CN111254111A - 靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,公开了一种靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞及其制备方法。所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞的制备方法包括:无菌下抽取患者丈夫或血缘亲属或无关自愿健康个体静脉血约20ml左右,肝素抗凝;在无菌条件下,用等体积人淋巴细胞分离液加入离心管,再将抗凝的全血缓慢加入人淋巴细胞分离液上层,4℃、800~1200转/分钟缓升缓降离心;吸管吸取分离出的白膜层,生理盐水洗涤重悬后800~1200转/分钟离心,重复3次,去除残余的血清、红细胞等,将其制备成密度为(2~4)×107/毫升的细胞混悬液,4℃暂存。本发明提高受孕率,减少流产率,使妊娠的成功率达到(70~80)%以上。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及一种靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞及其制备方法。
背景技术
目前,最接近的现有技术:不孕不育分为不孕症和不育症。育龄夫妇同居一年以上,有正常性生活,在没有采用任何避孕措施的情况下,未能成功怀孕称不孕症。虽能受孕但因种种原因导致流产、死胎而不能获得存活婴儿的称为不育症。因男性原因导致配偶不孕者,称男性不孕症或男性不育症,习惯称男性不育。习惯性流产又称复发性流产,为自然流产达两次及两次以上者,每次流产往往发生在同一妊娠月份。中医称为“滑胎”。根据《2012年中国育龄女性生育环境抽样调查》公布的数据显示,中国不孕不育夫妻已超过5000万人。平均每8对夫妻中就有1对不能生孩子,而且不孕不育呈年轻化趋势。就其原因非常复杂,生殖器官的发育异常、炎症、肿瘤、内分泌的失衡、免疫因素等都可能是导致不孕不育的罪魁祸首。然而,近年来研究发现,免疫学因素的参与和某些患者的发病有密切的关系。
现代生殖免疫学认为,妊娠是成功的半同种移植过程,在母体免疫功能正常时,既保护母体不受外来微生物的侵犯,又对宫内胚胎移植物不发生免疫排斥反应,并维持妊娠的继续。
正常妊娠时,夫妇HLA(即人类白细胞抗原,HumanLeukocyteAntigen)不相容,胚胎所携带父源性HLA(在滋养细胞表面)可刺激母体免疫系统产生封闭抗体,即抗配偶淋巴细胞特异性IgG抗体APLA(即封闭抗体,antiphospholipidantibody),可与滋养细胞表面HLA结合,覆盖来自父系HLA,抑制混合淋巴细胞反应,从而封闭母体淋巴细胞对滋养层细胞的细胞毒作用,保护胚胎或胎儿免受排斥。而包括习惯性流产(RSA)在内的免疫性不孕是由于母体不能识别父系抗原而产生的保护性反应。
习惯性流产约占总妊娠数的0.5%~5%,其发病机制复杂,涉及遗传学、生殖内分泌学等多种病因,原因不明者约占41.18%~60.00%,其中80%与免疫因素有关。
综上所述,现有技术存在的问题是:
(1)包括习惯性流产(RSA)在内的免疫性不孕是由于母体不能识别父系抗原而产生的保护性反应。
(2)习惯性流产发病机制复杂,原因不明者约占41.18%~60.00%,其中80%与免疫因素有关。
解决上述技术问题的难度:针对习惯性流产,现有的技术在预防习惯性流产上主要采取卧床静养,禁止性生活,宫颈内口松弛修补术、宫颈环扎术、补充激素、维生素类药物,适当采用中药治疗外,没有更好的办法。而不能从根本上解决因为封闭抗体缺乏等免疫因素导致的流产或不孕的发生。
解决上述技术问题的意义:本发明采用生物治疗的全新理念,针对封闭抗体缺乏等免疫排斥所致的流产,利用其配偶(或无关自愿健康个体)的外周血有核细胞,经过分离纯化后注射到患者皮下,刺激其产生封闭抗体,有助于正常受孕并避免受孕后因为免疫排异而导致的流产。该技术所涉及的细胞采集、分离、纯化方便,妊娠前后治疗时间节点的选择科学,有助于封闭抗体的形成和维持,可大大提高封闭抗体的转阳率以及对妊娠后胎儿的保护,方法简单易操作,患者依从性好。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞及其制备方法。
本发明是这样实现的,一种靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞及其制备方法。(细胞为其配偶或无关自愿健康个体的外周血有核细胞,主要包括中性粒细胞、淋巴细胞等。在人体外周血中,中性粒细胞为(4-10)×109/L,淋巴细胞为(0.8-4.0)×109/L。另外,还包括少量嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞和单核细胞等。这些有核细胞所含的染色体作为抗原物质,经过多次反复注射到患者体内后,引起免疫应答,进而诱导机体产生具有保护胚胎功能的封闭抗体。当患者受孕时,在有封闭抗体的保护下,能够避免胎儿受到母体免疫系统的识别和杀伤,受精卵能顺利着床定植,维持妊娠过程的顺利进行,就不会受到母体的排异而流产。)
所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞的制备方法包括:
步骤一,无菌下抽取患者丈夫或血缘亲属或无关自愿健康个体静脉血约20ml左右,肝素抗凝;
步骤二,在无菌条件下,用等体积人淋巴细胞分离液加入离心管,再将抗凝的全血缓慢加入人淋巴细胞分离液上层,4℃、800~1200转/分钟缓升缓降离心;
步骤三,吸管吸取分离出的白膜层,生理盐水洗涤重悬后800~1200转/分钟离心,重复3次,去除残余的血清、红细胞等,将其制备成密度为(2~4)×107/毫升的有核细胞混悬液,4℃暂存。
进一步,靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞产品的治疗方法为:
(1)将有核细胞悬液总计2毫升于患者两前臂内侧行多点皮下或皮内注射,每侧注射3~4点,共6~8点;
(2)每2周治疗1次,4~6次为一疗程;
(3)治疗一疗程(4次),在最后一次注射后的第7~10天左右复查封闭抗体,若已转为阳性,要求3~5个月内尽快妊娠;
(4)确诊妊娠后,再加强一疗程(2~3周1次,共4~5次)至妊娠14周;
(5)若封闭抗体转阳后半年内仍未能妊娠,应每隔8周巩固1次,使封闭抗体保持阳性;
(6)如有少数复查封闭抗体阴性者,需再加强治疗2次,若仍未转阴也可备孕。
进一步,所述治疗方法可作为紧急保胎治疗:既往有习惯性流产,现处于妊娠早期的孕妇要尽早行该治疗,每周1次,连续干预6~8次。
进一步,采用所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞可能会出现不良反应,处理方法如下:
少数患者接受有核细胞皮下或皮内注射后,出现局部瘙痒、色素沉着、硬结等属正常的免疫反应,可给予热敷处理,数天后自然消退,再次治疗上述症状会逐渐减轻或消失。
综上所述,本发明的优点及积极效果为:本发明靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞产品是针对免疫因素所致的习惯性流产、免疫性不孕包括隐匿性流产患者,从患者丈夫(或第三方)体内取静脉血经过无菌分离,提取出有核细胞,将其制备成细胞混悬液,经皮下或皮内注射到患者体内,使患者产生封闭抗体,为受孕及妊娠过程构筑一道安全屏障,从而最大限度地接纳和保护受精过程不被阻挡,减少免疫性流产的发生。该细胞产品通过抑制母胎间的细胞性免疫性排斥反应,提高受孕率,减少流产率,使妊娠的成功率达到(70~80)%以上。
附图说明
图1是本发明实施例提供的靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
如图1所示,本发明实施例提供的靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞的制备方法包括:
S101:无菌下抽取患者丈夫或血缘亲属或无关自愿健康个体静脉血约20ml左右,肝素抗凝;
S102:在无菌条件下,用等体积人淋巴细胞分离液加入离心管,再将抗凝的全血缓慢加入人淋巴细胞分离液上层,4℃、800~1200转/分钟缓升缓降离心;
S103:吸管吸取分离出的白膜层,生理盐水洗涤重悬后800~1200转/分钟离心,重复3次,去除残余的血清、红细胞等,将其制备成密度为(2~4)×107/毫升的有核细胞混悬液,4℃暂存。
进一步,靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞产品的治疗方法为:
(1)将有核细胞悬液总计2毫升于患者两前臂内侧行多点皮下或皮内注射,每侧注射3~4点,共6~8点;
(2)每2周治疗1次,4~6次为一疗程;
(3)治疗一疗程(4次),在最后一次注射后的第7~10天左右复查封闭抗体,若已转为阳性,要求3~5个月内尽快妊娠;
(4)确诊妊娠后,再加强一疗程(2~3周1次,共4~5次)至妊娠14周;
(5)若封闭抗体转阳后半年内仍未能妊娠,应每隔8周巩固1次,使封闭抗体保持阳性;
(6)如有少数复查封闭抗体阴性者,需再加强治疗2次,若仍未转阴也可备孕。
进一步,所述治疗方法可作为紧急保胎治疗:既往有习惯性流产,现处于妊娠早期的孕妇要尽早行该治疗,每周1次,连续干预6~8次。
进一步,采用该细胞产品治疗前需要进行以下检查,排除可能引起流产和不孕的其他因素及可能影响治疗效果的各种因素,包括:
(1)夫妇双方染色体检查正常,无家族遗传病史。
(2)双方行TORCH(包括巨细胞病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒和弓形体)、梅毒、HIV、乙型肝炎、丙型肝炎检查均为阴性。
(3)生殖道衣原体、支原体、淋球菌等检查均为阴性。
(4)内分泌检查、甲状腺功能及空腹血糖正常。
(5)抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗心磷脂抗体等均为阴性。
(6)排除生殖道畸形和形态学异常。
(7)男方精液分析正常。
(8)治疗前3个月内未使用过调节免疫功能的药物,未经任何免疫治疗。
进一步,本发明实施例提供的靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞适用于以下患者:
(1)Ⅰ类免疫紊乱(封闭抗体缺乏)。
(2)包括不明原因的反复性自然流产在内的不孕不育患者(生化妊娠及早期(12周前)自然流产史≥2次,或胚胎停育≥2次,或自然流产+胚胎停育≥2次)。
(3)夫妇DQ-a相容性大,或夫妇间有2个或2个以上相同的HLA抗原。
(4)无抗父亲淋巴细胞毒抗体。
(5)微细胞毒交叉试验阴性。
(6)全身免疫状态正常。
(7)夫妻双方均愿意接受治疗。
进一步,靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞可用于既往有习惯性流产,现处于妊娠早期,但妊娠前未接受免疫性不孕不育细胞靶向治疗技术治疗的孕妇,行紧急保胎治疗。
进一步,靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞在以下情况禁用,包括:
(1)女性染色体异常、生殖器畸形、内分泌功能紊乱相关疾病、感染性疾病等非免疫因素所致的不孕不育;
(2)男性染色体异常以及患有传染性疾病者。
女性患者内分泌功能紊乱相关疾病或感染性疾病应先行相关治疗,经复诊正常后方可纳入该细胞产品治疗。男性患感染性疾病应抗感染治疗,也可采用第三方作为有核细胞供者进行该治疗。
进一步,采用所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞用注意:
(1)患者清晨空腹抽血行相关检测,避开月经期,有生病情况者,康复后再行抽血化验。
(2)供者(患者丈夫或第三方)清晨空腹抽血,前一天避免饮酒等,注意休息,有生病情况者,康复后再行抽血。
(3)第1疗程(孕前)治疗期间避孕,每次治疗后观察半小时,无不适方可离院。
(4)1疗程结束后7~10天复查封闭抗体,阳性者尽快妊娠,未孕者则每2月后加强治疗1次,避免封闭抗体转阴。
(5)一旦妊娠,及早保胎治疗,保持乐观情绪,按规定行产前检查,动态观察检验指标。
(6)治疗期间不要随意使用可能影响免疫功能的药物,如糖皮质激素、免疫抑制剂等药物。
进一步,采用所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞可能会出现不良反应,处理方法如下:
少数患者接受有核细胞皮下或皮内注射后,出现局部瘙痒、色素沉着、硬结等属正常的免疫反应,可给予热敷处理,数天后自然消退,再次治疗上述症状会逐渐减轻或消失。
本发明靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞产品防治流产、治疗不孕的主要机制是由于淋巴细胞免疫可提高患者的免疫反应性,使其获得封闭抗体,防止胚胎或胎儿父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤所产生的免疫保护。按本发明提供的方法生产的靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞产品有效安全,并且封闭抗体对再次妊娠结局有良好的预示价值。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
实验数据:治疗组,治疗前后封闭抗体的变化:治疗前封闭抗体阳性率为12.11%,治疗一个疗程(12周)后,封闭抗体阳性率为53.784%,治疗前后有显著性差异。
表1 靶向治疗对妊娠结局的影响
与对照组相比,*P<0.05
靶向治疗组患者妊娠成功率高于对照组,再次流产率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。有核细胞靶向治疗有助于促进妊娠的成功率,改善习惯性流产患者的妊娠结局,同时调节免疫功能,增强母体对胎儿的免疫耐受。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞及其制备方法,其特征在于,所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞的制备方法包括:
步骤一,无菌下抽取患者丈夫或血缘亲属或无关自愿健康个体静脉血约20ml左右,肝素抗凝;
步骤二,在无菌条件下,用等体积人淋巴细胞分离液加入离心管,再将抗凝的全血缓慢加入人淋巴细胞分离液上层,4℃、800~1200转/分钟缓升缓降离心;
步骤三,吸管吸取分离出的白膜层,生理盐水洗涤重悬后800~1200转/分钟离心,重复3次,去除残余的血清、红细胞等,将其制备成密度为2~4×107/毫升的细胞混悬液,4℃暂存。
2.如权利要求1所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞及其制备方法,其特征在于,靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞产品的治疗方法为:
(1)将有核细胞悬液总计2毫升于患者两前臂内侧行多点皮下或皮内注射,每侧注射3~4点,共6~8点;
(2)每2周治疗1次,4~6次为一疗程;
(3)治疗4次,在最后一次注射后的第7~10天左右复查封闭抗体,若已转为阳性,要求3~5个月内尽快妊娠;
(4)确诊妊娠后,再加强2~3周1次,共4~5次至妊娠14周;
(5)若封闭抗体转阳后半年内仍未能妊娠,应每隔8周巩固1次,使封闭抗体保持阳性;
(6)如有少数复查封闭抗体阴性者,需再加强治疗2次,若仍未转阴也可备孕。
3.如权利要求2所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞产品的治疗方法,其特征在于,所述治疗方法可作为紧急保胎治疗:有习惯性流产,正处于妊娠早期的孕妇尽早进行该治疗,每周1次,连续干预6~8次。
4.如权利要求1所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞及其制备方法,其特征在于,采用所述靶向治疗习惯性流产和免疫性不孕的细胞可能会出现不良反应,处理方法如下:
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