CN111346680A - 一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法，包括S1.利用多重软光刻技术制备芯片模具，模具中不同位置结构厚度不同；S2.浇筑聚二甲基硅氧烷，待聚二甲基硅氧烷浇筑层固化后进行脱模；将聚二甲基硅氧烷浇筑层与载玻片键合，制得微流控芯片，芯片上相邻流道结构存在高度差；S3.制备液体导电材料，使其处于液态；S4.利用压力将液体导电材料灌注入到相邻流道中高度较高的流道内，液体导电材料被精确限定在相邻流道高度骤然变化的位置。其优点在于，本方法可以将片上电极的间距缩小到40μm以下，因而只需要一个相当低的外加小于2V电压，就可以产生足够大的均匀场强以完成微尺度下的流动式电穿孔。

Description

一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法
技术领域
本发明属于微流控芯片领域，涉及一种在微流控芯片上制备精确位置限定的三维微电极的方法。
背景技术
微尺度下的流动式直流电穿孔具有高效转送小分子、高通量、安全可靠、操作简单等优点。然而，基于恒压的电穿孔容易产生电解产物，限制了电压操作窗口。为了降低电压，同时为电穿孔提供足够的电场，需要具有间距紧密且均匀的平行片上三维电极。基于微流控芯片的电穿孔和电化学检测都对间距紧凑、均匀的平行片上三维电极有着强烈的需求。通过微机电加工技术进行片上电极制作可以降低电极间距和电穿孔电压，但这种电极制备方法受限于复杂的工艺流程。液体导电材料如银浆、生物相容性材料或液态合金，通过灌注的方法已被应用于制备电极。几乎所有的灌注方法都是基于毛细扩张阀或毛细限制阀原理将液体物质限制在中心流道的两侧。目前广泛应用的XY平面的毛细阀结构采用微柱阵列将液体材料限制在相邻两个微柱之间。然而微柱的存在导致电极界面不连续，因而在外加电压后产生的电场也不均匀的技术问题。
发明内容
基于上述问题，本发明提供一种新的片上电极制备方法，具体涉及一种在微流控芯片上能够精确限定位置的三维微电极的快速制备方法。其技术方案为，
一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
S1.制备芯片模具，且模具中不同位置结构厚度不同；
S2.浇筑聚二甲基硅氧烷(PDMS)，待聚二甲基硅氧烷浇筑层固化后进行脱模；将聚二甲基硅氧烷浇筑层与载玻片键合，制得微流控芯片，芯片上相邻流道结构存在高度差；
S3.制备液体导电材料，使其处于液态；
S4.利用压力将液体导电材料灌注入到相邻流道中高度较高的流道内，液体导电材料被精确限定在相邻流道高度骤然变化的位置；待电极灌注完成，将芯片冷却至室温，即可获得精确限定位置的片上三维微电极。
进一步的，芯片模具采用微机电加工中的多重软光刻技术或深硅刻蚀技术制作硅模具；或通过激光加工、精密机械加工的方法制作金属模具。用微机电加工中的多重软光刻技术制作芯片模具，在基底片上旋涂一定厚度的正性光刻胶，光刻显影后加热炭化，再旋涂一层不同厚度的负性光刻胶，结构对准后二次光刻显影得到最终的光刻胶模具。
进一步的，步骤S3中，液体导电材料包括导电银浆，生物相容性导电材料，碳纳米管，石墨烯以及低熔点合金；采用低熔点合金时，将固态的低熔点合金置于热板上，升温至合金熔点以上，使其形成液态，以作为片上微电极材料；同时将微流控芯片也置于热板上预热以备灌注用。
进一步的，微流控芯片上的相邻流道存在高度差异，液体导电材料从高流道向低流道流动时，由于高度骤然减小在Z轴方向上产生的毛细限制阀作用将液体导电材料精确限定在相邻两个流道的交界处。
进一步的，液体导电材料通过压力进样的方式被灌注入流道内，通过精准调节进样压力的大小，使进样压力始终小于毛细限制阀的拉普拉斯力，保证液体导电材料的通畅灌注和精确限定。
有益效果
本发明具有如下优点：
1)通过一种Z轴方向毛细限制阀结构可以在微流控芯片上简单快速地制备平行三维微电极，微电极的电极间距均一可控。
2)利用这种电极制备方法可以将电极间距缩小到40μm以下，因此只需要一个1.5V的低电压就可以完成细胞电穿孔。
3)整个电穿孔体系操作简单，成本低，因此具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明中微流控芯片的制作工艺路线流程图，
图2为微流控芯片上精确限定的平行三维电极示意图；
图3为利用OpenCV绘制的XY平面结构和Z轴方向结构中电极间距沿流道的变化曲线图；
图4为利用COMSOL模拟的XY平面结构和Z轴方向结构在流道中线位置的电场强度分布图；
图5为流动式电穿孔处理后的细胞的荧光成像图；
具体实施方式
下面结合附图1-5和具体实施例对技术作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
本实施例以快速制备片上三维电极用于微尺度下的流动式电穿孔为例
(1)根据发明方法制作微流控芯片和制备片上三维微电极
S1，芯片模具的制作。使用正性光刻胶(AZ4903)在单面抛光的硅片上甩胶，获得厚度为20μm的光刻胶，覆盖掩膜版，通过光刻机紫外曝光后用正胶显影液显影90s，氮气吹干，硅片置于190℃的热板上烘1h，使光刻胶炭化，自然冷却至室温后,正胶显影，得到20微米高的流通层模具；在硅片上旋涂负性光刻胶(SU-8 3050)，甩胶后获得一层厚度为50μm的光刻胶。覆盖掩膜版，与原有光刻图案做对准，完成光刻机曝光，后烘5h，用负胶显影液显影，得到50微米高的流通层模具,吹氮气4min，至模具吹干，获得最终的芯片模具(如图1所示)。
S2，微流控芯片制作。用电子天平按10:1的比例称取20g Sylgard PDMS的预聚合物和交联剂，混匀后放在真空干燥器里抽真空去除气泡。将PDMS浇筑于模板上，再次放入真空干燥器，抽真空去除气泡5分钟，放到烘箱75度1小时后取出。待PDMS浇筑层固化后进行脱模，用打孔器打孔；
将PDMS浇筑层与清洗过的载玻片放置于等离子去胶机中进行表面处理，确保芯片上相邻流道结构存在高度差,处理后的载玻片和PDMS迅速封接得到微流控芯片，封接好的芯片放置于电热恒温鼓风干燥箱中，135度12小时。
S3，制备液体导电材料，使其处于液态。本实施例采用铋铟锡作为电极材料，它在室温下以固态形式存在，其熔点为60℃。该合金表面张力系数较高(约400mN/m)，因此毛细限制阀的拉普利斯力可以达到一个较高的值，提供一个不小于20Kpa的压力，电极可以方便且准确得限定在指定的区域。此外，合金从液态转变为固态时体积变化不大，固化后不改变微电极的形状。将固态的合金置于热板上，升温至100℃，使其形成液态，以作为片上微电极材料。同时将微流控芯片也置于热板上预热以备灌注用。
S4，片上微电极的制备。利用压力进样的方式将液态合金灌注进入流道内，将进样压力设定在20KPa，小于毛细限制阀的拉普拉斯力，待电极灌注完成，将芯片冷却至室温，即可获得精确限定位置的片上三维微电极(如图2所示)，其电极间距缩小到40μm以下，因此只需要一个1.5V的低电压就可以完成细胞电穿孔。通过Open CV对比利用Z轴方向毛细限制阀作用制备的微电极与利用XY平面毛细限制阀作用制备的微电极的电极间距均一性，前者的变异系数为1.94％，而后者的变异系数为12.92％(如图3所示)。
(2)利用片上微电极完成细胞电穿孔
在流道间距一致的情况下，利用Z轴方向毛细限制阀作用制备的微电极在施加电压后可以产生均一的电场，而利用XY平面毛细限制阀作用制备的微电极由于芯片上微柱结构的影响，在施加电压后产生不均匀的电场(如图4所示)。
将用Z轴方向毛细限制阀作用制备的微电极通过导线与恒压直流电源相连，电源输出1.5V的低电压。本实例中平行微电极的间距设定在35μm，在此电场条件下，电极间的流道可以产生超过400V/cm的场强。
HEK-293细胞被用来验证在此电场条件一下电穿孔的有效性。细胞在经培养后胰酶回收，用电转液配成最终细胞密度为1×105/ml的细胞悬液，将碘化丙啶以50ug/ml的浓度加入细胞悬液中作为电穿孔有效的指示剂。
用注射泵将细胞悬液注入微流控芯片流道内，控制细胞流速，将通过流道的细胞悬液在出口处回收，在荧光显微镜下观察细胞有红色荧光表达，证实利用Z轴方向毛细限制阀作用制备的微电极可以有效地用于微尺度下的流动式细胞电穿孔(如图5所示)。
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

Claims (5)

1.一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
S1.制备芯片模具，且模具中不同位置结构厚度不同；
S2.浇筑聚二甲基硅氧烷，待聚二甲基硅氧烷浇筑层固化后进行脱模；将聚二甲基硅氧烷浇筑层与载玻片键合，制得微流控芯片，芯片上相邻流道结构存在高度差；
S3.制备液体导电材料，使其处于液态；
S4.利用压力将液体导电材料灌注入到相邻流道中高度较高的流道内，液体导电材料被精确限定在相邻流道高度骤然变化的位置。
2.根据权利要求1所述的一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，芯片模具采用微机电加工中的多重软光刻技术或深硅刻蚀技术制作硅模具；或通过激光加工、精密机械加工的方法制作金属模具。
3.根据权利要求1所述的一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，液体导电材料包括导电银浆，生物相容性导电材料，碳纳米管，石墨烯以及低熔点合金。
4.根据权利要求1所述的一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法，其特征在于，所述微流控芯片上的相邻流道存在高度差异，液体导电材料从高流道向低流道流动时，由于高度骤然减小在Z轴方向上产生的毛细限制阀作用将液体导电材料精确限定在相邻两个流道的交界处。
5.根据权利要求1所述的一种用于微尺度流动式电转染的三维电极快速制备方法，其特征在于，液体导电材料通过压力进样的方式被灌注入流道内，进样压力小于毛细限制阀的拉普拉斯力，保证液体导电材料的通畅灌注和精确限定。
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