CN111349546A - 一种无细胞蛋白质合成方法及多孔板 - Google Patents

Abstract

一种无细胞蛋白质合成方法及多孔板。该方法包括如下步骤：提供多孔板，多孔板包括盖板和设置有多个孔的基座，每个孔由一个或多个侧壁、一个底部Ⅱ和一个开口形成，盖板与开口相匹配，每个孔反应腔体积为20μL以下；多个孔中的部分孔相互之间连通；向部分孔中提供流体；当流体为无细胞反应混合物时，向流体中加入生化因子和模板DNA、模板RNA、添加剂、反应辅助因子中的一种或几种；当流体为无细胞反应混合物与生化因子的混合物时，继续加入模板DNA、模板RNA、添加剂、反应辅助因子中的一种或几种；将盖板放置在基座的顶部上以封闭孔的开口，流体与孔的底部Ⅱ和盖板均接触；将多孔板孵育一段时间。该方法和多孔板可降低试剂成本。

Description

一种无细胞蛋白质合成方法及多孔板

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无细胞蛋白质合成方法及多孔板。

背景技术

无细胞蛋白质合成也称为体外蛋白质合成或CFPS。该工艺的目的在于利用细胞的生物机制生产蛋白质，而不会局限于活细胞内。只要有足够的反应成分浓度，无细胞蛋白质合成工艺就可持续生产蛋白质。一般来说，无细胞蛋白质合成需要存在氨基酸、编码所需蛋白质的DNA或RNA模板、核糖体、tRNA和能量来源。无细胞蛋白质合成可用纯化的单个组分或细胞提取物来进行。

在体外生物学实验领域中，如无细胞蛋白质合成、荧光测定等实验，筛选反应通常在标准孔板中进行，如24，48，96，384，1024或者其他的定制化的孔板。尽管这种板可广泛使用，但是用于这种体外生物学实验领域中存在以下缺点：上述标准孔板中每孔提供的体积均较大，如在标准96孔板中，每孔提供了约360μL的体积。通常，每孔中使用的工作体积范围从数百微升到数毫升。对于使用所有孔的96孔板进行上述反应，试剂的成本可快速上升到数万元，使用成本高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无细胞蛋白质合成方法及多孔板，该方法和多孔板提供了对本领域已知合成方法和装置的改进，可降低试剂成本。

为实现发明目的，本发明提供的一种无细胞蛋白质合成方法，所述方法包括如下步骤：

a、提供多孔板，所述多孔板包括基座和盖板，基座上设置有多个孔，每个孔由一个或多个侧壁、一个底部Ⅱ和一个开口形成，盖板与开口相匹配，所述每个孔的反应腔体积均为20μL以下；多个孔中的部分孔相互之间连通；

b、向步骤a中多个孔中的部分孔提供一定体积的流体，流体为无细胞反应混合物或无细胞反应混合物与生化因子的混合物；

c、当步骤b中的流体为无细胞反应混合物时，向步骤b中加入流体的孔中加入生化因子和模板DNA、模板RNA、添加剂、反应辅助因子中的一种或几种；当步骤b中的流体为无细胞反应混合物与生化因子的混合物时，向步骤b中加入流体的孔中加入模板DNA、模板RNA、添加剂、反应辅助因子中的一种或几种；

d、将盖板放置在基座的顶部上以封闭孔的开口，步骤b中的流体与孔的底部Ⅱ和盖板均接触；

e、在合适的条件下，将步骤d的多孔板孵育一段时间。

优选的，所述每个孔的反应腔体积均为10μL以下；优选的，所述每个孔的反应腔体积均为5μL以下；优选的，所述每个孔的反应腔体积均为3μL以下；通过减小孔的高度，实现减小反应腔的体积，可在其中使用较小体积的液体，从而降低试剂成本。

本发明提供的无细胞蛋白质合成方法，因其中所用的多孔板具有更小的孔体积，从而所述方法需要更少的试剂量。此外，反应流体同时与底部Ⅱ与盖板相接触，能够极大的减小液体的蒸发，这对处理微量液体是极为有利的。另外，当将所述盖板放置在基座上时，其在所述孔的开口上可形成气密密封，气密密封减少了和/或防止了蒸发流体从孔中流失。防止蒸发损失可确保流体体积内的生化浓度保持在预期水平，并不会随着时间的推移而发生变化。

优选的，所述方法当步骤b或步骤c中将一种或多种生化因子引入所述多孔板的多孔中时，所述一种或多种生化因子的数量或浓度在所述多孔之间形成增量梯度。当步骤b中流体为无细胞反应混合物与生化因子的混合物时，预先混合生化因子可以快速的进行光学测定实验。

优选的，所述多孔板的孔定位成矩阵形式，当生化因子为两种时，第一生化因子在矩阵的第一梯度之间形成增量梯度，第二生化因子在矩阵的第二梯度之间形成增量梯度；即当生化因子为两种时，第一生化因子在矩阵的第一行之间形成增量梯度，第二生化因子在矩阵的第一列之间形成增量梯度；即当生化因子为两种时，第一生化因子在多孔板的长度方向上形成增量梯度，第二生化因子在多孔板的宽度方向上形成增量梯度。

优选的，步骤b或步骤c中生化因子为镁离子、钾离子、NTP混合物、氨基酸混合物、能量混合物中的一种或多种。

优选的，所述方法还包括以下步骤：在将所述流体引入至少一些所述孔后，将其冷冻干燥，通过向冷冻干燥的流体提供水将其水化。当步骤b中流体为无细胞反应混合物与生化因子的混合物时，通过向流体提供已在所述多孔板的多孔内冷冻干燥的生化因子，可为使用者流水线化和简化此类测定。

优选的，所述底部Ⅱ和所述盖板中的任一或二者是透明的。提供至少在一侧上透明的多孔板能够实现对反应产物的成像，而无需移除所述多孔板的盖板；优选的，所述底部Ⅱ和盖板中的其一或两者至少部分地由玻璃或塑料制成；优选的，所述底部Ⅱ和盖板中的其一或两者至少部分地由聚丙烯与环烯烃共聚物、聚苯乙烯二者中的一种或两种制成。

优选的，所述基座还包括形成多个孔的一个或多个侧壁的间隔件；所述间隔件的向盖侧涂有粘合材料或由粘合材料组成。粘合剂附接可进一步促进使用者对多孔板的操作，特别是当通过流体与孔的底部Ⅱ和盖板接触而减少了孔内的流体运动时；所述向盖侧上还设置有保护膜，提供保护膜有助于保护基座上的粘合剂涂层，直到基座和盖板以气密方式密封在一起为止，这还可促进在实验室中对多孔板的使用。

本发明提供了一种用于进行无细胞蛋白质合成的多孔板。所述多孔板包括基座和盖板，所述基座上设置有多个孔，每个孔由一个或多个侧壁、一个底部Ⅱ和一个开口形成；盖板与开口相匹配并用于封闭开口，所述每个孔的反应腔体积均为20μL以下；多个孔中的部分孔相互之间连通。

优选的，所述多孔中的每个孔的深度均为1mm以下，优选0.5mm以下，更优选0.2mm以下。优选的，所述多孔中的每个孔的反应腔体积均为10μL以下，更优选5μL以下，更优选3μL以下。通过减小所述孔的体积和/或高度，可在其中使用较小体积的液体，从而降低试剂成本。

进一步的，所述多孔用封闭液处理，以防止分子非特异性地粘附至一个或多个侧壁和/或所述孔的底部Ⅱ，可以避免非特异性吸附对生化因子工作浓度的影响。

进一步的，所述多孔板还可包括一个或多个透析膜，透析膜设置在相互连通的孔之间，所述透析膜实现了分子与所述孔之间的扩散交换。透析膜可通过连续提供必要浓度的试剂，使在所述多孔板内进行长期测定。

优选的，本发明的多孔板包括至少40个、至少50个或至少96个孔。

附图说明

图1为现有的用于无细胞蛋白质合成的反应孔的垂直截面图；

图2a为本发明多孔板中单孔的截面图，其中没有盖板而具有沉积的流体；

图2b为本发明多孔板中单孔的截面图，其中盖板固定到位并具有沉积的流体；

图3为从本发明多孔板上方观察带有浓度梯度的视图；

附图中：1、反应孔，10、底部Ⅰ，20、孔腔，30、周围隔板，70、溶液，100、孔，110、基座，120、反应腔，130、侧壁，140、底部Ⅱ，150、开口，160、盖板，170、流体，200、多孔板，210、第一梯度，220、第二梯度，230、透析膜。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

如本文所述，术语“蛋白质合成”指的是从氨基酸组装蛋白质。本文所述的板或多孔板指的是用于进行生物学或化学分析的容器或容置器。术语“板”不应理解为限制板的大小、结构或材料。

图1为现有的用于无细胞蛋白质合成的反应孔1。反应孔1具有底部Ⅰ10和用于形成孔腔20的周围隔板30。现有技术的孔1中的孔腔20较大，通常大于200μL。因此，当溶液70沉积在反应孔1内时，溶液70必须具有较大的体积以允许进行充分的实验，通常大于20μL。

图2a和2b提供了根据本发明的多孔板200的孔100的截面图。多孔板200包括设有多个孔100的基座110。每个孔100提供反应腔120。孔100包括至少一个侧壁130。孔100还包括位于孔100顶部的开口150和底部Ⅱ140。图2a和2b还示出了沉积在孔100内的一定体积的流体170。在图2b中，所示孔100具有设在孔100顶部位置的盖板160。

多孔板200的基座110上设置有多个孔100，每个孔100由一个或多个侧壁130、一个底部Ⅱ140和一个开口150形成。底部Ⅱ140可由玻璃或塑料形成，比如，聚丙烯和聚苯乙烯；聚丙烯和环烯烃共聚物；聚丙烯、聚苯乙烯和环烯烃共聚物。优选的，底部Ⅱ140至少部分是透明的，比如，至少在某些波长上是透明的。透明底部Ⅱ140可实现从下面对孔100中的内容物进行成像(比如使用倒置显微镜)，而不会干扰孔100的内容物。底部Ⅱ140的宽度可取决于所进行测定的要求和所实施成像的类型。

单个侧壁130和底部Ⅱ140可以形成圆柱形的形状。孔100还可包括多个侧壁130，当从上方观察时，这些侧壁130形成正方形的孔，或从上方观察时，这些侧壁130形成一些其他多边形的形状。一个或多个侧壁130也可由玻璃或塑料(例如聚丙烯和聚苯乙烯；聚丙烯和环烯烃共聚物；聚丙烯、聚苯乙烯和环烯烃共聚物)形成，并可具有相同的特性和/或与底部Ⅱ140一体形成。然而，在一些构型中，多个侧壁130可由不同的材料制成，比如粘合材料，从而使盖板160能更好的封闭开口150。一个或多个侧壁130也可由部分不透明和/或深色的材料制成，这可有助于在视觉上区分成像配置中的孔。为了仅容纳少量流体170，侧壁130可具有较小的高度。该高度可提供的孔深为1mm以下，优选0.5mm以下，或更优选0.2mm以下。当一个或多个侧壁130由粘合材料制成时，可以有助于形成这种高度较低的结构，当侧壁130不采用粘合材料制成时，侧壁130与盖板160之间不易形成封闭的反应腔120，从而导致流体170从孔100与盖板160之间漏出。侧壁130也可采取间隔件的形式，其不仅形成孔100的壁，而且还填充了多孔板200上的各个孔100之间的整个空间。侧壁130或间隔件的向盖侧由粘合材料组成或涂有粘合材料，这有助于将孔100密封抵靠盖板160，从而使孔100的内容物与周围环境隔离。

一个或多个侧壁130的高度以及由孔100占据的底部Ⅱ140的表面积一起限定了孔100的体积。孔100的体积较小，以便容纳少量的流体170而不会使流体170暴露于大量周围的空气中。由于在一些现有的构型中多孔中的每个孔的体积较大，比如50μL、200μL或甚至高达1000μL，因此，本发明中多孔板的每个孔的体积为20μL以下，优选10μL以下，更优选5μL以下，更优选3μL以下，这取决于具体的应用。

盖板160可由玻璃或塑料形成，比如，由聚丙烯与环烯烃共聚物、聚苯乙烯二者中的一种或两种制成。优选的，盖板160可至少在某些光波长下是透明的。这使得能够从上方对孔100中内容物成像，而不会干扰孔100的内容物。

多孔板200的一种有利构型是其中盖板160盖合时在孔100的开口150上形成气密密封，这种气密密封可防止蒸发液体从孔100中流失。由于随着时间的流逝蒸发的液体损失可能使反应孔100内的浓度变得不可靠，因此防止所述蒸发可从孔100内进行的测定中产生更可靠的结果。

多孔板200的孔100可在使用前任选地用封闭液如BSA、PEG和/或硅烷将孔100的内壁和底部Ⅱ140进行涂覆，这确保了底部Ⅱ140和侧壁130均涂有非反应涂层，以最小化非特异性结合效应。

如图3所示，多个孔100中的部分孔相互之间连通，相互连通的孔之间一个设为主孔，一个设为侧孔，主孔和侧孔是人为设定的；在一个有利的构型中，多孔板200还可包括一个或多个透析膜230，该透析膜230设在相互连通的孔100之间，主孔中所容纳的流体170与侧孔中所容纳的含有一定浓度生化因子的另一流体170相接触，生化因子通过透析膜230的缓慢透析使生物化学反应可在更长的时间范围内持续反应，即延长反应时间，同时将流体170浓度保持在最佳水平。

结合图2a、2b和3所示，本发明提供了一种无细胞蛋白质合成方法。

首先，提供多孔板200，该多孔板200包括基座110和盖板160，基座110上设置有多个孔100，如图2a和图2b所示。该盖板160与开口150相匹配，并放置在基座110的顶部上以封闭孔的开口150，从而可完全将孔100与外界环境封闭开来。孔100中的每个孔具有较小的体积，每个孔的最大反应腔120体积为20μL，优选为10μL，更优选为5μL，更优选3μL以下。

如图2a所示地在多孔板200的至少一个孔100中沉积一定体积的流体170。这可通过手动移液或通过自动移液或自动液体处理系统完成。在该方法的一些构型中，额外的微流体系统可被构造为在孔100内沉积一定体积的流体170。

流体170的体积包括无细胞反应混合物。无细胞反应混合物包括多种组分。无细胞反应混合物可包括基础液，比如水、盐溶液或提供其他无细胞反应混合物因子悬浮液的市售缓冲液。无细胞反应混合物还包括能量源，比如葡萄糖或ATP、氨基酸混合物、激酶或其他酶、盐、pH缓冲剂或其他生物和/或化学因子。进一步的，无细胞反应混合物还包括核糖体，用于从氨基酸和/或tRNA进行蛋白质合成以进行氨基酸组装。

在引入一定体积的流体之前或之后，使用者都会引入反应引发所需的生化因子。在无细胞蛋白质合成的情况下，该体积的液体可包括模板DNA、模板RNA、添加剂和/或反应辅因子。

一旦将所有必要的组分引入孔100中，就开始生化过程。然后，如图2b所示，使用者将盖板160盖合从而密封单个孔100。基座110的一个或多个侧壁130和底部Ⅱ140，与盖板160一起形成密闭室，其中无细胞反应混合物在内部。由于孔100的体积和流体170的体积均很小，流体170与开孔100的底部Ⅱ140和盖板160两者均接触，从而使流体170变成稍微平坦的盘状形状。在一些构型中，流体170也可与孔100的一个或多个侧壁130接触。由于每个孔100的体积为20μL或更小，优选为10μL，更优选为5μL，更优选为3μL或更小，因此在孔100内使用的流体170的体积必须小得多。例如，在10μL的孔中，可使用9μL的流体170体积。由于孔100内的流体170体积得到显著减小，从而可降低试剂的成本。此外，在封闭状态下，流体170与空气接触的体积都小得多，从而使得流体170的蒸发量大大减少，进而确保了在测定期间，孔100内的试剂和产物的浓度保持在最佳水平。

最后，将覆盖的多孔板200孵育一定的时间，使得蛋白质合成反应可得到进行。孵育通常是指提供促进给定测定所需的反应的环境条件。孵育可包括将多孔板200的孔100保持在20～40℃的给定温度下；孵育还可包括提供某种类型的空气，例如经过净化和/或加湿的空气；孵育的时间可以是几分钟、几小时甚至几天，这取决于反应的类型和测定的要求。

在该方法的优选实施例中，将至少一种生化因子引入多孔板200的多孔100中，使得一个或多个生化因子形成多个孔100之间的增量梯度。优选的，所述一种或多种生化因子的数量和/或浓度的增加遵循预定函数，优选的，遵循线性函数。然而，还可使用对数或指数函数。当引入不止一种生化因子时，会遵循在所述孔之间的数量或浓度的不同的函数来引入不同的生化因子(例如，不同的线性函数、线性和对数函数、线性和指数函数等。)。

例如，所述多孔板的孔可形成一列、一行、一列和一行、一列和多行、多列和一行、多列和多行。当使用第一生化因子时，所述第一生化因子可沿一列、多列中的第一列或一行、多行中的第一行中的一种而设有增量梯度，即逐步改变浓度；当使用第二生化因子时，所述第二生化因子可沿一行、多行中的另一行或一列、多列中的另一列中的一种而设有增量梯度，即逐步改变浓度。换句话说，所述第一生化因子可沿所述一行或多行而设有增量梯度，而第二生化因子可沿所述一列或多列而设有增量梯度；或所述第一生化因子可沿所述一列或多列而设有增量梯度，而第二生化因子可沿所述一行或多行而设有增量梯度。

即所述第一生化因子可在多孔板200的长度方向上设有增量梯度，而第二生化因子可在多孔板200的宽度方向上设有增量梯度；或所述第一生化因子可在多孔板200的长度方向上设有增量梯度，而第二生化因子可在多孔板200的宽度方向上设有增量梯度。当两个生化因子都以梯度的形式提供时，则可将梯度定向在不同的方向上(取决于孔的排列，例如彼此垂直)，从而形成不同生化因子组合的矩阵。这样的构型在图3中示出，其中第一梯度210沿着孔100的水平方向形成，如由梯度条象征性地指示的。第二生化因子作为第二梯度220沿孔100的垂直方向进行沉积，如梯度条所示。按此方式，两个生化因子梯度形成了用测定实验的矩阵，其中左上方的孔(如图3所示)包括最少量的两个生化因子，而右下方的孔则包括最大量的两个生化因子。这些生化因子通常用于初步反应筛选。这些生化因子的组合包括：镁离子作为第一生化因子而钾离子作为第二生化因子、镁离子作为第一生化因子而NTP混合物作为第二生化因子、镁离子作为第一生化因子而氨基酸混合物作为第二生化因子、镁离子作为第一生化因子而能量混合物作为第二生化因子、钾离子作为第一生化因子而NTP混合物作为第二生化因子、钾离子作为第一生化因子而氨基酸混合物作为第二生化因子、钾离子作为第一生化因子而能量混合物作为第二生化因子、NTP混合物作为第一生化因子而氨基酸混合物作为第二生化因子、NTP混合物作为第一生化因子而能量混合物作为第二生化因子、氨基酸混合物作为第一生化因子而能量混合物作为第二生化因子。一旦进行了测定，则用户可轻易确定哪种生化因子组合最合适(例如，哪种组合提供最高的产量)。

所述生化因子可以是之前所述的生物或化学种类中的任何一种。生化因子可以是Mg²⁺、K⁺或模板DNA/RNA。优选的，当将孔100提供给使用者时，孔100内可已经包括了生化因子。例如，多孔板200可设有孔100中的一定体积的流体170。多孔板200的这种构型对于使用者是有利的，因为可进行浓度筛选以获得最佳反应结果。优选的，例如，向消费者提供多孔板200，其中已将生化因子冷冻干燥在孔100内。因此，多孔板200可与已经以梯度形式存在于多孔中的冷冻干燥的生化因子一起储存和运输，这可为使用者实现更快和更简化的浓度筛选测定。

Claims (15)

1.一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a、提供多孔板(200)，所述多孔板(200)包括基座(110)和盖板(160)，基座(110)上设置有多个孔(100)，每个孔(100)由一个或多个侧壁(130)、一个底部Ⅱ(140)和一个开口(150)形成，盖板(160)与开口(150)相匹配，所述每个孔(100)的反应腔(120)体积均为20μL以下；多个孔(100)中的部分孔(100)相互之间连通；

b、向步骤a中多个孔(100)中的部分孔(100)中提供一定体积的流体，流体为无细胞反应混合物或无细胞反应混合物与生化因子的混合物；

c、当步骤b中的流体为无细胞反应混合物时，向步骤b中加入流体的孔(100)中加入生化因子和模板DNA、模板RNA、添加剂、反应辅助因子中的一种或几种；当步骤b中的流体为无细胞反应混合物与生化因子的混合物时，向步骤b中加入流体的孔(100)中加入模板DNA、模板RNA、添加剂、反应辅助因子中的一种或几种；

d、将盖板(160)放置在基座(110)的顶部上以封闭孔的开口(150)，步骤b中的流体与孔(100)的底部Ⅱ(140)和盖板(160)均接触；

e、在合适的条件下，将步骤d的多孔板(200)孵育一段时间。

2.根据权利要求1所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，所述每个孔(100)的反应腔(120)均为10μL以下；或所述每个孔(100)的反应腔(120)均为5μL以下；或所述每个孔(100)的反应腔(120)均为3μL以下。

3.根据权利要求1或2所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，当步骤b或步骤c中加入一种或多种生化因子时，生化因子的数量或浓度在多孔之间形成增量梯度。

4.根据权利要求3所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，多孔板(200)中的孔(100)定位成矩阵形式，当生化因子为两种时，第一生化因子在矩阵的第一梯度(210)之间形成增量梯度，第二生化因子在矩阵的第二梯度(220)之间形成增量梯度；即当生化因子为两种时，第一生化因子在矩阵的第一行之间形成增量梯度，第二生化因子在矩阵的第一列之间形成增量梯度；即当生化因子为两种时，第一生化因子在多孔板(200)的长度方向上形成增量梯度，第二生化因子在多孔板(200)的宽度方向上形成增量梯度。

5.根据权利要求1或2所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，步骤b或步骤c中生化因子为镁离子、钾离子、NTP混合物、氨基酸混合物、能量混合物中的一种或多种。

6.根据权利要求1或2所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：将步骤b加入流体的孔(100)进行冷冻干燥，通过向冷冻干燥的流体提供水来将其水化。

7.根据权利要求1或2所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，底部Ⅱ(140)和盖板(160)中的其一或两者是透明的。

8.根据权利要求7所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，底部Ⅱ(140)和盖板(160)中的其一或两者至少部分地由玻璃或塑料制成。

9.根据权利要求8所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，底座Ⅱ(140)和盖板(160)中的其一或两者至少部分地由聚丙烯与环烯烃共聚物、聚苯乙烯二者中的一种或两种制成。

10.根据权利要求1或2所述的一种无细胞蛋白质合成方法，其特征在于，所述基座(110)还包括形成多个孔(100)的一个或多个侧壁的间隔件，所述间隔件的向盖侧涂有粘合材料或由粘合材料组成；所述向盖侧上方还设置有保护膜。

11.一种多孔板，其特征在于，包括基座(110)和盖板(160)，所述基座(110)上设置有多个孔(100)，每个孔(100)由一个或多个侧壁(130)、一个底部Ⅱ(140)和一个开口(150)形成；盖板(160)与开口(150)相匹配并用于封闭开口(150)，所述每个孔(100)的反应腔(120)体积均为20μL以下；多个孔(100)中的部分孔(100)相互之间连通。

12.根据权利要求11所述的多孔板，其特征在于，所述多孔中的每个孔(100)的深度均为1mm以下；或所述多孔中的每个孔(100)的深度均为0.5mm以下；或所述多孔中的每个孔(100)的深度均为0.2mm以下。

13.根据权利要求11或12所述的多孔板，其特征在于，所述多个孔(100)用封闭液处理；所述多孔板(200)还包括一个或多个透析膜(230)，透析膜(230)设置在相互连通的孔(100)之间。

14.根据权利要求11或12所述的多孔板，其特征在于，所述每个孔(100)的反应腔(120)体积均为10μL以下；或所述每个孔(100)的反应腔(120)体积均为5μL以下；或所述每个孔(100)的反应腔(120)体积均为3μL以下。

15.根据权利要求11或12所述的多孔板，其特征在于，所述多孔板包括至少40个、至少50个或至少96个孔。

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