CN111337685A - 可溶性pd-l2作为sle生物标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了可溶性PD‑L2作为SLE生物标志物的应用，具体公开了可溶性PD‑L2作为SLE生物标志物在制备SLE诊疗评估试剂中的应用，所述诊疗评估试剂的检测样本为血清。同时公开了一种试剂组在制备SLE诊疗评估试剂中的应用，所述的试剂组包括可溶性PD‑L2检测试剂和补体C3、C4检测试剂，可溶性PD‑L2水平与补体C3、C4水平呈正相关。采用本发明的检测试剂盒对血清样本中可溶性PD‑L2以及补体C3、C4联合检测，可有效用于SLE疾病的早期诊断、预后评估，为SLE疾病的诊疗提供了一种新的途径，具有良好的临床应用前景。

Description

可溶性PD-L2作为SLE生物标志物的应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及可溶性PD-L2(sPD-L2)作为SLE生物标志物的应用。
背景技术
SLE是一种风湿性自身免疫性疾病，临床表现可累及全身各个器官、组织，为全身性、弥漫性疾病。SLE好发于年轻女性，常为20-40岁的育龄期女性。在SLE发病机制中，自身免疫耐受损害、淋巴细胞过度活化所导致的自身抗体的产生和炎症细胞浸润是其主要的病理损伤机制。在SLE的免疫病理过程中，B7/CD28家族分子信号通路发挥着重要作用，其不仅可通过提供正性共刺激信号来启动、增强、维持T、B淋巴细胞介导的免疫应答，还可以通过提供负性共刺激信号来限制、减弱或者终止免疫反应。
PD-1/PD-L信号通路作为负性调节因子在维持T细胞免疫应答耐受中有很重要作用。有研究报道发现PD-1缺乏的C57BL/6小鼠出现狼疮样自身免疫性增生性关节炎和肾小球肾炎，并伴有肾小球上IgG3和C3补体的沉积。PD-L2作为PD-1的受体之一，仅表达于活化的单核巨噬细胞及专职的抗原递逞细胞中如树突状细胞，有关PD-L2在自身免疫病特别是在SLE中的病理机制研究甚少。前期我们通过流式细胞术分析发现SLE患者外周血单核细胞上PD-L2分子相对于健康人群显著高表达，正同其它研究者报道PD-1和/或PD-1配体在其他人类自身免疫性疾病中的表达也有所增加。Kobayashi等发现干燥综合征患者唾液淋巴细胞PD-1和唾液腺导管及腺泡上皮细胞PD-L1表达增强。同时Liu等报道PD-1及PD-L1分别在SLE患者CD3+T细胞及CD14+单核细胞上高表达，这可能是T细胞过度活化后的免疫调控，也有可能是与其它受体(并非PD-1)相结合传递正向刺激信号。
多种共刺激分子能分别以细胞膜型和可溶型两种形式存在，包括CD28、CTLA-4、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3和B7-H4等。可溶性形式可以通过蛋白水解酶裂解细胞上的膜型分子从而脱落形成，也可由专一的mRNA直接编码产生。可溶性的共刺激分子在免疫调节网络中具有十分重要的作用，有些可溶性共刺激分子如sCTLA-4可干扰CD80/CD86与膜型CTLA-4的结合，阻断CTLA-4的抑制性作用，可有助有活化T细胞，上调免疫应答，因此在多种自身免疫性疾病中sCTLA-4已被发现高表达；而有些可溶性共刺激分子的功能如同其膜型分子相一致可激活相应的配体或受体，如soluble ICOS可以激活配体B7h，具有上调免疫应答的功能。可溶性共刺激分子在疾病的早期诊断及病情监测中有重要作用。有研究报道共刺激分子的可溶性形式在SLE患者血清中分泌发生改变，如可溶性CD28分泌上升，ICOSL分泌下降，sPD-L1分泌水平上调。
SLE临床表现复杂多样，病情反复多变，早期诊断困难，因此迫切需要寻求一种新型、特异性及敏感性较高的生物标志物用于SLE的诊断和预后评估。现有技术公开了外周血单核细胞上PD-L2分子在SLE患者中表达水平的变化，但并未证明sPD-L2是否能作为有效的生物标志物用于SLE疾病早期诊断的指标及疾病治疗的靶点。目前尚未见以血清sPD-L2水平作为SLE疾病生物标志物的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于研究sPD-L2在SLE患者中的异常表达情况及其可能的临床意义，本研究收集SLE患者外周血血清，分析sPD-L2的表达情况及与临床病例资料、各项检验参数间的相关性，探讨sPD-L2是否能成为SLE疾病早期诊断的指标及疾病监测治疗的靶点。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了sPD-L2作为SLE生物标志物在制备SLE诊疗评估试剂中的应用。
进一步的，所述诊疗评估试剂的检测样本为血清。
进一步的，所述的诊疗评估试剂为试剂盒。
优选的，所述的试剂盒为ELISA检测试剂盒。
本发明还提供了一种试剂组在制备SLE诊疗评估试剂中的应用，所述的试剂组包括sPD-L2检测试剂和补体C3、C4检测试剂。
进一步的，所述的试剂组检测的sPD-L2水平与补体C3、C4水平呈正相关。
有益效果：本发明提供了sPD-L2作为SLE生物标志物的应用，其有益效果主要体现在以下几个方面：
1、本发明通过实验结果得出血清中sPD-L2在SLE疾病患者中低表达，其可用于SLE疾病的诊疗标志物，具有较高的诊疗价值；
2、本发明通过实验结果还得出血清中sPD-L2与补体C3、C4水平呈正相关，sPD-L2可联合补体C3、C4共同用于SLE疾病的诊疗，能够显著的提高SLE疾病的诊疗效果；
3、采用本发明的检测试剂盒对血清样本中sPD-L2以及补体C3、C4联合检测，可有效用于SLE疾病的早期诊断、预后评估，为SLE疾病的诊疗提供了一种新的途径，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为SLE患者及健康对照中sPD-L2的检测结果图；(A)sPD-L2在58例健康对照外周血中表达量为4857±102.6pg/mL，在78例SLE患者外周血血清中表达下降为2744±119pg/mL，P<0.0001；(B)sPD-L2在SLE患者诊断中ROC曲线分析红线下区域面积为0.988，(C)初发组和复发组患者的sPD-L2的分泌无差异。
图2为sPD-L2的表达和临床参数的相关性分析图；(A)sPD-L2在活动期患者外周血相对于恢复期及健康对照组中表达水平下降；(B)sPD-L2的表达和疾病活动程度指标SLEDAI-2K分值间无相关性；(C)sPD-L2的表达和病程周期间无相关性。
图3为sPD-L2的表达和补体水平间的相关性分析图；(A)sPD-L2和补体C3间的表达呈显著正相关；(B)sPD-L2和补体C4呈显著正相关。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1材料和方法
1.1研究对象
78例SLE病人的外周血血清来自于苏州市中医医院检验科，收集时间是2013年1月至2015年7月。血清收集后分装冻于-80度冰箱备用。正常健康对照组来自苏州卫生职业技术学院附属吴中人民医院体检的健康人群。所有患者至少符合4个美国风湿病学会对SLE的诊断标准，并且病人在半年内均未接受过任何的激素或者免疫治疗。在研究开展前，标本的收集得到了单位伦理委员会的同意以及患者的知情同意。系统性红斑狼疮患者和健康对照者的临床病例资料如表1所示。
表1系统性红斑狼疮患者和健康对照者的临床病例资料
Figure BDA0002394887920000031
1.2 ELISA检测sPD-L2的表达
sPD-L2的ELISA检测试剂盒购自introvigen公司，样本取自冻存于-80度冰箱内的血清，同一样本设置三个复孔，检测流程按照试剂盒说明书进行。每次操作均设置了标准曲线，加入试剂盒中检测抗体2小时充分洗涤后加入1：1000稀释的亲和素标记的HRP酶，室温孵育30分钟；最后洗涤8遍，加入TMB(Sigma，美国)显色15分钟，2mol/L H2SO4 15分钟，2mol/L H2SO4终止反应，通过酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA)检测450nm处的吸光光度值。1.3血清中的免疫球蛋白、C反应蛋白、补体、血沉、蛋白尿和血常规的检测血清中的免疫球蛋白IgG、C反应蛋白(CRP)，补体C3、C4通过浊度分析法按照仪器操作指南进行(IMMUNE800,BeckmanCoulter)。血沉和尿蛋白以及血常规检验的数据是医院临床检验科室中获得。
1.4统计学分析
SPSS17.0统计学软件分析本实验数据，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，实验组两两间的比较采用t检验。两组间定量资料相关性分析，采用spearman等级相关分析，以P＜0.05作为有统计学差异的指标。应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)及曲线下面积(AUC)分析sPD-L2对SLE的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 SLE患者外周血血清中sPD-L2显著低表达
通过ELISA检测78例SLE患者及56例健康对照组外周血血清的sPD-L2表达发现，SLE患者sPD-L2的表达水平为2744±119pg/mL，健康对照组表达水平为4857±102.6pg/mL，患者显著低表达，差异具有统计学意义(P<0.0001)(见图1A)。进一步的ROC曲线分析显示sPD-L2诊断SLE的曲线下面积(AUC)为0.988(图1B)，95％可信区间为0.9705-1.005，LogRank P<0.001。因70％的患者为复发患者，虽然入选的病例均为三个月内未接受治疗的，但为排除过往激素治疗对sPD-L2表达的影响，将SLE患者分为初发组和复发组两组，初发患者外周血sPD-L2的表达水平为2742±267pg/mL，复发患者2745±135.7pg/mL，两组并无显著性差异(图1C)。说明既往激素治疗对现在sPD-L2的表达并未造成影响。
2.2 sPD-L2的表达与SLE患者的疾病活动程度的相关性
将患者疾病的活动程度根据SLE疾病活动指数(SLEDAI)进行了评分并根据评分结果进行分组。评分大于等于6分的列为活动期组，评分在0-5之间列入非活动期组。所有病例中，约53％SLE患者处于活动期。活动期与非活动期患者外周血sPD-L2表达均低于健康对照组，非活动期患者表达水平为3010±137.7pg/mL、活动期表达水平为2383±170.8pg/mL，活动期的表达水平明显低于非活动期(P＝0.0017)(图2A)。同时我们将sPD-L2浓度与患者SLEDAI评分进行关联分析，并未发现有显著性的相关(图2B)。但在分析sPD-L2表达水平与患者的各类临床表现相关性时，发现sPD-L2在患者并发肾受累、关节痛、口腔溃疡、蛋白尿、低补体血症时显著低表达(表2)。其中SLE并发狼疮性肾炎时sPD-L2表达水平为1418±283.2，明显低于没有狼疮性肾炎的患者(2727±117，P＝0.0036)，差异将近1倍左右。
表2 sPD-L2和临床参数间的关联
Figure BDA0002394887920000051
当数据分布确定为正态分布时，使用t检验；否则，使用非参数Mann-Whitney检验分析数据。P<0.05具有统计学意义。系统性红斑狼疮患者例数为78。
2.3 sPD-L2的表达与临床检验指标的相关性
SLE患者往往呈现血常规异样包括白细胞减少、血小板降低、血红素下降、淋巴细胞的减少、补体水平C3、C4的下降、免疫球蛋白水平的异常增高。上述检测指标的改变也可作为SLE疾病诊断的指标之一，我们将患者sB7-H3表达水平与上述临床检验指标作了相关性分析，结果见表3。发现sPD-L2表达水平与患者外周血补体的水平呈显著性正相关(图3)。sPD-L2分泌水平越低，补体水平越低。
表3:SLE患者外周血血清sPD-L2的表达水平与检验参数的相关性
Figure BDA0002394887920000061
上述数据采用非线性回归检验分析，P<0.05被认为有显著性差异。
本发明通过ELISA发现sPD-L2在SLE患者外周血中显著低表达。sPD-L2的分泌水平下降可能是产生减少或者消耗增加，申请人推测，在SLE患者血清中，sPD-L2分子，可与膜性PD-1结合，阻断T淋巴细胞表面的膜性PD-1与单核细胞、组织细胞等表面的膜型PD-L1或者PD-L2相互作用，进而激活T、B淋巴细胞，最终导致淋巴细胞持续活化、增殖，以及自身抗体的产生，进而累及多个脏器损伤包括狼疮性肾炎的发生，进一步加重SLE的免疫病理损伤。因此sPD-L2水平越低，反应疾病活动程度越强，从数据上来会发生狼疮性肾炎、关节痛以及口腔溃疡。补体C3是血清中含量最高的补体成分，由巨噬细胞和肝脏合成，补体C4是有一种多功能β1-球蛋白，研究发现活动性红斑狼疮患者血清中补体C3、C4水平降低，病情缓解时补体水平会恢复正常，表明补体C3、C4水平对系统性红斑狼疮有重要的临床意义。本研究结果显示sPD-L2水平与补体C3、C4水平呈显著正相关，揭示sPD-L2水平与系统性红斑狼疮患者免疫功能紊乱密切相关。
综上所述，本发明通过研究发现sPD-L2在SLE血清水平显著低表达，并且其表达水平与与补体C3、C4水平呈显著正相关，将sPD-L2或者sPD-L2与补体C3、C4联合作为SLE诊断、疗效评估以及预后评估的标志物，具有重要的临床价值。

Claims (6)

1.可溶性PD-L2作为SLE生物标志物在制备SLE诊疗评估试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊疗评估试剂的检测样本为血清。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊疗评估试剂为试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为ELISA检测试剂盒。
5.一种试剂组在制备SLE诊疗评估试剂中的应用，所述的试剂组包括可溶性PD-L2检测试剂和补体C3、C4检测试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，可溶性PD-L2水平与补体C3、C4水平呈正相关。
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