CN111228307B - 巨噬细胞在保护血管屏障中的应用以及卵巢癌腹水的预防、抑制和治疗 - Google Patents

巨噬细胞在保护血管屏障中的应用以及卵巢癌腹水的预防、抑制和治疗 Download PDF

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Abstract

本发明属于妇科疾病诊断和治疗技术领域，公开了M2型巨噬细胞在保护血管屏障中的应用，以及卵巢癌腹水的预防、抑制和治疗。本发明通过研究M2型巨噬细胞重建受损的血管屏障的分子机制，发现M2型巨噬细胞通过抑制内皮细胞中VCAM‑1的表达，从而降低活性氧(ROS)水平和VE‑cadherin的磷酸化，保护血管屏障。另构建了卵巢癌动物模型，结合临床样本发现卵巢癌中巨噬细胞通过VLA‑4/VCAM‑1途径调节血管屏障，影响恶性腹水的发展，从而确认了一个新途径，为卵巢癌腹水的治疗提供了新的策略。

Description

巨噬细胞在保护血管屏障中的应用以及卵巢癌腹水的预防、 抑制和治疗
技术领域
本发明涉及妇科疾病诊断和治疗应用技术领域，更具体的，涉及巨噬细胞在保护血管屏障中的应用，以及卵巢癌腹水的预防、抑制和治疗。
背景技术
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，卵巢恶性肿瘤中以上皮癌(EOC)最为多见，对女性生命造成严重威胁。
卵巢上皮癌占卵巢肿瘤的50～70％，由于缺乏早期诊断方法和早期症状，70％的患者在确诊为时处于晚期。恶性腹水是由癌症引起的腹腔积液，且上皮性卵巢癌比其他任何类型的肿瘤更易发生，主要是因为EOC可发生腹腔转移，44.1％的患者在诊断EOC时伴有腹水。
恶性腹水的积聚是血管通透性增加、淋巴回流受阻的综合结果，这个复杂的过程涉及许多周围环境的改变。过去认为血管通透性主要由内皮细胞间的相互作用介导，即通过激活血管内皮生长因子或凝血酶、缓激肽等炎症因子下游途径，使内皮细胞膜上的VE-cad磷酸化和内化，从而破坏细胞粘附，增加血管通透性。然而，目前恶性腹水的治疗效果普遍不理想，因此，深入了解血管通透性的调节机制，可以为卵巢癌腹水的治疗提供新的策略。
在EOC的肿瘤结节内和腹水中观察到大量的巨噬细胞浸润。有人认为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在肿瘤微环境中主要向M2亚型极化，这是TAMs促进肿瘤生长和血管生成的基础。针对TAMs的肿瘤治疗方案一定程度上可抑制肿瘤生长，但患者普遍出现颜面部水肿的副作用，提示巨噬细胞还有其他调节血管的功能有待发现。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明首先提供了M2型巨噬细胞在保护血管屏障中的应用。
本发明的第二个目的是在发现M2型巨噬细胞保护血管屏障的应用的基础上，考察M2型巨噬细胞对卵巢癌，特别是卵巢癌腹水生成的影响。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
M2型巨噬细胞在保护血管屏障中的应用；具体的，体现在增强血管内皮细胞完整性，或者降低血管内皮细胞的通透性方面。
M2型巨噬细胞在制备保护血管屏障的药物中的应用；具体的，体现在增强血管内皮细胞完整性，或者降低血管内皮细胞的通透性方面。
本发明首先将M2型巨噬细胞和内皮细胞共培养，结果发现M2型巨噬细胞可以降低内皮细胞的通透性，由此确定了M2型巨噬细胞能够保护血管屏障。
优选的，所述M2型巨噬细胞和血管内皮细胞直接接触。
之后，本发明研究了M2型巨噬细胞保护血管屏障的机制，结果表明：M2型巨噬细胞通过下调表达VLA-4，抑制内皮细胞中VCAM-1的表达，从而降低活性氧(ROS)水平和VE-cadherin的磷酸化，以达到保护血管屏障的目的。
优选的，M2型巨噬细胞与血管内皮细胞直接接触后，表达较低水平的VLA-4分子，并能够降低血管内皮细胞上VCAM-1的表达量，同时能够降低VE-cadherin的磷酸化程度。
优选的，VE-cadherin的磷酸化程度的降低依赖于血管内皮细胞中的活性氧的产生。
需要说明的是，本发明首先是从M2型巨噬细胞中发现了VLA-4分子的功能，发明人在后期实验中还在普通未极化的巨噬细胞上过表达了VLA-4分子，发现过表达了VLA-4分子的普通未极化的巨噬细胞同样也可以促进血管的通透性；因此通过抑制所有类型巨噬细胞中VLA-4分子的表达，均可保护血管屏障。
本发明还提供一种用于降低内皮细胞通透性的药物，所述药物包括VLA-4或VCAM-1的抗体，或者VLA-4或VCAM-1的拮抗剂/抑制剂。
本领域技术人员知道，卵巢癌腹水的存在与晚期卵巢浆液性癌(HGSOC)预后差有关，腹水的积聚是血管通透性增加、淋巴回流受阻的综合结果，这是一个复杂的过程，涉及到周围环境的功能改变，以前有研究证明血管周围巨噬细胞可以调节通透性，且不同极化亚型的巨噬细胞对血管通透性产生的影响显著不同。本发明首先研究了巨噬细胞介导的血管通透性的分子机制，发现M2型巨噬细胞能够增强血管的屏障作用，降低血管通透性。在这个发现的基础上，进一步找寻其与卵巢癌腹水的生成之间的联系，由此得出新的发现：在卵巢癌患者的腹水中，VLA-4和VCAM-1的表达水平与腹水量呈正相关；因此，本发明强调卵巢癌中恶性腹水的发展受M2型巨噬细胞的影响，M2型巨噬细胞通过VLA-4/VCAM-1途径调节血管屏障，从而减少卵巢癌腹水的积聚。
因此，本发明还提供M2型巨噬细胞的应用在制备治疗/预防/抑制卵巢癌腹水生成的药物中的应用。
另外，本发明实验研究发现VLA-4抗体治疗可以明显抑制卵巢癌小鼠腹水的形成，鉴于VLA-4和VCAM-1在巨噬细胞中的表达水平与患者腹水的形成有关，很有可能将VLA-4及VCAM-1的表达作为一个有价值的工具，为卵巢癌患者腹水的治疗提供新的策略。
因此，本发明还提供VLA-4和/或VCAM-1作为卵巢癌患者腹水形成量的生物标志物的应用。其中，VLA-4和/或VCAM-1的表达水平与卵巢癌患者的腹水形成量呈正相关。
本发明还提供一种用于治疗/预防/抑制卵巢癌腹水积聚的药物，所述药物能够增强所有类型巨噬细胞对血管屏障的保护作用。
优选的，所述药物包括VLA-4或VCAM-1的抗体，或者VLA-4或VCAM-1的拮抗剂/抑制剂。本发明通过实验研究发现：M2型巨噬细胞通过下调VLA-4抑制内皮细胞的VCAM-1表达从而降低血管通透性，且卵巢癌动物模型中，抑制VLA-4可有效减少腹水，保护血管通透性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过研究M2型巨噬细胞重建受损的血管屏障的分子机制，发现巨噬细胞通过抑制内皮细胞中VCAM-1的表达，从而降低活性氧(ROS)水平和VE-cadherin的磷酸化，保护血管屏障。另构建了卵巢癌模型，发现卵巢癌中巨噬细胞通过VLA-4/VCAM-1途径调节血管屏障对恶性腹水的影响，从而确认了一个新的途径，为卵巢癌腹水的治疗提供了新的策略。
附图说明
图1为实施例1的实验结果图；其中，图1A是不同亚型巨噬细胞培养环境下对内皮细胞通透性的影响；图1B为加入不同亚型巨噬细胞后内皮细胞上VE-cadherin的磷酸化荧光显色结果；图1C为不同亚型巨噬细胞培养环境下内皮细胞VCAM-1分子表达量的WB实验结果图；图1D为不同亚型巨噬细胞培养环境下内皮细胞VCAM-1分子表达量的荧光显色结果图；
图2为实施例1的实验结果图；其中，图2A和2B中shVCAM-1-control+M1代表M1型巨噬细胞与转染了VCAM-1对照序列的内皮细胞共培养；shVCAM-1-a+M1代表M1型巨噬细胞与转染了VCAM-1敲低a序列的内皮细胞共培养；shVCAM-1-b+M1代表M1型巨噬细胞与转染了VCAM-1敲低b序列的内皮细胞共培养；Ove-control+M2代表转染了VCAM-1对照质粒的内皮细胞与M2型巨噬细胞共培养；Ove-VCAM-1+M2代表转染了VCAM-1过表达质粒的内皮细胞与M2型巨噬细胞共培养；EC+M1+K-7174代表内皮细胞和M1型巨噬细胞共培养系统中加入了VCAM-1分子的抑制剂(K-7174)；
图3为实施例2的实验结果图；其中，图3C中shVLA-4-control+EC代表内皮细胞和转染了VLA-4对照序列的巨噬细胞共培养；shVLA-4-a+EC代表内皮细胞和转染了VLA-4敲低a序列的巨噬细胞共培养；shVLA-4-b+EC代表内皮细胞和转染了VLA-4敲低b序列的巨噬细胞共培养；图3D中Ove-control+EC代表内皮细胞和转染了VLA-4对照质粒的巨噬细胞共培养；Ove-VLA-4+EC代表内皮细胞和转染了VLA-4过表达质粒的巨噬细胞共培养；EC+M2+THi0019代表内皮细胞和M2型巨噬细胞共培养系统中加入了VLA-4分子的激动剂(THi0019)；
图4为实施例2的实验结果图；图4B中EC+M1+PS/2代表在内皮细胞与M1型巨噬细胞共培养系统中加入了VLA-4抗体PS/2；CDP323代表VLA-4的抑制剂；control代表CDP323的溶剂H2O；
图5为实施例3的实验结果图；图5A中counts代表细胞数；ROS代表活性氧；图5C，5D和5E中NAC代表ROS抑制剂N-乙酰-l-半胱氨酸；H2O2用来增加ROS的表达；
图6为实施例4的实验结果图；HM1是小鼠卵巢癌细胞系；图6C左图为未去除巨噬细胞的小鼠腹腔中巨噬细胞含量，图6C右图为去除巨噬细胞后的小鼠腹腔中巨噬细胞含量；
图7为实施例4的实验结果图；shVLA-4-control代表转染了VLA-4敲低对照序列的巨噬细胞；shVLA-4-a代表转染了VLA-4敲低a序列的巨噬细胞；shVLA-4-b代表转染了VLA-4敲低b序列的巨噬细胞；Ove-control代表转染了VLA-4过表达对照质粒的巨噬细胞；Ove-VLA-4代表转染了VLA-4过表达质粒巨噬细胞；PS/2代表用PS/2处理半小时后的巨噬细胞处理组；
图8为实施例5的实验结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将通过具体实施例和附图作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 M2型巨噬细胞通过抑制VCAM-1降低内皮细胞的渗透性
一、四甲基异硫氰酸罗丹明葡聚糖(TRITC-dextran，mw＝70kDa)渗透分析实验过程
考察TRITC标记葡聚糖(70kDa)在内皮细胞和巨噬细胞共培养中的转运，以确定内皮细胞通透性。将105个人脐静脉内皮细胞铺于transwell上室，24小时后将不同亚型的巨噬细胞加入上室再共培养24小时。将2mg/mL TRITC-葡聚糖在上室中孵育3小时后，在530nm的激发波长和540nm的发射波长分别测量了TRITC-葡聚糖荧光强度。
二、免疫荧光染色实验过程
为了对培养细胞进行免疫荧光分析，固定在盖玻片上生长的细胞后破膜，并与VLA-4、CD68抗体和CD31、VCAM-1抗体一起孵育，二抗分别为Alexa-Fluor 488-结合抗鼠IgG，Alexa-Fluor 550-结合抗鼠IgG，Alexa-Fluor 627-结合抗兔IgG。DAPI复染细胞核。用共聚焦显微镜检测阳性信号。
本实施例直接将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和不同亚型的巨噬细胞混合，使得内皮细胞和巨噬细胞直接接触，考察不同亚型的巨噬细胞对内皮细胞屏障特性的影响，结果如图1。
从图1A中可以看出，内皮细胞与M2型巨噬细胞直接接触可以降低内皮细胞的通透性，而M1型巨噬细胞则可以增加内皮细胞的通透性。从图1B中可以看出，内皮细胞与M2型巨噬细胞直接接触后可以显著降低VE-cadherin的磷酸化。图1C和图1D研究了调节免疫细胞和内皮细胞之间相互作用的黏附分子VCAM-1表达量的变化。从图1C和图1D可以看出，内皮细胞与M1型巨噬细胞混合后，内皮细胞表面的VCAM-1分子表达量提高，但是，内皮细胞和M2型巨噬细胞直接接触后，内皮细胞表面的VCAM-1分子表达量显著降低；说明VCAM-1分子在巨噬细胞和内皮细胞的相互作用中具有重要意义。
三、VCAM-1在巨噬细胞调节内皮细胞屏障的作用
将巨噬细胞接种在VCAM-1过表达和敲低的内皮细胞上，结果表明：VCAM-1过表达组的内皮细胞VE-cadherin的磷酸化显著上调，反之依然(图2A和图2B所示)。
将M1型巨噬细胞和内皮细胞以及VCAM-1抑制剂K-7174共混合后，观察内皮细胞的VE-cadherin的磷酸化程度，结果如图2C。从图2C可以看出，在内皮细胞和M1巨噬细胞的混合体系中加入VCAM-1抑制剂后，内皮细胞的VE-cadherin的磷酸化程度明显降低，说明巨噬细胞通过调节内皮细胞VCAM-1表达和VE-cadherin磷酸化调节内皮细胞的屏障。
实施例2 VLA-4在与M2型巨噬细胞与内皮细胞共培养系统中下调
将不同亚型的巨噬细胞和内皮细胞共培养，考察VCAM-1的配体VLA-4的表达，结果如图3。从图3A中可以看出，在共培养系统中M2型巨噬细胞的VLA-4表达下调，这与共培养系统中VCAM-1的表达下调表现一致。从图3B的免疫荧光显示在共培养系统中M2型巨噬细胞VLA-4表达减弱。
本实施例还通过质粒转染建立了VLA-4在巨噬细胞中的过表达和敲低模型。将VLA-4敲低的巨噬细胞和经VLA-4抑制剂(CDP323)预处理的巨噬细胞(图3C)加入内皮细胞后，观察到VE-cadherin磷酸化降低，在过表达组和THI0019(VLA-4激动剂)组中检测到VE-cadherin磷酸化增加(图3D)。此外，免疫荧光结果显示，和对照组相比VLA-4过表达的巨噬细胞可以使内皮细胞VE-cadherin的磷酸化显著上调(图4A所示)。在共培养中加入VLA-4抑制剂(CDP323)和VLA-4抗体(PS/2)后，M1型巨噬细胞诱导的内皮通透性的影响大大减弱(图4B)。这些观察表明巨噬细胞通过VLA-4激活内皮细胞的VCAM-1，增强了其通透性。
实施例3内皮细胞与M2型巨噬细胞共培养时ROS生成量减少
为了验证ROS是否作为VCAM-1下游分子参与巨噬细胞对内皮细胞通透性调节的作用，本实施例检测了ROS在不同共培养体系中的表达，证明ROS是一种通透性诱导因子。
使用二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测定法测定活性氧水平。细胞用PBS重新悬浮，在37℃用10μM DCFH-DA避光染色20分钟。用PBS洗涤3次后，在细胞中加入PBS缓冲液。使用流式仪记录指示时间的相对荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为525nm。结果如图5和图6所示，从图5A左图中可以看出，内皮细胞与M2型巨噬细胞共培养后产生的活性氧较M1共培养减少。加入VEGF增加内皮细胞的通透性后，M1、M2型巨噬细胞诱导内皮细胞产生的活性氧差异更明显(图5A右图所示)。使用VLA-4或VCAM-1抑制剂显著降低内皮细胞ROS的产生(图5B)。
为证实巨噬细胞对VE-cadherin磷酸化的调节是否依赖于ROS，在共培养体系中加入ROS激活剂过氧化氢或抑制剂N-乙酰-l-半胱氨酸(简称NAC)。结果表明：在共培养体系中加入过氧化氢增加ROS表达后，VE-cadherin磷酸化增强；反之，在NAC处理后，免疫荧光和Western blot显示磷酸化的VE-cadherin表达减弱(如图5C，5D)。然后本实施例还研究ROS是否能影响巨噬细胞调节的内皮细胞通透性，为了解决这个问题，用TRITC葡聚糖检测内皮细胞通透性。正如预期的那样，加入过氧化氢后TRITC葡聚糖在共培养体系中的渗透增强(图5E)。由上述实验和相关数据表明：巨噬细胞对VE-cadherin磷酸化的调节依赖于ROS。
实施例4抑制VLA-4/VCAM-1通路降低卵巢癌小鼠腹水量
为了进一步研究VLA-4在体内的功能，本实施例将106个HM1卵巢癌小鼠细胞注射入小鼠腹腔从而建立了卵巢癌小鼠模型(模型构建方法如图6A)。在腹水较少的卵巢癌小鼠中发现M2型巨噬细胞所占比例较大，巨噬细胞中VLA-4的表达较低(图6B)。然后，在第1天和第3天通过腹腔注射清除巨噬细胞脂质体(100μL)给小鼠。PBS脂质体作为阴性对照(control)。通过流式细胞术证实Bal/bc小鼠腹腔中巨噬细胞清除彻底(图6C)。为了在体内确定VLA-4在调控血管通透性中的作用，我们将VLA-4过表达细胞、VLA-4敲低细胞和对照细胞分别注射到巨噬细胞清除的动物体内。VLA-4基因敲低组的血管通透性较对照组明显降低；反之，VLA-4过表达组显示血管通透性显著升高(图7A)。在VLA-4抗体(PS/2)处理的小鼠中血管通透性较对照组降低(图7B)。上述结果表明，VLA-4的表达与腹膜血管通透性呈正相关，说明VLA-4具有治疗潜力。为进一步探讨VLA-4对卵巢癌小鼠的治疗作用，在接种卵巢癌的小鼠腹腔注射PS/2(3mg/kg)。与同型对照小鼠比较，PS/2降低卵巢癌小鼠腹水量(图7C，7D)。这些结果表明，在卵巢癌动物模型中，抑制VLA-4可有效减少腹水，保护血管通透性。
实施例5 VLA-4/VCAM-1表达与卵巢癌患者生存率和腹水量相关
取中山大学附属第五医院病理科5μm切片石蜡包埋的人卵巢癌组织标本进行免疫组化。随后用VCAM-1抗体进行孵育。用兔抗人VLA-4和兔抗人CD68抗体进行冰冻切片免疫荧光分析，二抗分别为Alexa-Fluor 488-结合抗鼠IgG，Alexa-Fluor 550-结合抗鼠IgG和Alexa-Fluor 627-结合抗兔IgG。用共聚焦显微镜检测阳性细胞。
本实施例首先分析了肿瘤数据库中的卵巢癌样本中VLA-4的表达水平与患者生存率的相关性。与高VLA-4表达组相比，低VLA-4表达组患者的生存时间明显延长(图8A)。免疫组化和免疫荧光法检测卵巢癌组织中VCAM-1和VLA-4的表达水平较正常组织明显升高(图8B，8C)。通过对VLA-4表达与腹水量的详细比较，发现VLA-4在卵巢癌组织中的表达水平与患者腹水量相关(图8D)。我们通过流式细胞术得出了同样的结论(图8E)。我们随后研究了腹水中巨噬细胞的功能。从大量腹水患者中分离出的巨噬细胞与少量腹水中的相比，在共培养中可诱导内皮细胞更高的通透性(图8F)。因此，这些数据提示巨噬细胞中VLA-4和内皮细胞VCAM-1的表达也有很大的潜力预测卵巢癌的血管通透性。

Claims (1)

1.VLA-4的抗体，或者VLA-4的拮抗剂/抑制剂在制备用于降低卵巢癌血管内皮细胞通透性的药物中的应用。
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