CN111303243B - 治疗缺血性脑损伤的小肽tat-akpd及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗缺血性脑损伤的小肽TAT‑AKPD及其应用。所述的小肽TAT‑AKPD的全序列为H‑YGRKKRRQRRR‑AKPD‑OH。使用本发明小肽TAT‑AKPD后，可以降低XIAP与Procaspase‑7的结合，减轻Procaspase‑7与XIAP转亚硝基化以及Procaspase‑7的活化，最终减轻脑缺血诱导的细胞凋亡。另外TAT能够直接将融合的小肽带入细胞，解决了药物进入细胞的途径问题，方便给药。最后，小肽TAT‑AKPD没有免疫源性，不会使机体产生免疫反应，减少了副作用，保证了二次以上给药的有效性。

Description

治疗缺血性脑损伤的小肽TAT-AKPD及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种治疗缺血性脑损伤的小肽TAT-AKPD及其应用。
背景技术
脑卒中是世界范围内导致人口死亡的三大原因之一。其中，缺血性脑卒中是脑卒中的主要类型，具有高致残率、高死亡率的特点。随着人口老龄化和各种危险因素的增加，缺血性卒中所占比例还在增加。缺血性脑卒中(脑中风)包括脑血栓形成、腔隙性梗死和脑栓塞等，约占全部脑中风的70％。脑中风过程中神经元大量死亡，造成神经元的不可逆损伤，而脑中风后所遗留的神经系统后遗症会严重影响患者生活质量。
现有的治疗缺血性脑损伤的药物主要为改善脑循环的药物、神经保护药物以及中药等。改善脑循环的药物包括溶栓剂(重组组织型纤溶酶原激活物及尿激酶等)、抗血小板(阿司匹林、氯吡格雷、替罗非班)、抗凝剂(肝素、低分子肝素、水蛭素、阿加曲班)、降纤药(降纤酶、巴曲酶、安克罗酶、蚓激酶)、扩容药、扩张血管药。这类药物仅修复血管、改善循环，但对脑缺血发生后及复灌已产生的脑损伤没有明显的治疗效果。国内常用神经保护药物有依达拉奉、胞二磷胆碱、脑活素、吡拉西坦、他汀类钙拮抗剂、兴奋性氨基酸拮抗剂、神经节苷脂等。理论上，针对急性缺血或再灌注后细胞损伤的药物(神经保护剂)可保护脑细胞、提高对缺血缺氧的耐受性。近20多年来国际上进行了多种神经保护剂研究，基础研究和动物实验结果令人鼓舞，但临床试验尚未取得满意结果。中药在我国用于治疗缺血性脑卒中已有多年。一项系统评价共纳入191个临床试验、涉及到21种中成药的荟萃分析显示其能改善神经功能缺损，但研究质量有限，需要进一步开展高质量研究予以证实。
从以上论述可知，现在临床上很多神经保护药物并不能有效的治疗脑中风所致的神经元损伤。因此，积极探索缺血性卒中的发生机制以及预防和临床治疗方法，寻找一种有效治疗缺血性脑中风导致神经元损伤和死亡的药物，有着重要的医学价值和社会意义。
发明内容
脑缺血/复灌主要触发内源性和外源性两条凋亡信号通路，分别是半胱天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)依赖的外源性信号通路和半胱天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)依赖的内源性信号通路。活化的Caspase-8最终激活下游凋亡执行蛋白Caspase-3、6、7，引起细胞发生凋亡。而活化的Caspase-9激活下游的效应半胱天冬氨酸蛋白酶如Caspase-2、3、6、7、8、10，从而启动细胞凋亡程序。如果抑制Caspase-8或Caspase-9的活化，或者抑制下游凋亡执行蛋白的活化，有可能减轻脑缺血再灌注所致的神经元损伤。
发明人的前期研究发现缺血再灌注中Procaspase-9与X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)结合增加并发生了转亚硝基化，XIAP因发生亚硝基化而失去对caspase的抑制，Procaspase-9因去亚硝基化而水解活化进而促进神经元凋亡。抑制Procaspase-9与XIAP转亚硝基化能够减轻脑缺血再灌注所致的神经元损伤和OGD/reoxygenation导致的Procaspase-9水解。本发明中，发明人从下游执行蛋白出发，通过免疫沉淀实验首次发现了缺血复灌促进了Procaspase-7与XIAP的结合且复灌3h结合程度最高，这与Procaspase-7、XIAP的亚硝基化变化趋势一致。由此发明人得出结论：在脑中风发生后，导致Procaspase-7与XIAP结合增加，由此提高了Procaspase-7与XIAP之间转亚硝基化，紧接着去亚硝基化的Procaspase-7激活，作用于下游信号通路，最终引起神经细胞凋亡，加重脑损伤。
因此，本发明的目的在于提供一种治疗缺血性脑损伤的小肽TAT-AKPD及其应用，利用一种人工合成的小肽，抑制Procaspase-7与XIAP在缺血性脑卒中的结合及转亚硝基化增加，从而抑制Procaspase-7活化所介导的凋亡信号通路，减轻脑缺血所致的神经元损伤。
发明人根据procaspase-7与XIAP结合位点的氨基酸序列，设计了小肽TAT-AKPD，Procaspase-7上AKPD四个氨基酸构成一个基序，负责与XIAP结合，而TAT来源于慢病毒上的一段11个氨基酸的序列，能够携带融合的小肽进入细胞内，能够与Procaspase-7竞争结合XIAP，抑制缺血再灌注诱导的Procaspase-7与XIAP的结合，减少XIAP的亚硝基化及Procaspase-7的去亚硝基化，即减少Procaspase-7与XIAP之间转亚硝基化，降低由此引起的Procaspase-7的去亚硝基化和水解活化，从而抑制脑缺血诱导的Procaspase-7的活化激活的下游凋亡信号通道，对缺血性脑损伤起保护作用。
本发明的治疗缺血性脑损伤的小肽TAT-AKPD，基于Procaspase-7与XIAP之间结合及转亚硝基化设计而成，由TAT和结合肽段AKPD构成，其中TAT为慢病毒上的一段11个氨基酸的序列YGRKKRRQRRR，所述的小肽TAT-AKPD的全序列为：H-YGRKKRRQRRR-AKPD-OH，TAT为氨基端，AKPD为羧基端，具体见序列表中的SEQ ID NO.1。
以本发明的小肽TAT-AKPD为活性成分，可用于制备治疗缺血性脑损伤药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
使用本发明小肽TAT-AKPD后，可以降低XIAP与Procaspase-7的结合，减轻Procaspase-7与XIAP转亚硝基化以及Procaspase-7的活化，最终减轻脑缺血诱导的细胞凋亡。另外TAT能够直接将融合的小肽带入细胞，解决了药物进入细胞的途径问题，方便给药。最后，小肽TAT-AKPD没有免疫源性，不会使机体产生免疫反应，减少了副反应，保证了二次以上给药的有效性。
附图说明
图1为缺血性脑中风中，TAT-AKPD拮抗Procaspase-7与XIAP结合从而抑制转亚硝基化、激活Procaspase-7导致细胞凋亡的过程示意图。
图2为缺血15min后复灌不同时间点(0h，0.5h，3h，6h，12h)海马CA1区Procaspase-7与XIAP的结合情况：(A)为用anti-Procaspase-7抗体进行免疫沉淀，anti-XIAP抗体进行western blot图；(B)为用anti-XIAP抗体进行免疫沉淀，anti-Procaspase-7抗体进行western blot图；(C)为各条带的灰度扫描定量后的统计分析图。
图3脑缺血再灌注诱导XIAP的亚硝基化及Procaspase-7的去亚硝基化(即二者的转亚硝基化)和Procaspase-7水解活化：(A)为缺血15min后复灌不同时间点(0h，0.5h，3h，6h，12h)用生物素转化法及免疫印迹检测海马CA1区Procaspase-7亚硝基化图；(B)为缺血15min后复灌不同时间点(0h，0.5h，3h，6h，12h)用生物素转化法及免疫印迹检测海马CA1区XIAP的亚硝基化图；(C)为缺血15min后复灌不同时间点(0h，0.5h，3h，6h，12h)用生物素转化法及免疫印迹检测海马CA1区Procaspase-7的水解活化图；(D)为各条带的灰度扫描定量后的统计分析图。
图4为小肽TAT-AKPD抑制XIAP与Procaspase-7的结合、Procaspase-7与XIAP转亚硝基化及Procaspase-7的活化：(A)为用竞争性抑制Procaspase-7与XIAP结合的干扰肽TAT-AKPD于缺血前20min侧脑室注射，然后于复灌(3h)检测Procaspase-7亚硝基化图；(B)为用竞争性抑制Procaspase-7与XIAP结合的干扰肽TAT-AKPD于缺血前20min侧脑室注射，然后于复灌(3h)检测XIAP的亚硝基化图；(C)为用竞争性抑制Procaspase-7与XIAP结合的干扰肽TAT-AKPD于缺血前20min侧脑室注射，然后于复灌(3h)检测Procaspase-7的水解活化图；(D)为各条带的灰度扫描定量后的统计分析图。
图5用焦油紫染色技术来观察小肽TAT-AKPD抑制大鼠在缺血再灌注诱导后的脑损伤效果图：其中a、b为假手术组，细胞形态为圆形、细胞核淡染，为正常形态；c、d为脑缺血/再灌注组，细胞为皱缩状的形态且数量明显减少，神经元细胞大量死亡；e、f为TAT-AKPD组的神经元细胞数量明显多于单纯缺血组，并且形态多为为圆形、细胞核淡染，神经元损伤减轻；而g、h为对照肽组，没有治疗效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本发明实施例中使用的治疗缺血性脑损伤的小肽TAT-AKPD，基于Procaspase-7与XIAP之间结合及转亚硝基化设计而成，其序列为：H-YGRKKRRQRRR-AKPD-OH，SEQ ID NO.1。
脑缺血后内源性Procaspase-7发生了去亚硝基化并水解活化，进而导致细胞凋亡。而caspases的活性又受到凋亡抑制蛋白家族(Inhibitors of apoptosis，IAPs)的调控，其中X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)通过其BIR结构域直接与Procaspase-7结合并抑制其活性。脑缺血后，XIAP发生了亚硝基化，从而抑制了自身的抗凋亡活性。
根据Procaspase-7与XIAP结合位点的氨基酸序列，设计了小肽TAT-AKPD，Procaspase-7上AKPD四个氨基酸构成一个基序，负责与XIAP结合；TAT来源于慢病毒上的一段11个氨基酸的序列YGRKKRRQRRR，能够携带融合的小肽进入细胞内。由此，干扰肽全序列为：H-YGRKKRRQRRR-AKPD-OH，为了验证是否其它肽也有类似作用，同时合成了与结合位点氨基酸序列不同的对照肽：H-YGRKKRRQRRR-MMLL-OH。小肽交由专门合成肽类和蛋白质的生物公司合成。
动物模型制备：选择健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，体重250±10g。动物以20％水合氯醛(300～350mg/kg)腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，电凝椎动脉。手术第2天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血15min，再灌注特定时间点。缺血时保持其直肠温度在36.5～37.5℃。鉴定大鼠脑缺血模型标准如下：缺血前大鼠处于完全清醒状态，其生命体征正常。缺血后30-60秒内大鼠即失去知觉和活动能力，翻正反射消失，呈现角弓反张，同时痛觉消失，双侧瞳孔散大，对强光刺激闭睑反射消失，眼球颜色灰白(正常为鲜红色)。再灌后眼球颜色立即恢复红色，瞳孔回缩。缺血15min需再灌约1h后才能恢复自主活动。假手术组处理同手术组，但不结扎双侧颈总动脉。
小肽给药：TAT融合肽100μg溶于10μl生理盐水，于缺血前20min侧脑室注射给药。对照组注射相同体积的生理盐水作为溶剂对照。
样品制备：缺血不同时间后，断头快速取脑，分离双侧海马，沿海马裂分离出CA1区，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马加匀浆缓冲液，用Glas-col匀浆器高速匀浆(10s×6次)，冰浴上超声破碎(10s×3次)，10000g 4℃离心15min，小心移取上清液。
蛋白含量测定：采用BCA微量法，以牛血清白蛋白(BSA)5mg/ml为标准蛋白。
蛋白S-亚硝基化测定：采用Jaffrey和Snyder报道的‘生物素转化法’(Biotin-Swich method)，在实验过程中要避光和使用毛面试管。检测Procaspase-9与XIAP的转亚硝基化。
免疫沉淀与免疫印迹：以下操作均在4℃条件下进行：含相同蛋白量(400μg)的样品中，加入5倍体积IP缓冲液，以25μl蛋白A/G-琼脂糖预吸附1h，12000g离心2min，取上清，加入1-2μg抗体，旋转混匀器上反应4h或过夜，再加入25μl蛋白A/G-琼脂糖，旋转混匀器上反应2h，12000g离心2min，沉淀用IP缓冲液洗3遍。加入1/3体积4×sample buffer，混匀后置沸水浴中5min以洗脱琼脂糖上结合的蛋白，10000g离心2min，吸取上清用于免疫印迹。参考Sambrook等方法，含相同蛋白量的样品中加入1/3体积4×sample buffer，置沸水浴中5min变性处理。取等量的变性蛋白质样品(100μg)或IP处理后样品，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis；PAGE)分离后，以半干转法电转移至NC膜上。将NC膜置封闭液中室温孵育6h后，加入一抗工作液，4℃孵育4h或过夜，TBST洗膜(5min×3)后，加入碱性磷酸酶标记的二抗的工作液，室温孵育2h，TBST洗膜(5min×3)。使用NBT/BCIP试剂盒，在新鲜配制的AP显色液中显色，流水洗涤终止反应。扫描膜上显色条带并以Quantity One软件分析处理。
组织学方法：大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后，开左胸暴露心脏，将针头自心尖穿过左心室插入主动脉，先用38℃左右生理盐水约100ml快速灌洗，然后复灌入冰冷的4％的多聚甲醛250-300ml，30分钟内灌完，灌注后的大鼠断头取脑将其直接用4％的多聚甲醛后固定12小时左右。流水冲洗，冲洗时间同固定时间。然后70％(4h)、80％(4h)、90％(4-12h)、95％(2h×2次)、100％(2h×2次)梯度酒精脱水，二甲苯透明(1.5h)、60℃浸蜡(1h×3次)。取出包埋，4℃保存。石蜡切片机切片，厚5μm。45℃温水中贴片于明胶处理过的载玻片上，40℃烘烤过夜。切片经三次二甲苯脱蜡，100％、90％、70％梯度酒精浸水，0.1％焦油紫(Cresyl violet)染色10-20分钟，按常规方法70％、80％、95％、100％梯度酒精分色，光镜下观察神经元紫色而背景基本无色为止。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片后，光镜观察。在高倍镜下观察海马CA1区神经元，有清楚的细胞核，胞体着色良好的计为成活神经元，成活神经元密度表示为1mm2面积内成活大锥体神经元的数量。
数据处理：所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示，统计学方法采用ANOVA，多个实验组与一个组的比较采用Dunnett检验，多个实验组之间的比较采用q检验(Newman-keuls法)，P<0.05为差异有统计学意义。
图1为缺血性脑中风中，TAT-AKPD拮抗Procaspase-7与XIAP结合从而抑制转亚硝基化、激活Procaspase-7导致细胞凋亡的过程示意图。缺血性脑中风中，产生大量自由基NO，使XIAP发生亚硝基化(图1中①所示)；同时，与XIAP相结合的Procaspase-7(Casp7)转亚硝基到XIAP(图1中②所示)。XIAP亚硝基化后对Procaspase-7的抑制作用降低，同时，Procaspase-7去亚硝基化后被活化，剪切为有活性的caspase-7，引起细胞凋亡。使用小肽Tat-AKPD后，降低XIAP与Procaspase-7的结合，减轻Procaspase-7与XIAP转亚硝基化以及Procaspase-7的活化，最终减轻脑缺血诱导的细胞凋亡。
采用SD大鼠全脑缺血模型为研究对象，采用免疫共沉淀来检测缺血15min后复灌不同时间点(0h，0.5h，3h，6h，12h)海马CA1区Procaspase-7与XIAP的结合情况，分别用anti-Procaspase-7或anti-XIAP抗体进行免疫沉淀，anti-XIAP或anti-Procaspase-7抗体进行western blot。结果显示：脑缺血再灌注后，Procaspase-7与XIAP的结合增强并在3h结合程度最高。这种空间上的接近并且有利于缺血再灌注中Procaspase-7与XIAP发生结合并且转亚硝基化(见图2)。
选取缺血15min后复灌不同时间点(0h，0.5h，3h，6h，12h)用生物素转化法及免疫印迹检测海马CA1区Procaspase-7与XIAP的亚硝基化及Procaspase-7的水解活化。结果显示：缺血再灌注导致Procaspase-7发生了去亚硝基化及水解活化，XIAP发生亚硝基化，且这些变化均在3h最明显。这表明缺血再灌注中Procaspase-7与XIAP可能发生了转亚硝基化并促进Procaspase-7水解活化，并且二者之间的转亚硝基化和procaspase-7的水解活化相一致(见图3)。
实验组用竞争性抑制Procaspase-7与XIAP结合的干扰肽TAT-AKPD于缺血前20min侧脑室注射，对照组给予对照肽TAT-MMLL，然后于复灌3h取海马为样品，用免疫沉淀和免疫印迹检测Procaspase-7与XIAP的结合、转亚硝基化及Procaspase-7的水解活化。结果显示：抑制实验组小肽TAT-AKPD能抑制Procaspase-7与XIAP结合(见图4)及XIAP的亚硝基化，Procaspase-7的去亚硝基化和水解活化(见图4)，表明Procaspase-7与XIAP转亚硝基化是与结合有关的，并且实验肽能够抑制这种作用。
用焦油紫染色技术来观察TAT-AKPD对缺血再灌注导致的海马CA1区神经元损伤的影响。结果显示：在假手术组，细胞形态为圆形、细胞核淡染。而在单纯缺血组，细胞为皱缩状的形态且数量明显减少。TAT-AKPD组的细胞数量明显多于单纯缺血组，并且形态多为圆形、细胞核淡染。这表明TAT-AKPD抑制Procaspase-7与XIAP的结合、转亚硝基化能减轻缺血再灌注导致的海马CA1区神经元损伤(见图5)。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 治疗缺血性脑损伤的小肽TAT-AKPD及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Lys Pro Asp
1 5 10 15

Claims (2)

1.治疗缺血性脑损伤的小肽TAT-AKPD，其特征在于，由TAT和结合肽段AKPD构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.治疗缺血性脑损伤的药物，其特征在于，药物的活性成分含有权利要求1所述的小肽TAT-AKPD。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105777868A (zh) * 2015-11-26 2016-07-20 许铁 一种治疗缺血性脑损伤的小肽tat-avpy及其应用
CN110787284A (zh) * 2019-11-23 2020-02-14 胡书群 一种治疗缺血性脑损伤的混合小肽tat-shc及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006084179A2 (en) * 2005-02-03 2006-08-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Hiv tat-cd4 hybried molecules and methods of use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105777868A (zh) * 2015-11-26 2016-07-20 许铁 一种治疗缺血性脑损伤的小肽tat-avpy及其应用
CN110787284A (zh) * 2019-11-23 2020-02-14 胡书群 一种治疗缺血性脑损伤的混合小肽tat-shc及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Procaspase-9 induces its cleavage by transnitrosylating XIAP via the Thioredoxin system during cerebral ischemia-reperfusion in rats;Dengyue Zhang等;《Scientific Reports》;20160407;第6卷(第24203期);1-12 *
Procaspase-9与XIAP之间转亚硝基化在缺血性脑损伤中的作用及机制;张登月;《万方数据资源检索平台》;20140225;1-68 *
RIP3 S-nitrosylation contributes to cerebral ischemic neuronal injury;Wanying Miao等;《Research Report》;20150828;第627卷;165-176 *

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