CN111298102B

CN111298102B - 一种采用抗菌肽和富勒烯联合抗菌方法

Info

Publication number: CN111298102B
Application number: CN202010131067.4A
Authority: CN
Inventors: 元冰; 窦玉江; 杨恺; 卢雪梅; 刘娇娇
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: CN111298102A

Abstract

本发明公开了一种采用抗菌肽和富勒烯联合抗菌方法，属于生物医药技术领域。本发明利用富勒烯预处理细胞膜，将富勒烯插入膜内，能有效地提高Mel在脂膜上的成孔能力，即提高Mel的杀菌功能。富勒烯能够作为增敏剂、提高细胞膜对抗菌肽的敏感度、从而降低抗菌肽发生作用的临界浓度，提高抗菌肽在低浓度下的作用效率。

Description

一种采用抗菌肽和富勒烯联合抗菌方法

技术领域

本发明涉及一种采用抗菌肽和富勒烯联合抗菌方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

细菌对于传统抗生素的耐药性问题正在严重威胁全球人类的健康。因此，我们迫切需要开发出一类新型的、不易产生耐药性的抗菌药物。抗菌肽(AMPs)是一种天然存在的、具有广谱抗菌功能的多肽。与传统抗生素的抗菌机制不同，抗菌肽是通过破坏细菌的细胞膜、导致内容物的泄漏而直接杀死细菌，这一杀菌方式很难被细菌克服。因此抗菌肽被认为是一类极具潜力的抗菌药物。目前，抗菌肽面临抗菌效率低、易水解降解和对哺乳动物细胞毒性等缺点，限制了其临床应用。我们的目的是提高抗菌肽的杀菌效率、降低生物毒性。

蜂毒肽(Mel)作为一种典型的天然抗菌肽，具有高效的、广谱的杀菌能力，并且它具有与传统抗生素不同的独特的杀菌机制：它通过在细菌的细胞膜上打孔、导致细菌内容物的泄漏和细菌死亡。这一杀菌机制不容易产生耐药性。然而，它的缺点限制了其临床应用，例如需要较高的临界浓度才能发挥杀菌作用，同时高浓度会带来细胞毒性和高成本问题等。因此迫切需要提高其在低浓度下的破膜杀菌效率。

发明内容

为解决上述问题，本发明利用富勒烯预处理细胞膜，它能够作为增敏剂、提高细胞膜对蜂毒肽的敏感度、从而降低蜂毒肽发生作用的临界浓度，提高蜂毒肽在低浓度下的作用效率。

本发明的第一个目的是提供一种采用抗菌肽和富勒烯联合抗菌方法，所述方法是采用富勒烯预处理1～30min，再采用抗菌肽联合处理。

进一步地，所述的富勒烯预处理通过采用富勒烯分散液处理感染区域。

进一步地，所述的富勒烯分散液的浓度为5～25μg mL^-1。

进一步地，所述的抗菌肽处理通过采用抗菌肽溶液对感染区域进行外用。

进一步地，所述的抗菌肽为蜂毒肽、LL-37或PGLa。

进一步地，所述的蜂毒肽的浓度为0.5～1.5μg mL^-1。

本发明的第二个目的是提供一种抗菌药物组合物，所述的抗菌药物组合物包括抗菌肽和富勒烯。

进一步地，所述的抗菌肽为蜂毒肽溶液，浓度为0.5～1.5μg mL^-1。

进一步地，所述的富勒烯为富勒烯分散液，浓度为5～25μg mL^-1。

本发明的第三个目的是提供富勒烯在制备抗菌肽类抗菌药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明将富勒烯(例如C60)插入膜内，能有效地提高Mel在脂膜上的成孔能力，即提高Mel的杀菌功能。通过定量描述染料分子进入巨囊泡(GUVs)的动力学过程和分子动力学(MD)模拟，结果表明，C60激活Mel的膜活性的关键是在膜内形成了C60-Mel复合物，该复合物的形成导致了跨脂双层的非对称压力分布，从而导致Mel跨膜插入及成孔效率的显著增强。本发明利用富勒烯预处理细胞膜，它能够作为增敏剂、提高细胞膜对蜂毒肽的敏感度、从而降低蜂毒肽发生作用的临界浓度，提高蜂毒肽(在低浓度下)的作用效率。

附图说明

图1为C60提高了Mel的跨膜成孔导致染料分子泄漏的效率；A，纯Mel在3.0μg mL^-1浓度下导致GUV的成孔和泄漏过程；B，以C60预处理GUV后加入Mel，即使Mel在低浓度1.25μgmL^-1时也能够很快的导致GUV发生成孔和泄漏；C60浓度为C60与脂分子的摩尔比为C/L＝1/100。图像为共聚焦显微镜照片，拍摄通道为绿色(钙黄绿素)通道和红色(脂分子)通道；

图2为C60对Mel膜成孔效率的影响；A不同浓度Mel导致GUV发生成孔和染料分子跨膜进入GUV内部的动力学曲线，以及C/L＝1/100浓度的C60预处理后，不同浓度Mel导致GUV发生成孔和染料分子跨膜的动力学曲线；B不同条件下，染料分子进入率的比较；包括纯Mel的作用，C/L＝1/100及1/200浓度的C60预处理后、Mel的作用；

图3为分子动力学模拟研究纯Mel、C60+Mel与膜的相互作用过程；A纯C60不会导致膜成孔；B纯Mel无法插膜成孔；C C60+Mel的插膜成孔过程，在膜内形成了C60-Mel复合体；DC60-Mel复合体中，两个Mel的所有氨基酸残基与C60的相互作用能分析；其中第12号残基是Mel与C60的主要作用位点；

图4为C60的加入降低了Mel跨膜插入所需要克服的自由能势垒。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明实施例是基于细胞模型进行的：

制备模型细胞膜模型：

使用由1,2-二元醇-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)脂质组成的微米级单层巨囊泡GUVs(尺寸约7-15μm)模拟细菌膜，制备方法是传统的“电形成法”或“稳柔水化法”。

实施例1：在未经C60预处理情况下的天然Mel的作用效果检验

GUVs分散在1mM钙黄绿素水溶液中，钙黄绿素是一种水溶性膜不透性染料。因此，钙黄绿素进入GUV膜内部的动力学过程可以很好地描述多肽作用下GUV膜的成孔过程，甚至包括孔的数量和大小等性质。在我们的实验中，原始的GUVs在钙黄绿素溶液中保持稳定超过4小时，钙黄绿素没有进入内部。然而，在添加Mel后，一旦Mel的浓度增加到3.0μg mL^-1的阈值(即肽脂摩尔比P/L＝1/24，图1A)，就观察到钙黄绿素跨膜进入GUVs内部；同时，GUVs保持完整，说明Mel作用在GUVs上形成跨膜孔。

Mel的作用是浓度依赖性的，Mel浓度越大，成孔速率越快、染料分子的跨膜传输速率也越快。这一动力学过程可以定量表征。在不同的肽浓度下，分别统计出Mt/M∞随时间的变化规律(Mt和M∞分别是t时GUV内部和周围环境的荧光强度)。如图2A，实心三角、方形、圆形，分别对应着Mel浓度为1.0，3.0和5.0μg mL^-1下，Mel导致染料分子泄露过程的动力学曲线。

这些曲线大致包括三个阶段，包括初始的指数增加，随后是近似线性依赖关系，直到接近饱和平台；这些阶段对应于膜上Mel的逐渐积累和穿孔，稳定的跨膜扩散(膜上的孔的数目和尺寸为稳定值)，以及跨膜扩散达到平衡。因此，我们以中间线性增长阶段的斜率，作为此种情况下的“扩散速率”，从而对不同情况下的染料跨膜速率作定量比较。从图2B中可以看出，5.0μg mL^-1浓度下的跨膜速率大约是3.0μg mL^-1浓度下的两倍以上。这体现了Mel作用能力的浓度依赖性。

实施例2：经C60预处理后，Mel作用效果检验

C60的加入显著提高了Mel膜的工作效率。我们将其与实施例1中的结果作比较。比较的方法分两种，一是Mel的临界作用浓度降低，二是相同浓度下的破膜成孔效率提高。

在我们的实验中，少量的C60(C60与脂质之比C/L＝1/100，远低于细胞毒性剂量)被用来预处理脂膜。C60分子由于其疏水表面和较小的尺寸，因此应位于脂质双层的疏水中间层内。C60预处理过的GUV在钙黄绿素溶液中稳定了4h以上，没有钙黄绿素进入。然而，即使加入极低浓度的Mel(例如1.25、1.0、甚至0.5μg mL^-1)，也立即观察到钙黄绿素明显进入GUVs(图1B)。这清楚地表明，C60的加入大大降低了Mel的临界工作浓度，或者C60即使在较低浓度下也能有效地激活Mel的跨膜成孔能力。

C60的摩尔浓度为，C/L＝1/200或1/100

C60预处理GUV的时间为，几分钟～30分钟

【临界作用浓度比较】

C60浓度为0时，蜂毒肽的临界成孔浓度为3.0μg mL^-1(多肽/脂分子比例1/24)；

C60浓度为1/200时(C60/脂分子)，蜂毒肽的临界成孔浓度为<0.5μg mL^-1(多肽/脂分子比例1/167)；

C60浓度为1/100时，蜂毒肽的临界成孔浓度为<0.5μg mL^-1(多肽/脂分子比例1/167)；

如图1B中所示，经C60预处理后，即使Mel在低浓度1.25μg mL^-1时也能够很快的导致GUV发生成孔和泄漏。

【相同浓度下的破膜成孔效率比较】

在不同的肽浓度下，钙黄绿素进入这种C60预处理过的GUVs的动力学不同。如图2A中，空心的上三角、下三角、菱形，分别是Mel浓度为0.5、1.0、1.25μg mL^-1下的染料分子跨膜泄漏过力学过程。明显比相同浓度下的纯Mel作用效率高得多。我们定量统计了不同情况下的“进入率”，并总结于图2B中。图中可以看出，即使在最低肽浓度为0.5μg mL^-1的情况下，钙黄绿素的进入率也比在没有C60的情况下使用5.0μg mL^-1Mel的情况高出11％。这充分说明了C60预处理能够提高Mel的破膜成孔效率。

此外，C60的预处理降低了染料泄露过程对Mel的浓度依赖性。如图2B，经C/L＝1/100浓度的C60预处理情况下，不同多肽浓度作用下的钙黄绿素的进入率是相似的。同样，当我们将GUVs中C60的量减少到之前浓度的一半(C/L＝1/200)时，不同多肽浓度作用下的钙黄绿素的进入率也是相似的，并且，这一进入率仅依赖于C60的浓度。

多肽在膜上的吸附和聚集会对局部膜区域造成结构扰动，这一扰动是多肽实现跨膜穿孔的关键。已知富勒烯由于其较小的尺寸和表面疏水性，在与细胞膜发生作用时，富勒烯倾向于插入膜内、并停留在疏水尾链层间。然而以往的研究结果显示，插入膜内的富勒烯并不会对细胞膜的结构和性质、脂分子的组装结构或行为等带来明显的扰动。然而，对于C60预处理膜，尽管它仍然完整，但膜在局部区域一定受到了C60的结构干扰。因此，当Mel分子扩散到这些缺陷区域时，即使只有少数Mel分子，也很容易形成跨膜孔。这很好地解释了实验中观察到的C60和Mel浓度对钙黄绿素进入率的不同影响。

实施例3：C60、Mel与膜分子相互作用机理的分子动力学(MD)模拟

为了从分子水平上了解C60对Mel膜活性的激活作用，采用粗粒化(CG)Martini力场进行了分子动力学(MD)模拟。

我们首先模拟了纯C60或纯Mel与膜的相互作用过程(图3A-B；C60浓度C/L＝1/85，多肽浓度P/L＝1/85)。在这两种情况下均未观察到明显的膜的结构缺陷。然而，当C60和Mel一起被加入到膜中时，C60迅速插膜，多肽也迅速聚集成团，在膜中形成C60-Mel复合物(图3C)。同时，与纯Mel情况相比，膜的破坏程度明显增加，膜缺陷面积增加了4倍。此外，C60浓度的增加将产生更强烈的膜缺陷面积，这与我们的实验观察结果非常一致。

通过定量分析Mel跨膜插入的自由能垒，也反映了C60对Mel膜活性的增强，该自由能垒由于C60的加入而降低了41％(即从49.83kJ/mol降低到29.47kJ/mol；图4)。在膜相互作用过程中，C60-Mel络合物的形成至关重要。如图3D所示，复合物的结构显示了多肽的弯曲变形；C60与Mel的每个残基之间的相互作用能的分布，显示了C60与多肽的疏水G12残基(以箭头标记)之间的特异性强亲和力。C60-Mel复合物的形成对膜的两个单分子膜产生非对称扰动。这种对膜的非对称扰动对于Mel的跨膜成孔是至关重要的。总之，我们的分子动力学模拟证明了C60-Mel复合物的形成以及它对于Mel成孔杀菌活性的增强效果。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.由富勒烯和蜂毒肽组成的组合物在制备外用抗菌药物中的应用，其特征在于，先富勒烯预处理1~30 min，再采用蜂毒肽联合处理。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，富勒烯预处理通过采用富勒烯分散液处理感染区域。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的富勒烯分散液的浓度为5~25 μg mL^-1。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，蜂毒肽联合处理通过采用蜂毒肽溶液对感染区域进行外用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的蜂毒肽溶液的浓度为0.5~1.5 µgmL^-1。