CN111349598B - 一种用于模拟肝癌环境的脱细胞化支架模板 - Google Patents

一种用于模拟肝癌环境的脱细胞化支架模板 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于模拟肝癌环境的脱细胞化支架模板，其是先将新鲜动物肝脏切片经过脱细胞化，以保持原有的网状结构与肌原蛋白，然后将肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2共同种植于肝脏脱细胞化支架（DECM）模板上，以模拟肝脏肿瘤病变的实际体内环境。本发明所得脱细胞化支架模板安全无毒、生物相容性好、价格低廉，便于操作，在其体系中引入待测试的磁性靶向药物载体，可精确地模拟药物在体内对肝癌的治疗，减少实验动物的过度使用并有效降低科研成本。

Description

一种用于模拟肝癌环境的脱细胞化支架模板
技术领域
本发明属于生物材料制备和生物医学应用领域，具体涉及一种用于模拟肝癌环境的脱细胞化支架模板，其可用于肝癌药物靶向治疗的研究。
背景技术
成熟的纳米载药体系在面对测试其治疗效果时，通常需要进行动物实验（Li Y，J.Z. et al. ACS Applied Materials & Interfaces，2017，9(41)：35604-35612 ）。此类实验研究会对动物造成巨大的伤害，剥夺了动物的生存权利，因此涉及动物实验的科研伦理和道德一直被社会各界广泛关注。更有甚者，一些激进的动物权利保护者更是要求全面停止动物实验，这将对医学、生物等学科的科研活动带来极大的不便甚至阻碍科学研究的进步。当然除此之外，大多数动物实验往往存在着测试周期很长、成本高居不下、无法高通量地完成实验测试等缺陷。专利CN 106148270A公开了一种用于生物人工肝支持系统的3D微肝组织单元的构建方法，其特征是采用海藻酸钠-聚阳离子制备的囊泡包封猪肝脏脱细胞支架成分，并复合肝细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞，通过细胞自组装来构建功能性3D微肝组织单元，并应用于生物型人工肝支持系统。专利CN 106178160A公开了一种仿生肝脏及其制备方法与用途，即提供了一种由DECM填充聚乙二炔（PDA）纳米颗粒制成的仿生肝脏装置。其中的DECM保留了肝脏的形状和三维结构，而PDA纳米颗粒可以选择性地中和穿孔毒素。目前一些现有的仿生肝脏支架制备过程大多采用灌注法，需支气管保存完好的整块肝脏，材料不易得。
在此基础上，为了找到更方便简捷的测试方法，本发明开发了一种成本低廉、制作简单的脱离活体动物外的药物测试模板，通过组织脱细胞后的细胞外基质进行模拟细胞生长环境，同时利用正常细胞与癌细胞的同层接触式混合培养来营造患癌效果，即实现了一种在体外使用的测试模板，这种模板能用来检测当前所制备的纳米合成材料对肝脏肿瘤细胞的药物治疗、光热治疗和化学动力学治疗效果，并且解决动物实验所造成的伦理和耗时久周期长的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于模拟肝癌环境的脱细胞化支架模板，其安全无毒、生物相容性好、价格低廉，便于操作，可精确地模拟体内肝癌环境，减少实验动物的过度使用并有效降低科研成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于模拟肝癌环境的脱细胞化支架模板，其制备方法包括以下步骤：
（1）将新鲜动物肝脏反复冻融，切片后用去离子水反复洗涤，然后用氨水和TritonX-100的混合溶液进行脱细胞处理，再用去离子水磁力搅拌洗涤至中性，磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）浸泡，得到脱细胞支架前体P-DECM；
（2）将步骤（1）制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM；
（3）将步骤（2）得到的DECM吸附在载玻片上，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（4）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（5）取出放置在DECM中的圆环，加入待测试的靶向药物载体，以进行药物靶向治疗的研究。
步骤（1）中，新鲜动物肝脏反复冻融的次数为1~10次，切片的厚度为0.5~5.5 cm；
脱细胞处理时，所用混合溶液中氨水的体积浓度为0.01% ~20%，Triton X-100的体积浓度为0.1% ~30%，搅拌时间为1 h~7 d，搅拌速度为50~1200 rpm；
去离子水洗涤的次数为1~20次，磁力搅拌转速为50~1200 rpm。
步骤（2）中，所得DECM的厚度为1 µm~5 cm，其直径应小于所使用载玻片的直径。
步骤（5）中，当步骤（5）所用靶向药物载体兼具磁性时，则将一圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞所在位置，以进行药物磁性靶向研究；所述圆形吸铁石的直径应与圆环直径一致。
具有磁性的靶向药物载体的一种制备方法为：
a）将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺（DPPE）、叠氮磷酸二苯酯（DPPA）和磷脂修饰聚乙二醇（DSPE-PEG 2000）、顺磁性纳米材料（PMN）溶于甲醇和氯仿的混合溶液中，超声得到溶液S1；
b）将步骤a）得到的溶液S1旋蒸成膜，得到脂质体囊泡包裹的顺磁性纳米材料前体P-PMNBs；
c）将甘油、PBS和嵌段式聚醚F-68混合得水合液S2；
d）将步骤c）得到的水合液S2加入到步骤b）得到的P-PMNBs中，超声溶解，得到脂质体囊泡（NBs）包裹的顺磁性纳米材料溶液（PMNBs）；
e）将抗癌药物（ACD）加入到步骤d）得到的脂质体囊泡包裹的顺磁性纳米材料溶液中，经油浴后，在全氟丙烷气氛中震荡、离心、洗涤，得到最终材料PMNBs/ACD。
步骤a）所得溶液S1中，DPPC的浓度为0.002~10 mg/mL，DPPE的浓度为0.002~10mg/mL，DPPA的浓度为0.002~10 mg/mL，DSPE-PEG 2000的浓度为0.002~10 mg/mL，顺磁性纳米材料的浓度为0.002~100 mg/mL；所述顺磁性纳米材料包括Fe3O4、Pt、Li；
所用混合溶液中甲醇和氯仿的体积比为0.1~200:1。
步骤b）中，旋蒸成膜的时间为5 min~3 h。
步骤c）所得水合液S2中，甘油与PBS的体积比为0.00001~100:1，F-68的含量为0.005~50 mg/mL。
步骤d）中，超声溶解的时间为10 s~30 min。
步骤e）中，抗癌药物的加入量为0.001~10 mg/mL；所述抗癌药物包括阿霉素、紫杉醇、多西他赛；
油浴的温度为20~120 ℃，时间为10 min~5 h；
全氟丙烷气氛中震荡的时间为10 min~8 h，转速为100~1000 rpm；离心的时间为30 s~1 h，转速为100~10000 rpm；所述洗涤是采用PBS离心清洗1~10次，离心速度为1000~30000 rpm，离心时间为30 s~30 min。
与现有技术相比，本发明以新鲜动物肝脏为原材料，经过脱细胞化后，能够保持原有的网状结构与肌原蛋白，很好地促进细胞的增殖与黏附，达到模拟人体环境的效果；将肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2共同种植于肝脏脱细胞化支架模板上，可模拟肝脏肿瘤病变的实际体内环境。 该脱细胞化支架模板安全无毒、生物相容性好、价格低廉，便于操作，可精确地模拟药物在体内对肝癌的治疗，减少实验动物的过度使用并有效降低科研成本。
附图说明
图1为原肝和实施例1制备的DECM支架的SEM图。
图2为原肝和实施例1制备的DECM支架的DNA含量对比图。
图3为实施例1制备的DECM支架的生物相容性结果图。
图4为原肝和实施例1制备的DECM支架的组织切片染色图。
图5为实施例1中Fe3O4（A）、NBs（B）和FeNBs纳米材料（C）的透射电镜（TEM）、水相动力学粒径（DLS）、Zeta电位图以及紫外吸收谱图（UV-vis）。
图6为实施例1制备的FeNBs纳米材料的磁性验证结果图。
图7为实施例1中PBS、NBs和FeNBs纳米材料的光热升温曲线图（A）以及PBS、NBs、FeNBs和FeNBs/DOX的光热成像图（B）。
图8为按实施例1方法制备的含不同浓度FeNBs纳米材料的复合肝脏脱细胞化支架模板对肝细胞LO2的细胞毒性实验（A）以及含FeNBs/DOX材料的复合肝脏脱细胞化支架模板在光热治疗条件下对HepG2细胞死活的双染效果图（B）。
图9为实施例1制备的药物载体复合肝脏脱细胞化支架模板的结构示意图。
具体实施方式
以Fe3O4为顺磁性纳米材料、DOX为抗癌药物，制备一种用于模拟肝癌磁性靶向治疗的药物载体复合肝脏脱细胞化支架模板，其方法如下：
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000、Fe3O4粉末溶于甲醇和氯仿的混合溶液中，超声得到溶液S1；
（2）将步骤（1）得到的溶液S1旋蒸成膜，得到P-FeNBs；
（3）将甘油、PBS和F-68混合得到水合液S2；
（4）将步骤（3）得到的水合液S2加入到步骤（2）得到的P-FeNBs中，将脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）将DOX加入到步骤（4）得到的FeNBs溶液中，经油浴后，在全氟丙烷气氛中震荡，离心、洗涤，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融，切片后用去离子水反复洗涤，然后用氨水和TritonX-100的混合溶液进行脱细胞处理，再用去离子水磁力搅拌洗涤至中性，PBS（pH 7.4）浸泡，得到P-DECM；
（7）将步骤（6）制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM；
（8）将步骤（7）得到的DECM吸附在载玻片上，将PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）得到的FeNBs/DOX，并将一圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，进行光热、化疗及化学动力学等测试。
优选地，步骤（1）所得溶液S1中，DPPC的浓度为0.002~5 mg/mL，DPPE的浓度为0.002~5 mg/mL，DPPA的浓度为0.002~5 mg/mL，DSPE-PEG 2000的浓度为0.002~5 mg/mL，Fe3O4的浓度为0.005~80 mg/mL，超声时间为5 min~40 min；所用混合溶液中甲醇和氯仿的体积比为0.5~150:1。
优选地，步骤（2）中，旋蒸成膜的时间为10 min~2.5 h，温度为10~100 ℃。
优选地，步骤（3）所得水合液S2中，甘油与PBS的体积比为0.00001~40:1，F-68的浓度为0.005~50 mg/mL。
优选地，步骤（4）中，超声溶解的时间为10 s~25 min。
优选地，步骤（5）中，DOX的加入量为0.005~9 mg/mL。油浴的温度为10~110 ℃，时间为20 min~4 h；震荡的时间为30 min~6 h，转速为200~800 rpm；离心的时间为1 min~50min，转速为200~5000 rpm；洗涤是采用PBS离心清洗1~8次，离心速度为2000~25000 rpm，离心时间为1min~25 min。
优选地，步骤（6）中，新鲜动物肝脏反复冻融的次数为1~8次，切片厚度在0.5~4.5cm；脱细胞处理时，所用混合溶液中氨水的体积浓度为0.01% ~15%，Triton X-100的体积浓度为0.1%~25%，搅拌时间为1 h~6.5 d，搅拌速度为50~1100 rpm；去离子水洗涤的次数为1~18次，磁力搅拌转速为50~1100 rpm。
优选地，步骤（7）中，所得DECM的厚度为1 µm~4 cm，其直径应小于所使用载玻片的直径。
优选地，步骤（10）中，圆形吸铁石的直径应与圆环直径一致。
本发明以新鲜动物肝脏为原材料，切片，经过脱细胞化后，制备出具有纤维结构与肌原蛋白、生物相容性良好、能够很好的促进细胞增殖与黏附的模拟人体患癌部位的药物测试模板，解决了因实验动物的过度使用而导致的人伦道德问题。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于10 mL甲醇和5 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为2 mg/mL DPPC、5 mg/mL DPPE、5 mg/mLDPPA、5 mg/mL DSPE-PEG 2000和1.33 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声1 min后，将溶液S1在55 ℃旋蒸1 h成膜，得到P-FeNBs；
（3）将500 µL甘油、5 mL PBS和3 mg F-68混合得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声5 min使脂质体膜超声溶解，得FeNBs；
（5）按3.64 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在75 ℃下油浴1 h后，在全氟丙烷气氛中以500 rpm转速震荡2 h，在800 rpm下离心10 min，用PBS离心洗涤3次，离心速度为20000 rpm，时间为5 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融3次，切片厚度为1 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.1vol%氨水和3.33vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为20 µm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
图1为原肝与本实施例制备的脱细胞支架DECM的SEM图（标尺为5 µm）。对比发现，DECM上的肌肉组织、细胞等已脱除干净，网络结构及纤维蛋白等保存完好，有益于细胞的生长。
图2为原肝与本实施例制备的DECM的DNA含量对比图。从图中可以看出，DECM上DNA含量较于原肝已非常低，说明该脱细胞支架确实已脱除干净。
图3为本实施例制备的DECM支架的生物相容性结果图。将肝细胞LO2在DECM上培养了1、3、7天后发现，LO2细胞有明显的增殖趋势，表明该脱细胞支架具有良好的生物相容性及促进细胞增殖性能，能够很好的模拟人体内细胞的生存环境。
图4为原肝和本实施例制备的DECM的组织切片染色图（DAPI、H&E、Masson和Siriusred，标尺为1000 µm）。从DAPI染色图可以看出，与原肝对比，经脱细胞之后的肝脏支架几乎没有细胞核，表明已脱除干净。从H&E染色图可以看出，与原肝对比，经脱细胞之后的肝脏支架保存了原有的弹力纤维、胶原纤维等细胞外基质成分。从Masson染色图可以看出，与原肝对比，经脱细胞之后的肝脏支架几乎没有肌肉等组织，胶原纤维保存完好。从Sirius red染色图可以看出，与原肝对比，经脱细胞之后的肝脏支架几乎保存的是Ⅰ型胶原纤维。
图5为本实施例中Fe3O4（A）、NBs（B）和FeNBs纳米材料（C）的TEM、DLS、Zeta电位以及紫外吸收谱图（UV-vis）。由图5可见，制备的NBs已经成功的将Fe3O4包裹，并且FeNBs的平均粒径为599.9 nm，平均电位为–0.675 mV。
图6为实施例中制备的FeNBs纳米材料的磁性验证结果图。由图6可见，FeNBs在外加磁场的作用下具有磁性，可从侧面验证其对肿瘤细胞具有很好的聚集、靶向效果。
图7为本实施例中PBS、NBs和FeNBs纳米材料的光热升温曲线图（A）以及PBS、NBs、FeNBs和FeNBs/DOX的光热成像图（B）。由图7可见，制备的FeNBs经808 nm（2 W/cm2）激光器照射10 min后，其升温温差在25 ℃左右，完全满足杀死肿瘤所需的温度；并且在进行三次升降温的循环后，该材料依然保持良好的升温效果，说明其能持续长久的进行光热治疗。
图8为按本实施例方法制备的含不同浓度FeNBs纳米材料的复合肝脏脱细胞化支架模板对肝细胞LO2的细胞毒性实验（A）以及含FeNBs/DOX材料的复合肝脏脱细胞化支架模板在光热治疗条件下对肝癌细胞HepG2死活的双染效果图（B）。从图中可以看出，即使材料浓度达到200 µg/mL，细胞依然保持高存活率，说明该材料生物相容性良好。同时，不加光照时，只有DOX进行化疗作用，只有少量细胞被杀死；而在808 nm（2 W/cm2）激光器照射10 min后，肿瘤细胞基本全部被杀死，说明在光照下，FeNBs/DOX是集化疗、热疗和化学动力学治疗与一体的多功能载药体系，也证明本发明脱细胞化支架模板可用于肿瘤靶向药物的体外研究。
图9为本实施例制备的药物载体复合肝脏脱细胞化支架模板的结构示意图。
实施例2
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于80 mL甲醇和1 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为5 mg/mL DPPC、2 mg/mL DPPE、4 mg/mLDPPA、0.02 mg/mL DSPE-PEG 2000和0.01 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在20 ℃旋蒸10 min成膜，得到P-FeNBs；
（3）将1 µL甘油、10 mL PBS和15 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声20 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按0.005 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在100 ℃下油浴3 h后，在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡5 h，在800 rpm下离心5 min，用PBS离心洗涤1次，离心速度为3000 rpm，时间为1 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融2次，切片厚度为1 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.1vol%氨水和0.1vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为2 cm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
实施例3
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于40 mL甲醇和20 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为5 mg/mL DPPC、4.8 mg/mL DPPE、2 mg/mL DPPA、0.02 mg/mL DSPE-PEG 2000和0.005 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在20 ℃旋蒸10 min成膜，得到P-FeNBs；
（3）将1 µL甘油、10 mL PBS和15 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声20 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按0.005 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在100 ℃下油浴3 h后，在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡5 h，在4000 rpm下离心40 min，用PBS离心洗涤1次，离心速度为3000 rpm，时间为1 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融2次，切片厚度为1.2 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.01vol%氨水和0.1vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为2 cm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
实施例4
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于50 mL甲醇和1 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为0.1 mg/mL DPPC、4.8 mg/mL DPPE、4mg/mL DPPA、0.02 mg/mL DSPE-PEG 2000和0.005 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在20 ℃旋蒸10 min成膜，得到P-FeNBs；
（3）将1 µL甘油、10 mL PBS和15 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声20 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按0.01 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在90 ℃下油浴3 h后，在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡5 h，在3500 rpm下离心30 min，用PBS离心洗涤1次，离心速度为3000 rpm，时间为1 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融7次，切片厚度为2 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.01vol%氨水和0.2 vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为2 cm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
实施例5
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于10 mL甲醇和50 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为5 mg/mL DPPC、4.8 mg/mL DPPE、4 mg/mL DPPA、1 mg/mL DSPE-PEG 2000和0.005 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在40 ℃旋蒸20 min成膜，得到P-FeNBs；
（3）将1 µL甘油、10 mL PBS和15 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声20 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按0.005 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在100 ℃下油浴3 h，后在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡5 h，在4000 rpm下离心40 min，用PBS离心洗涤3次，离心速度为10000 rpm，时间为2 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融5次，切片厚度为1.4 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.01vol %氨水和0.1vol % Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为1 cm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
实施例6
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于80 mL甲醇和1 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为5 mg/mL DPPC、4.8 mg/mL DPPE、4 mg/mL DPPA、0.02 mg/mL DSPE-PEG 2000和0.005 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在50 ℃旋蒸10 min成膜，得到P-FeNBs；
（3）将1 µL甘油、10 mL PBS和15 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声20 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按0.005 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在100 ℃下油浴3 h后，在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡5 h，在4000 rpm下离心40 min，用PBS离心洗涤3次，离心速度为3000 rpm，时间为1 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融6次，切片厚度为4 cm，用去离子水反复洗涤后，用含1vol %氨水和1vol % Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为1.5 cm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
实施例7
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4 溶于80 mL甲醇和1 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为5 mg/mL DPPC、4.8 mg/mL DPPE、0.02mg/mL DPPA、0.02 mg/mL DSPE-PEG 2000和1 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在60 ℃旋蒸1 h成膜，得到P-FeNBs；
（3）将5 µL甘油、10 mL PBS和5 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声20 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按0.005 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在100 ℃下油浴3 h后，在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡5 h，在4000 rpm下离心40 min，用PBS离心洗涤5次，离心速度为5000 rpm，时间为10 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融6次，切片厚度为3.2 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.1 vol%氨水和5 vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为500 mm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
实施例8
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于30 mL甲醇和30 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为3 mg/mL DPPC、4.3 mg/mL DPPE、2.7mg/mL DPPA、5 mg/mL DSPE-PEG 2000和7 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在80 ℃旋蒸10 min成膜，得到P-FeNBs；
（3）将1 µL甘油、10 mL PBS和15 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声20 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按1 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在100 ℃下油浴3 h后，在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡30 min，在1000 rpm下离心40 min，用PBS离心洗涤1次，离心速度为10000 rpm，时间为1 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融5次，切片厚度为2.7 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.06 vol%氨水和0.5 vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为2 cm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
实施例9
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于10 mL甲醇和25 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为0.1 mg/mL DPPC、1 mg/mL DPPE、1 mg/mL DPPA、5 mg/mL DSPE-PEG 2000和2 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在20 ℃旋蒸10 min成膜，获得到P-FeNBs；
（3）将10 mL甘油、4 mL PBS和10 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声5 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按0.1 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在100 ℃下油浴3 h，后在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡5 h，在4000 rpm下离心40 min，用PBS离心洗涤1次，离心速度为15000 rpm，时间为5 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融8次，切片厚度为3.6 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.9 vol%氨水和3.1 vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为1 mm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
对比例1
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于10 mL甲醇和5 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为2 mg/mL DPPC、5 mg/mL DPPE、5 mg/mLDPPA、5 mg/mL DSPE-PEG 2000和1.33 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声1 min后，将溶液S1在55 ℃旋蒸1 h成膜，得到P-FeNBs；
（3）将500 µL甘油、5 mL PBS和3 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声5 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按3.64 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在75 ℃下油浴1 h后，在全氟丙烷气氛中以500 rpm转速震荡2 h，在800 rpm下离心10 min，用PBS离心洗涤3次，离心速度为20000 rpm，时间为5 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融3次，切片厚度为1 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.1 vol%氨水和0.05 vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为20 µm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
对比例1中调整Triton X-100浓度的大小，与实施例1相比，同样冻融次数、去离子水洗涤次数与时间、氨水浓度、搅拌转速与时间、切片大小，Triton X-100浓度越小，对应的脱细胞程度越不彻底。
对比例2
（1）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000和Fe3O4溶于80 mL甲醇和1 mL氯仿配成的混合溶液中，超声得到溶液S1，其中各物质的浓度为5 mg/mL DPPC、2 mg/mL DPPE、4 mg/mLDPPA、0.02 mg/mL DSPE-PEG 2000和0.01 mg/mL的Fe3O4；
（2）超声5 min后，将溶液S1在20 ℃旋蒸10 min成膜，得到P-FeNBs；
（3）将1 µL甘油、10 mL PBS和15 mg F-68混合获得水合液S2；
（4）将水合液S2加入到P-FeNBs中，超声20 min使脂质体膜超声溶解，获得FeNBs；
（5）按0.005 mg/mL的量将DOX加入到得到的FeNBs溶液中，在100℃下油浴3 h后，在全氟丙烷气氛中以300 rpm转速震荡5 h，在90 rpm下离心5 min，用PBS离心洗涤1次，离心速度为3000 rpm，时间为1 min，得到最终材料FeNBs/DOX；
（6）将新鲜动物肝脏反复冻融2次，切片厚度为1 cm，用去离子水反复洗涤后，用含0.1 vol%氨水和0.1 vol% Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，然后用去离子水磁力搅拌洗涤，PBS（pH 7.4）浸泡得到P-DECM；
（7）将制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM，其厚度为2 cm；
（8）将DECM用载玻片吸附，用PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”，并在DECM中放置一圆环（其直径为DECM直径的一半），使DECM分割为内圆和外环两部分；
（9）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（10）取出放置在DECM中的圆环，加入步骤（5）中得到的FeNBs/DOX，并将一与圆环直径一致的圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞部分，最后进行光热、化疗及化学动力学等测试。
对比例2中调整FeNBs溶液震荡后，离心速度的大小，与实施例2相比，同样DPPC、DPPA、DPPE及DSPE-PEG 2000的浓度、冻融次数、甲醇与氯仿的体积比、Fe3O4粉末的加入浓度、旋蒸时间及温度、水合液成分、P-DECM超声溶解的时间、DOX的浓度、油浴温度及时间、震荡的时间及转速，离心速度越小，对应得到的FeNBs粒径越大，在治疗过程中其毒性越大。
以上实施例说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，是本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种用于模拟肝癌环境的脱细胞化支架模板，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
（1）将新鲜动物肝脏反复冻融，切片后用去离子水反复洗涤，然后用氨水和Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，再用去离子水磁力搅拌洗涤至中性，pH=7.4的PBS溶液浸泡，得到脱细胞支架前体P-DECM；
（2）将步骤（1）制得的P-DECM用圆形模具取出一个圆柱体，冷冻后切成圆片，得到DECM；
（3）将步骤（2）得到的DECM吸附在载玻片上，将PDMS固化在DECM边缘形成“河堤”， 并在DECM中放置一个直径为DECM直径一半的圆环，使DECM分割为内圆和外环两部分；
（4）在内圆部分种植HepG2细胞，在外环部分种植LO2细胞，然后在DECM上加入DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2环境中孵育24 h至细胞贴壁；
（5）取出放置在DECM中的圆环，加入待测试的靶向药物载体，进行药物靶向治疗的研究；
步骤（1）脱细胞处理时，所用混合溶液中氨水的体积浓度为0.01% ~20%，Triton X-100的体积浓度为0.1% ~30%，搅拌时间为1 h~7 d，搅拌速度为50~1200 rpm；
当步骤（5）所用靶向药物载体兼具磁性时，则将一圆形吸铁石隔着载玻片置于HepG2细胞所在位置，以进行药物磁性靶向研究；所述圆形吸铁石的直径应与圆环直径一致。
2.根据权利要求1所述的脱细胞化支架模板，其特征在于：步骤（1）新鲜动物肝脏反复冻融的次数为1~10次，切片的厚度为0.5~5.5 cm；
去离子水洗涤的次数为1~20次，磁力搅拌转速为50~1200 rpm。
3.根据权利要求1所述的脱细胞化支架模板，其特征在于：步骤（2）中所得DECM的厚度为1 µm~5 cm，其直径应小于所使用载玻片的直径。
4.根据权利要求1所述的脱细胞化支架模板，其特征在于：具有磁性的靶向药物载体的制备方法为：
a）将DPPC、DPPE、DPPA、DSPE-PEG 2000、顺磁性纳米材料溶于甲醇和氯仿的混合溶液中，超声得到溶液S1；
b）将步骤a）得到的溶液S1旋蒸成膜，得到脂质体囊泡包裹的顺磁性纳米材料前体P-PMNBs；
c）将甘油、PBS和嵌段式聚醚F-68混合得水合液S2；
d）将步骤c）得到的水合液S2加入到步骤b）得到的P-PMNBs中，超声溶解，得到脂质体囊泡包裹的顺磁性纳米材料溶液；
e）将抗癌药物加入到步骤d）得到的脂质体囊泡包裹的顺磁性纳米材料溶液中，经油浴后，在全氟丙烷气氛中震荡、离心、洗涤，得到最终材料PMNBs/ACD。
5.根据权利要求4所述的脱细胞化支架模板，其特征在于：步骤a）所得溶液S1中，DPPC的浓度为0.002~10 mg/mL，DPPE的浓度为0.002~10 mg/mL，DPPA的浓度为0.002~10 mg/mL，DSPE-PEG 2000的浓度为0.002~10 mg/mL，顺磁性纳米材料的浓度为0.002~100 mg/mL；
所述顺磁性纳米材料包括Fe3O4、Pt、Li；
所用混合溶液中甲醇和氯仿的体积比为0.1~200:1。
6.根据权利要求4所述的脱细胞化支架模板，其特征在于：步骤b）中旋蒸成膜的时间为5 min~3 h。
7.根据权利要求4所述的脱细胞化支架模板，其特征在于：步骤c）所得水合液S2中甘油与PBS的体积比为0.00001~100:1，F-68的含量为0.005~50 mg/mL。
8.根据权利要求4所述的脱细胞化支架模板，其特征在于：步骤d）中，超声溶解的时间为10 s~30 min。
9.根据权利要求4所述的脱细胞化支架模板，其特征在于：步骤e）中抗癌药物的加入量为0.001~10 mg/mL；所述抗癌药物包括阿霉素、紫杉醇、多西他赛；
油浴的温度为20~120 ℃，时间为10 min~5 h；
全氟丙烷气氛中震荡的时间为10 min~8 h，转速为100~1000 rpm；离心的时间为30 s~1 h，转速为100~10000 rpm；所述洗涤是采用PBS离心清洗1~10次，离心速度为1000~30000rpm，离心时间为30 s~30 min。
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磁性脂质体的制备及应用研究进展;李曦等;《材料导报》;20060915(第09期);全文 *
磁靶向制剂研究进展;徐金军等;《医学研究杂志》;20090815(第08期);全文 *
超顺磁性纳米颗粒治疗肿瘤的应用进展;李慧等;《中国组织工程研究与临床康复》;20091217(第51期);摘要，第10134页 *

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