行实验数据P-value(P值)都小于0.05且表达量都大于0的基因，取两次实验结果的平均值作为基因表达量。对于同一个基因不同探针或转录本得到的数据，辐射前组、辐射后组和药物干预组都取最大值。由此得到后续分析所用的12295个基因在辐射前组、辐射后组和药物干预组的表达量数据。
3、将整合所得全部基因映射于人类蛋白质相互作用网络上，所使用的人类蛋白质相互作用网络按照如下方法获得：从Human Protein Reference Database(HPRD)数据库(网址是http://www.hprd.org)中下载人类蛋白质相互作用关系，获得用于构建人类蛋白质相互作用网络的数据，去除冗余蛋白，进行整合，得到所述人类蛋白质相互作用网络，共包含9469个基因和36918对相互作用关系。该网络的可视化可借助Cytoscape软件实现。整合所得的12295个基因中，共5544个基因映射到PPI网络上。计算这5544个基因中0.5Gy剂量12C照射和523药物干预后照射细胞的基因差异表达情况，选取辐射后、药物干预后表达量都发生变化(辐射后表达量发生变化是指与辐射前组相比，辐射后组基因表达量有差异；药物干预后表达量发生变化是指与辐射后组相比，药物干预组基因表达量有差异)的基因，共获得5385个基因。
然后再分别判断这些基因(5385个)经12C照射以及523药物干预后表达量的调节方向，仅保留12C照射后与523药物干预后表达量调节方向相反的基因(辐射后组与辐射前组相比下调表达且药物处理组与辐射后组相比上调表达的基因、辐射后组与辐射前组相比上调表达且药物处理组与辐射后组相比下调表达的基因)，最终得到3726个基因在PPI网络上的分布情形，如图2所示。
三、显著差异表达基因激活子网的辨识
对于523药物处理、0.5Gy剂量12C照射的细胞基因差异表达网络，运用Cytoscape软件的插件jActiveModules进行分析，如图3所示。具体步骤如下：
(1)运行Cytoscape，在Apps中的App Manager中下载jActiveModules插件；
(2)在Apps或Control Panel中启动jActiveModules；
(3)在Numeric Node Attributes栏中，勾选Reverse sig按钮，其他参数维持默认值；
(4)在Advanced栏中，设置Number of Modules可行性范围为1-10，最佳值为5，其他参数维持默认值；
(5)点击Search按钮运行。
运行结果得到5个显著差异表达基因激活子网，如图4所示。
其中，上述操作中所涉及的Cytoscape软件插件jActiveModules及其相关原理与算法具体如下：
jActiveModules是图形化网络显示与分析软件Cytoscape的一款应用插件，目前的最新版本为Version 3.2.1，发布于2016年6月16日，主要用于搜索分子相互作用网络，寻找表达激活子网，辨识表达水平显著差异的节点构成的聚类。应用该插件辨识得到的激活子网是在原网络中相连的区域，在特定情形中表现出显著的表达变化。该插件用到的算法结合了严格的子网打分统计方法和辨识高分值子网的搜索算法，这种激活表达子网也被称为“网络热点”(network hotspots)。
基因表达谱数据反映了基因在不同实验条件下的转录水平，通过后续的数据分析可以辨识参与关键生物过程的基因和相关通路，也可预测未知基因的功能和基因之间的转录调控关系。在真实的生物过程中，在一定条件下往往只有少数基因表达产物的相互关系被激活，而基因表达谱的本质就是特定的基因网络在一定时空约束下的表现。基于这种观点，将基因表达谱与蛋白质相互作用网络进行整合分析，在已知的蛋白质相互作用网络中辨识在特定条件下发生的相互作用关系子集，即激活子网(active subnetwork)具有重要的生物学意义。
有效的激活子网搜索方法应综合考虑基因表达差异性和基因表达相关性，搜索结果应与相关实验条件具有一定的特异相关性，同时包含表达差异不显著但在相关过程中发挥关键性作用的基因。在研究过程中，本发明提出了一种新的激活子网辨识算法，结合各基因的表达差异性和基因之间的表达水平相关性，运用Cytoscape软件的插件jActiveModules建立了激活子网的综合辨识准则，有效减少了辨识过程中的假阳性结果，并且能够获得由完整的关联信息所揭示的通路信息。
用jActiveModule完成激活子网的计算，目的在于寻找包含具有显著表达差异性和显著表达相关性的基因子网。主要分为两个步骤：第一步，建立激活子网的定量评价方法；第二步，在基因相互作用网络中搜索评价最优的激活子网。设G＝(V,E)表示基因相互作用网络，V为网络G中包含所有基因vi的集合，E为网络G中包含的所有相互作用eij的集合，其中eij表示基因vi、vj之间的相互作用。M＝{mij}为基因表达谱数据矩阵，其中mij表示基因vi在第j组实验条件下的转录表达水平。为建立子网激活度的评价指标，首先计算基因表达差异度和相关度，然后计算子网的差异度和相关度，最后寻找具有显著差异性和相关性的子网作为激活子网。
下面分别具体说明子网表达差异度、相关度的计算方法和激活子网的搜索方法。
(一)子网表达差异度的计算方法
基因表达差异度Rdiff(vi)评价基因vi在不同实验条件下表达水平的差异性，基因表达差异度的计算通常依赖于假设检验的统计显著性。以t检验为例，基因表达差异度Rdiff(vi)定义为：
Rdiff(vi)＝1-P(vi) (1)
其中，P(vi)为t检验统计显著性。
基于基因表达差异度，基因网络的表达差异度定义为：
Figure BDA0001933650410000101
其中Φ为标准正态累积分布函数。由于该指标和网络的节点规模有关，因此需要对
Figure BDA0001933650410000102
进行校正，校正后的指标
Figure BDA0001933650410000103
为：
Figure BDA0001933650410000104
其中k＝|V|，μk、σk为节点规模为k的随机网络差异度分布的均值和方差，其取值需要从背景网络中进行抽样估计。校正后的网络表达差异度指标基本与网络规模无关。
(二)子网表达相关度的计算方法
计算子网表达相关度的具体方法是，首先计算相互作用的表达相关度，然后在此边赋权图上计算最大生成子树，并基于最大生成子树所包含的相互作用集合EMST计算子网基因表达相关度，其定义为：
Figure BDA0001933650410000105
与子网表达差异度相似，由此计算得到的网络相关度需要进一步校正过程。校正后的基因网络表达相关度定义为：
Figure BDA0001933650410000111
其中k＝|V|，μk、σk为节点规模为k的随机网络相关度分布的均值和方差，与式(3)类似，其取值需要从背景网络中进行抽样估计。类似地，公式给出的相关度
Figure BDA0001933650410000112
评价指标也为相对值。
(三)激活子网的搜索方法
在寻找激活子网的过程中，其子网表达差异度和相关度均为优化目标，因此问题本质是求解多目标优化问题。多目标优化问题的一种经典求解方法是使用目标函数线性聚合，将多个子目标聚合成向量函数，转换成易于求解的单目标优化问题。由于该求解方法属于前决策方法，即对可能解集合的选择决策在前，因此其求解结果为单一解而非Pareto最优集合，并且在某些情况下该求解方法无法获得非凸解。但实际应用问题的求解域多为凸集，并且在无有效后决策方法或高效求解方法的情况下，采用前决策方法预先对结果进行筛选，不失为高效易行的方法。
此外，即使转换为单目标优化问题，激活子网的搜索也属于最优连通子网求解问题(maximum weight connected subgraph problem)，即给定评价函数，在网络中寻找最优连通子网，使得其评价函数取得最大值。该问题属于NP问题，在多项式时间内尚无有效的解决方法，需要采用随机优化算法，如模拟退火算法，最终获得的满意解能够有效逼近该问题的最优解。理论上还可以进一步证明，在恰当的参数设置下，模拟退火算法能够得到全局最优解，或者相当理想的次优解。
基于上述讨论，本发明采用线性聚合函数方法将子网表达差异度和相关度转换为网络激活度，并使用模拟退火搜索算法寻找激活度较高的子网作为激活子网。基因网络激活度
Figure BDA0001933650410000113
的评价指标定义为网络基因表达差异度和网络基因表达相关度的线性加权之和：
Figure BDA0001933650410000114
其中
Figure BDA0001933650410000115
为基因网络表达差异度，
Figure BDA0001933650410000116
为基因网络表达相关度，λ为权重因子。在多目标优化问题中，λ体现了对不同目标重要性的决策。就我们的研究而言，在无背景决策的情况下，设λ＝1，也可调整λ寻找其他可行解。
激活子网搜索算法描述如下，设G＝(V,E)为相互作用网络，退火温度T＝Tstart：
1、生成随机化网络Gw＝(Vw,Ew)，其中
Figure BDA0001933650410000117
2、随机选取节点v∈V，若v∈Vw，则V′w＝Vw-{v}，否则V′w＝Vw∪{v}；
3、生成新的网络G′w＝(V′w,E′w)，其中，E′w＝{eij|vi,vj∈Vw,eij∈Ew}；
4、构建G′w的最大生成子树，根据公式(6)，计算G′w的激活度
Figure BDA0001933650410000118
5、以概率p决定是否以G′w取代Gw，其中，
Figure BDA0001933650410000121
Figure BDA0001933650410000122
即若
Figure BDA0001933650410000123
则直接以G′w取代Gw，若
Figure BDA0001933650410000124
则G′w取代Gw的概率为p；
6、重复步骤2～5，迭代N次，同时逐渐降低退火温度T，以收敛至最终解Gopt。
对于中等规模网络，以上搜索算法能够直接搜索得到较优结果，如果网络规模较大，搜索空间过大，可能使迭代时间难以接受。一种可行的方法是分步迭代优化，即在前一次搜索结果得到的激活子网中再次搜索最优子网，通过每步设置适当的迭代次数，算法能够在合理的时间内完成，并给出较优的结果。本发明在研究中采用了这种分步迭代优化方法。
四、辐射损伤防护相关基因的初步筛选
从5个基因激活子网中选取fold change在2以上的基因(药物干预组与辐射后组相比，表达量差异倍数在2以上的基因)，它们对523药物反应较为敏感，可以认为是与辐射损伤防护相关的基因，如表1所示。
表1、经523药物处理后0.5Gy剂量12C照射的正常人淋巴母细胞AHH-1的潜在辐射损伤防护相关基因
Figure BDA0001933650410000125
其中的RIF1基因，据文献报道(([1]D.Cornacchia,V.Dileep,J.-P.Quivy,R.Foti,F.Tili,R.Santarella-Mellwig,C.Antony,G.Almouzni,D.M.Gilbert,S.B.C.Buonomo,Mouse Rif1is a key regulator of the replication-timingprogramme in mammalian cells.EMBO J.31,3678–3690(2012).[2]M.Hayano,Y.Kanoh,S.Matsumoto,C.Renard-Guillet,K.Shirahige,H.Masai,Rif1is a global regulator oftiming of replication origin firing in fission yeast.Genes Dev.26,137–150(2012).[3]S.Yamazaki,A.Ishii,Y.Kanoh,M.Oda,Y.Nishito,H.Masai,Rif1regulatesthe replication timing domains on the human genome.EMBO J.31,3667–3677(2012).[4]R.Foti,S.Gnan,D.Cornacchia,V.Dileep,A.Bulut-Karslioglu,S.Diehl,A.Buness,F.A.Klein,W.Huber,E.Johnstone,R.Loos,P.Bertone,D.M.Gilbert,T.Manke,T.Jenuwein,S.C.B.Buonomo,Nuclear Architecture Organized by Rif1Underpins theReplication-Timing Program.Mol.Cell 61,260–273(2016).)在DNA复制过程的调节中发挥关键性作用，对维持基因组稳定性和完整性具有重要意义，在细胞DNA损伤应答尤其是DNA双链断裂损伤修复通路选择的调控中发挥重要的作用，是潜在的辐射损伤防护药物靶标([1]J.R.Chapman,P.Barral,J.-B.Vannier,V.Borel,M.Steger,A.Tomas-Loba,A.A.Sartori,I.R.Adams,F.D.Batista,S.J.Boulton,RIF1is essential for 53BP1-dependent nonhomologous end joining and suppression of DNA double-strandbreak resection.Mol.Cell 49,858–871(2013).[2]C.Escribano-Díaz,A.Orthwein,A.Fradet-Turcotte,M.Xing,J.T.F.Young,J.
Figure BDA0001933650410000132
M.A.Cook,A.P.Rosebrock,M.Munro,M.D.Canny,D.Xu,D.Durocher,A cell cycle-dependent regulatory circuit composedof 53BP1-RIF1and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.Mol.Cell 49,872–883(2013).)。
五、其他剂量12C照射和防护药物作用下的辐射损伤防护相关基因
运用相同的方法分别辨识：(1)0.5Gy剂量12C照射、VND3207药物干预；(2)2Gy剂量12C照射、523药物干预；(3)2Gy剂量12C照射、VND3207药物干预下的辐射损伤防护相关基因。辨识结果如表2-4所示。
表2、经VND3207药物处理后0.5Gy剂量12C照射的正常人淋巴母细胞AHH-1的潜在辐射损伤防护相关基因
Figure BDA0001933650410000131
表3、经523药物处理后2Gy剂量12C照射的正常人淋巴母细胞AHH-1的潜在辐射损伤防护相关基因
Figure BDA0001933650410000141
表4、经VND3207药物处理后2Gy剂量12C照射的正常人淋巴母细胞AHH-1的潜在辐射损伤防护相关基因
Figure BDA0001933650410000142
当前，包括抗辐射药物在内的创新药物研发周期漫长、耗资巨大，而且风险较高，成功率很低。成功开发一个创新药物平均需要10-15年的时间和约8亿美元的投入，其中大部分时间和资金耗费在了大规模化合物筛选上。运用本发明的方法，在大规模筛查化合物之前，先辨识潜在的辐射损伤防护相关基因，这样可以通过基于计算技术的理性分析预测为实际的大规模化合物筛选提供方向，缩小范围，判断最有可能的候选药物靶标，在实际筛查化合物的过程中，就可以重点针对靶向候选靶标的化合物进行研究，节省时间，节约成本。因此，运用本发明的方法辨识潜在的辐射损伤防护相关基因，可以为新一代辐射损伤防护药物的研发奠定基础。另一方面，探明细胞通过哪些分子靶标响应电离辐射和化合物作用，不同剂量的电离辐射和化合物通过哪些分子靶标作用于机体，是进一步研究其如何在辐射诱导反应中发挥作用及其相关分子机制的基础。因此，用本发明方法辨识潜在的辐射损伤防护相关基因，可以为辐射损伤规律和机理的探究提供线索，具有一定的提示作用。
实施例2、潜在辐射损伤防护相关基因的验证
一、碳离子(12C)辐射对RIF1表达水平的影响
通过分子生物学实验对实施例1中的方法辨识的潜在辐射损伤防护相关基因进一步验证，分别运用Western blot和实时定量PCR技术分析碳离子(12C)辐射后细胞(具体辐射方法同实施例1)RIF1基因蛋白和mRNA表达量的变化情况，验证电离辐射对其表达量造成的影响。具体步骤如下：
1、蛋白提取及Western blot
用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白；BCA法测定蛋白浓度，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸10min，进行6％聚丙酰胺凝胶电泳，200mA冰浴进行转膜。用5％脱脂牛奶室温封闭1h，TBST溶液漂洗膜后，加RIF1一抗(A300-568A，BETHYL)4℃孵育过夜。TBST溶液漂洗膜后加二抗室温孵育1h。TBST溶液漂洗膜三次，最后利用ECL发光法，用Bio-Rad ChemiDocXRS+曝光系统检测目的蛋白。利用ImageJ软件对western blotting结果进行灰度分析。
2、RNA提取及实时定量PCR
用Trizol法提取细胞总RNA(Trizol购于Invitrogen)，利用Nanodrop 2000对RNA进行定量，后按照东洋纺逆转录试剂盒(ReverTra
Figure BDA0001933650410000151
qPCR RT Master Mix with gDNARemover)操作说明，反转录出cDNA第一链。以cDNA为模板，采用Bio-Rad CFX96实时定量PCR仪检测各基因表达量。采用20μL反应体系：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10μL，上游引物(10μmol/L)0.6μL，下游引物(10μmol/L)0.6μL，cDNA模板1μL，ddH2O 7.8μL。采用两步法PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火60s，共40个循环。每个基因均重复3次。基因相对表达量采用2-△△Ct法计算，以β-actin作为内参基因，引物序列见表5。
表5、人类RIF1和β-actin基因的引物序列
基因 上游引物 下游引物
RIF1 5'-TACGGAGGGTCTTCCTGAAA-3' 5'-TCCTTGGGCACCTTTATCTG-3'
β-actin 5'-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3' 5'-CACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3'
结果表明，辐射后RIF1基因蛋白表达量降低，辐射后2h表达量降至最低点，辐射后2h至24h，表达量升高(图5)；辐射后RIF1基因mRNA表达量在照射后4h显著升高(图6)。说明RIF1基因响应碳离子(12C)辐射，是可能的辐射损伤防护相关基因。
二、CREB1响应防护药物作用的证据
防护药物523为尼尔雌醇，是一种雌激素类药物。雌激素受体ESR1介导特异性增强基因表达的蛋白质如MAPK途径、PKA、CREB等的活化(F.-N.Cornacchia,T.-F.Lucas,M.-F.Lazari,C.-S.Porto,Estrogen receptor ESR1mediates activation of ERK1/2,CREB,and ELK1in the corpus of the epididymis.Mol Endocrinol J.54(3),339–49(2015).)。由此可见，CREB1作为雌激素受体的下游蛋白，在523药物的生物效应中发挥作用。说明通过本发明的方法辨识预测得到的基因与辐射损伤防护药物作用于机体密切相关，证明该预测方法的可靠性和准确性。

Claims (10)

1.一种筛选潜在辐射损伤防护相关人类基因的方法，包括如下步骤：
(a)用现有辐射损伤防护药物对人类靶细胞进行处理，药物处理后进行模拟空间辐射，得到如下三组细胞：辐射前组，即未经所述辐射损伤防护药物处理且未进行所述模拟空间辐射的所述人类靶细胞；辐射后组，即未经所述现有辐射损伤防护药物处理但进行了所述模拟空间辐射的所述人类靶细胞；药物处理组，即经所述现有辐射损伤防护药物处理且进行了所述模拟空间辐射的所述人类靶细胞；
(b)针对步骤(a)中的三组细胞分别建立各自的基因表达谱；
(c)对步骤(b)所建立的三组细胞的基因表达谱进行整合分析，将整合所得全部基因映射于人类蛋白质相互作用网络上，从能够映射到所述人类蛋白质相互作用网络上的基因中选取所述辐射后组与所述辐射前组相比，所述药物处理组与所述辐射后组相比表达量均发生变化且表达量调节方向相反的基因；
(d)从步骤(c)中所选取的基因中辨识与所述辐射后组相比，所述药物处理组显著差异表达基因激活子网；
(e)从步骤(d)所得显著差异表达基因激活子网中选取与所述辐射后组相比，所述药物处理组的表达量差异倍数在2以上的基因，即为最终筛选所得的潜在空间辐射损伤防护相关人类基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述人类靶细胞为对辐射敏感的细胞；
或，所述对辐射敏感的细胞为正常人外周血细胞或正常人淋巴母细胞；
或，所述正常人淋巴母细胞为AHH-1细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述模拟空间辐射为重离子辐射或γ射线辐射；
或，所述重离子辐射为碳离子辐射；
或，所述碳离子辐射为碳离子12C辐射。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述现有辐射损伤防护药物为尼尔雌醇或2-溴-异香兰素。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(b)是按照包括如下步骤的方法针对所述三组细胞分别建立各自的基因表达谱的：以所述三组细胞的cDNA分子为样本，利用人类全基因组表达芯片获得所述三组细胞中的基因表达种类和表达量数据。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(d)中，运用Cytoscape软件的插件jActiveModules从步骤(c)中所选取的基因中辨识显著差异表达基因激活子网。
7.利用权利要求1-7任一所述的方法筛选得到的潜在空间辐射损伤防护相关人类基因。
8.利用权利要求1-7任一所述的方法筛选得到的潜在空间辐射损伤防护相关人类基因在作为候选空间辐射损伤防护药物作用靶点中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的基因或应用，其特征在于：所述潜在空间辐射损伤防护相关人类基因为如下中任一种或几种：PPM1A、GMEB1、GDI1、CUL5、TSC22D1、RIF1、PDCD6IP、PRKAA1、JAK1、CREB1、ATXN2L、CASP3、IFI16、PSMD11、SMN1、TFE3、GTF2A1、BDP1、KRT18、C1orf103、RIN1、ATRX、RAPSN、SMAD7、PFN1。
10.权利要求1-7任一所述的方法在筛选空间辐射损伤防护药物中的应用。
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