CN111388131A - 一种新型动物灌流的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型动物灌流的方法，包括如下步骤：预热灌注系统；在手术前通过开始循环所有装有水套的组件的水浴来准备灌注系统，请确保管路清洁，并在必要时进行更换；要限制灌注液的速度；血管导管插入术；设置灌注系统；本发明的模型对于研究病理过程以及药物输送机制，循环肿瘤细胞向肿瘤中的迁移/转移以及免疫系统与灌注器官和组织的相互作用是非常有用的工具；可以有效的避免代谢组织如肝脏，肾脏,脾脏等对实验产生的干扰；并且本项发明为药物研发提供了一种全新的干扰更小的研究途径，使药物及肿瘤研究者可以更加直观的了解药物对肿瘤组织的作用方式及效果。
Description
技术领域
发明涉及孤立器官研究领域，具体是一种新型动物灌流的方法。
背景技术
离体灌注是研究孤立器官(例如肝脏和肾脏)功能的重要生理工具。同时，还没有描述骨骼，膀胱，皮肤，前列腺和生殖器官的长期灌注设置。在这里，我们首次报告绕过主要清除器官(肾脏，肝脏和脾脏)的原位下体灌注方案。通过插入腹主动脉和下腔静脉并烧灼(结扎)周围血管来建立回路。灌注培养基是林格氏乳酸盐，含5％BSA(牛血清)。通过蠕动泵进行灌注，并保持血流和体温长达3小时。荧光凝集素和Hoechst的原位染色证实微脉管系统已成功灌注。
隔离器官灌注最初是为了研究器官生理学而开发的，能够在不干扰其他身体系统的情况下理解器官的功能。例如，孤立的肾脏和心脏灌注对于理解血液动力学的基本原理和血管活性剂的作用非常有用，而肝脏灌注对于了解代谢功能(包括健康和患病组织中的药物代谢)非常重要。此外，灌注研究对于理解用于移植的器官的活力和功能至关重要。在癌症研究中使用小鼠，大鼠和新鲜切除的人体组织对孤立的肿瘤灌注进行研究。孤立的肿瘤灌注的基本原理是将肿瘤植入卵巢脂肪垫并迫使肿瘤生长肠系膜动脉的血管。
除了基本的生理学和病理学研究外，器官灌注还用于研究药物输送的基本原理。尽管其他研究取得了一些进展，但尚无关于小鼠原位灌注模型的报道：a)绕过清除器官，例如肝脏，脾脏和肾脏；b)包括骨盆器官，皮肤，肌肉，生殖器官(男性)，膀胱，前列腺和骨髓。这种装置的可用性可以使人们对向这些器官的药物输送提出有趣的问题，包括向骨盆植入的肿瘤(膀胱，前列腺，卵巢，骨髓)以及这些器官的基本生理学和免疫学研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型动物灌流的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种新型动物灌流的方法，包括如下步骤：
在手术前通过开始循环所有装有水套的组件的水浴来准备灌注系统，请确保管路清洁，并在必要时进行更换；要限制灌注液的速度，使用潮湿的腔室气泡收集器作为灌注液室；
2.血管导管插入术
2.1：使用麻醉机以0.3L/min的氧气流速在小鼠中诱导麻醉；
2.2；在双蒸馏水中用针预湿2根缝合线；用蒸馏水预热2根缝线；
2.3；将麻醉下的鼠仰卧在聚苯乙烯泡沫板上，头部朝向术者；用异丙醇擦拭腹部，并用剪刀沿腹部中线以“Y”形剪开腹部皮肤，并通过电凝、烧灼停止切口边缘出血
2.4；将胃，空肠和结肠推至鼠腹部右侧，露出腹主动脉和静脉；
2.5；在解剖显微镜下，使用4-0缝合线在雄性鼠中找到并结扎髂腰动静脉，在雌性鼠中发现并结扎卵巢动脉/静脉和髂腰动静脉；
2.6；在解剖显微镜下，在腹主动脉和下腔静脉下方下环行两根4-0丝线缝合，并在尾部缝合线上打一个松结；
2.7；在解剖显微镜下，将下腔静脉和腹主动脉一起伸展；使用24GA BD InsyteAutoguard翼形针穿刺腹主动脉，弹出针芯，然后将导管推入内部约5-8mm；对下腔静脉重复相同的步骤，并使用4-0缝线打两个结；
2.8；涂上即时胶以将导管固定在直立脊柱上，放回腹部器官并结束手术；
3.设置灌注系统
3.1；将鼠转移到硅垫上预热的带水套的潮湿室内，用19G针将导管翼固定到垫上；
3.2；用预热的灌注缓冲液填充动脉导管的末端和入口，然后使用鲁尔锁紧式连接器将导管末端与入口灌注管连接；
3.3；将蠕动流速调节至0.6mL/min，并保持灌注流出开放式5-10分钟，以通过静脉导管冲洗血液；
3.4；使用鲁尔锁紧式连接器将静脉导管的一端与出口管相连，以形成闭合回路；此时，通过胸部穿刺或任何其他方法执行并验证鼠是否死亡；
3.5；在温暖潮湿腔室中进行灌注；灌注介质是林格氏乳酸盐，其中补充了5％的BSA；定期检查灌注液的水平，并根据需要添加更多；
3.6；可以在任何时间点将选择的试剂添加到灌注容器或注射端口中；
3.7；用荧光试剂灌注后，再用灌注缓冲液冲洗10分钟以最小化背景；然后采集组织用于相关实验研究。
作为本发明进一步的方案：所述麻醉机是异氟烷兽医麻醉机。
作为本发明再进一步的方案：所述麻醉还可以使用氯胺酮/甲苯噻嗪或任何其他类型的腹膜内麻醉；采用脚尖捏合评估麻醉深度。
作为本发明再进一步的方案：所述下腔静脉下方为动脉和静脉上方约1cm，相距5mm。
作为本发明再进一步的方案：可以在灌注结束前3h将10μL的10mg/mLHoechst33342添加到灌注液中以染色细胞核，在灌注结束前30分钟添加50μL的1mg/mLDyLight 649凝集素对血管内皮细胞进行染色；灌注。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的模型对于研究病理过程以及药物输送机制，循环肿瘤细胞向肿瘤中的迁移/转移以及免疫系统与灌注器官和组织的相互作用是非常有用的工具；可以有效的避免代谢组织如肝脏，肾脏,脾脏等对实验产生的干扰；并且本项发明为药物研发提供了一种全新的干扰更小的研究途径，使药物及肿瘤研究者可以更加直观的了解药物对肿瘤组织的作用方式及效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
一种新型动物灌流的方法，包括如下步骤：
1.预热灌注系统
在手术前通过开始循环所有装有水套的组件的水浴来准备灌注系统，请确保管路清洁，并在必要时进行更换；要限制灌注液的速度，使用潮湿的腔室气泡收集器作为灌注液室；
2.血管导管插入术
2.1：使用麻醉机以0.3L/min的氧气流速在小鼠中诱导麻醉；
2.2；在双蒸馏水中用针预湿2根缝合线；用蒸馏水预热2根缝线；
2.3；将麻醉下的鼠仰卧在聚苯乙烯泡沫板上，头部朝向术者；用异丙醇擦拭腹部，并用剪刀沿腹部中线以“Y”形剪开腹部皮肤，并通过电凝、烧灼停止切口边缘出血
2.4；将胃，空肠和结肠推至鼠腹部右侧，露出腹主动脉和静脉；
2.5；在解剖显微镜下，使用4-0缝合线在雄性鼠中找到并结扎髂腰动静脉，在雌性鼠中发现并结扎卵巢动脉/静脉和髂腰动静脉；
2.6；在解剖显微镜下，在腹主动脉和下腔静脉下方下环行两根4-0丝线缝合，并在尾部缝合线上打一个松结；
2.7；在解剖显微镜下，将下腔静脉和腹主动脉一起伸展；使用24GA BD InsyteAutoguard翼形针穿刺腹主动脉，弹出针芯，然后将导管推入内部约5-8mm；对下腔静脉重复相同的步骤，并使用4-0缝线打两个结；
2.8；涂上即时胶以将导管固定在直立脊柱上，放回腹部器官并结束手术；
3.设置灌注系统
3.1；将鼠转移到硅垫上预热的带水套的潮湿室内，用19G针将导管翼固定到垫上；
3.2；用预热的灌注缓冲液填充动脉导管的末端和入口，然后使用鲁尔锁紧式连接器将导管末端与入口灌注管连接；
3.3；将蠕动流速调节至0.6mL/min，并保持灌注流出开放式5-10分钟，以通过静脉导管冲洗血液；
3.4；使用鲁尔锁紧式连接器将静脉导管的一端与出口管相连，以形成闭合回路；此时，通过胸部穿刺或任何其他方法执行并验证鼠是否死亡；
3.5；在温暖潮湿腔室中进行灌注；灌注介质是林格氏乳酸盐，其中补充了5％的BSA；定期检查灌注液的水平，并根据需要添加更多；
3.6；可以在任何时间点将选择的试剂添加到灌注容器或注射端口中；
3.7；用荧光试剂灌注后，再用灌注缓冲液冲洗10分钟以最小化背景；然后采集组织用于相关实验研究。
所述麻醉机是异氟烷兽医麻醉机。
所述麻醉还可以使用氯胺酮/甲苯噻嗪或任何其他类型的腹膜内麻醉；采用脚尖捏合评估麻醉深度。
所述下腔静脉下方为动脉和静脉上方约1cm，相距5mm。
可以在灌注结束前3h将10μL的10mg/mL Hoechst33342添加到灌注液中以染色细胞核，在灌注结束前30分钟添加50μL的1mg/mL DyLight 649凝集素对血管内皮细胞进行染色；灌注。
麻醉成功后，小鼠取仰卧位，头部对术者，沿着腹正中线Y形切开腹部，电凝止血，将鼠胃，空肠及结肠翻转向身体右侧，显露腹腔动脉及静脉，使用4/0丝线缝合结扎双侧精索内动静脉(雌性小鼠为卵巢动脉)及髂腰动静脉,在腹腔动静脉上预置2根6-0丝线打松散结，使用2根24G的穿刺针分别穿刺腹腔动静脉。打紧线结使用胶水固定。手术结束。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (5)
1.一种新型动物灌流的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1.预热灌注系统
在手术前通过开始循环所有装有水套的组件的水浴来准备灌注系统，请确保管路清洁，并在必要时进行更换；要限制灌注液的速度，使用潮湿的腔室气泡收集器作为灌注液室；
2.血管导管插入术
2.1：使用麻醉机以0.3L/min的氧气流速在小鼠中诱导麻醉；
2.2；在双蒸馏水中用针预湿2根缝合线；用蒸馏水预热2根缝线；
2.3；将麻醉下的鼠仰卧在聚苯乙烯泡沫板上，头部朝向术者；用异丙醇擦拭腹部，并用剪刀沿腹部中线以“Y”形剪开腹部皮肤，并通过电凝、烧灼停止切口边缘出血
2.4；将胃，空肠和结肠推至鼠腹部右侧，露出腹主动脉和静脉；
2.5；在解剖显微镜下，使用4-0缝合线在雄性鼠中找到并结扎髂腰动静脉，在雌性鼠中发现并结扎卵巢动脉/静脉和髂腰动静脉；
2.6；在解剖显微镜下，在腹主动脉和下腔静脉下方下环行两根4-0丝线缝合，并在尾部缝合线上打一个松结；
2.7；在解剖显微镜下，将下腔静脉和腹主动脉一起伸展；使用24GA BD InsyteAutoguard翼形针穿刺腹主动脉，弹出针芯，然后将导管推入内部约5-8mm；对下腔静脉重复相同的步骤，并使用4-0缝线打两个结；
2.8；涂上即时胶以将导管固定在直立脊柱上，放回腹部器官并结束手术；
3.设置灌注系统
3.1；将鼠转移到硅垫上预热的带水套的潮湿室内，用19G针将导管翼固定到垫上；
3.2；用预热的灌注缓冲液填充动脉导管的末端和入口，然后使用鲁尔锁紧式连接器将导管末端与入口灌注管连接；
3.3；将蠕动流速调节至0.6mL/min，并保持灌注流出开放式5-10分钟，以通过静脉导管冲洗血液；
3.4；使用鲁尔锁紧式连接器将静脉导管的一端与出口管相连，以形成闭合回路；此时，通过胸部穿刺或任何其他方法执行并验证鼠是否死亡；
3.5；在温暖潮湿腔室中进行灌注；灌注介质是林格氏乳酸盐，其中补充了5％的BSA；定期检查灌注液的水平，并根据需要添加更多；
3.6；可以在任何时间点将选择的试剂添加到灌注容器或注射端口中；
3.7；用荧光试剂灌注后，再用灌注缓冲液冲洗10分钟以最小化背景；然后采集组织用于相关实验研究。
2.根据权利要求1所述的一种新型动物灌流的方法，其特征在于，所述麻醉机是异氟烷兽医麻醉机。
3.根据权利要求1所述的一种新型动物灌流的方法，其特征在于，所述麻醉还可以使用氯胺酮/甲苯噻嗪或任何其他类型的腹膜内麻醉；采用脚尖捏合评估麻醉深度。
4.根据权利要求1所述的一种新型动物灌流的方法，其特征在于，所述下腔静脉下方为two动脉和静脉上方约1cm，相距5mm。
5.根据权利要求1所述的一种新型动物灌流的方法，其特征在于，可以在灌注结束前3h将10μL的10mg/mL Hoechst33342添加到灌注液中以染色细胞核，在灌注结束前30分钟添加50μL的1mg/mL DyLight 649凝集素对血管内皮细胞进行染色；灌注。
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