CN111148433B - Willaertia属原生动物作为抑真菌剂和/或杀菌剂的用途 - Google Patents

Willaertia属原生动物作为抑真菌剂和/或杀菌剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及原生动物例如Willaertia magna变形虫种的原生动物作为抑真菌剂和/或杀真菌剂的治疗或非治疗用途。

Description

Willaertia属原生动物作为抑真菌剂和/或杀菌剂的用途
技术领域
本发明涉及Willaertia属，特别是Willaertia magna原生动物作为抑真菌剂和/或杀真菌剂的用途。
背景技术
真菌(酵母和霉菌)是造成感染植物、动物和人的多种疾病的原因。
因此，已经开发出用于消除真菌或限制其发育的许多杀真菌剂，从而治疗和/或预防由真菌引起的疾病。
另一方面，从功效或对人类或环境的毒性方面来看，使用这些化合物通常不是最优化的。
实际上，杀虫剂或化学抗真菌剂的农业或非农业大量使用引起了众多健康和生态问题。在环境方面，已经观察到土壤和地下水位与植物检疫产品中所含分子的交叉污染。由于这些污染物对非靶向生物的潜在毒理作用，其可能导致受污染生态系统的破坏。除了生态风险外，与使用杀虫剂和暴露于杀虫剂有关的危险也得到了充分证明，并已受到世界卫生组织(WHO)的警告。关于真菌病的治疗，需要提供对人无毒的抗真菌化合物。此外，这些化合物的大量使用导致出现了对这些产品具有耐药性的菌株。种群的进化最终导致产品功效的下降，这可能导致功效的完全丧失。
因此，多年来，人们对由大量使用化学杀虫剂引起的生态和健康风险的认知的提高促进了对天然来源的抗真菌产品的需求的发展，这种产品的毒理学影响和环境影响较低。这些对人及其环境危害较小的产品还具有简化使用的优势，因为它们受益于监管减少。
因此，迫切需要开发既有效又易于使用并且生产成本可控的新型广谱天然杀真菌剂组合物。
还有利的是，这类组合物能够作用于孢子，以具有最佳功效。
发明简述
在这种情况下，发明人完全出乎意料地证实，Willaertia属原生动物，特别是活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的Willaertia magna变形虫种的原生动物具有抑真菌和/或杀真菌活性，特别是通过作用于孢子。
本公开的第一方面是活或死形式和/或细胞裂解物形式的 Willaertia属(例如Willaertia magna种)的原生动物作为抑真菌剂和 /或杀真菌剂的非治疗用途。
本公开的第二方面是活或死形式和/或细胞裂解物形式的 Willaertia属(例如Willaertia magna种)的原生动物作为抗真菌药物的用途。
本公开的第三方面是包含有效量的活或死形式和/或细胞裂解物形式的Willaertia magna种的原生动物的植物药物产品。
第四方面是包含有效量的活或死形式和/或细胞裂解物形式的 Willaertiamagna种的原生动物的药物产品。
根据本公开，可以预防性或治愈性地使用活或死形式和/或细胞裂解物形式的Willaertia属(特别是Willaertia magna种)的原生动物。
活或死形式和/或细胞裂解物形式的Willaertia magna种的原生动物可以单独使用，或有利地与其他原生动物，特别是Solumitris变形虫属的原生动物、单鞭毛虫(Cercomonas)属的丝足虫原生动物或 Paracercomonas属的丝足虫原生动物联合使用。
有利地，用于本公开上下文中的原生动物对应于2006年8月21 日以编号PTA 7824保藏于ATCC的Willaertia magna菌株，或对应于2006年8月21日以编号PTA 7825保藏于ATCC的Willaertia magna 菌株，这两种菌株最初以名称CENTRE NATIONAL DE LARECHERCHE SCIENTIFIQUE(CNRS)[French National Center for Scientific Research]–3rue Michel Ange–75794PARIS CEDEX 16/ France and UNIVERSITE LYON 1CLAUDEBERNARD–43 Boulevard du 11Novembre 1918–69622VILLEURBANNE Cedex/ France保藏。所述保藏菌株也描述于PCT国际申请WO2008/043969 的公开文本中。
如在本公开上下文中所用，术语“一种植物”和“多种植物”等同地表示整株植物和从这些植物分离的部分，诸如叶、果实、花、颗粒、种子、树干、根、茎。
如在本公开上下文中所用，术语“真菌”是指单细胞或多细胞真菌，包括孢子形式或菌丝体形式的酵母和霉菌。
如在本公开上下文中所用，术语“植物药物产品”表示意欲用于以下目的的物质的制剂或混合物：
-保护植物免受一种或多种害虫生物的侵害，
-和/或预防植物害虫生物的作用，
-和/或对植物的生命过程施加作用(因为它们不是营养物质)，
-和/或确保保存植物产品。
如在本公开上下文中所用，术语“活形式”表示原生动物的代谢活性营养形式。
如在本公开上下文中所用，术语“死形式”表示原生动物的代谢失活形式，其已通过机械、物理、热或化学过程，例如渗透压、热激、超声，或在离心类型的机械应力下失活。“死形式”可以包含微生物的完整死细胞，或细胞裂解物，或完整死细胞和细胞裂解物的混合物。裂解物通常是指由于细胞裂解类型的现象而破坏或溶解生物细胞，从而引起天然存在于所提及的微生物细胞中的细胞内生物成分的释放而获得的物质。为了本发明的目的，术语“死形式”无区别地用于表示Willaertia的死细胞，通过Willaertia的裂解获得的所有裂解物或仅其一部分。
特别地，活细胞、死细胞和裂解物之间的区别可以通过显微镜观察和使用标记死细胞的无活力标记(诸如台盼蓝(CAS：72-57-1)) 染色来进行。
特别地，非治疗用途具有多种应用：
-用于对抗植物的寄生真菌的增殖，优选用于治疗藤本植物、谷物、马铃薯、果树和市场花园作物的真菌病，甚至更优选用于治疗选自以下的真菌病：葡萄白粉病、葡萄霜霉病、谷物败血症和镰刀菌病、谷物网斑病、马铃薯霜霉病和早疫病、苹果树痂、油菜和蔬菜作物的菌核病及它们的组合；
–用于消毒空气处理设施的网络(冷却塔除外)；
-用于在食品、食品转化/生产设备、食品转化/生产工厂、与食品接触的表面中对抗真菌污染和/或形成真菌生物膜；
-用于在化妆品、化妆品转化/生产设备、化妆品转化/生产工厂、与化妆品接触的表面中对抗真菌污染和/或形成真菌生物膜。
特别地，用作抗霉菌药物可用于治疗由选自以下的真菌引起的感染：曲霉属(Aspergillus)、念珠菌属(Candida)、葡萄孢菌(U.botrytis)、黑曲霉(A.niger)、多变拟青霉(P.variotii)、链格孢菌(A.alternata) 及它们的组合，优选念珠菌属，甚至更优选白色念珠菌(Candida albicans)。
本发明也可用于治疗由真菌引起的医院内疾病，特别是呼吸道疾病。
优选地，将以活或死形式(特别是细胞裂解物形式)或作为活和死形式的混合物的Willaertia属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗选自子囊菌门的真菌，更优选地选自以下纲的真菌：粪壳菌纲(sordariomycetes)、散囊菌纲(eurotiomycetes)、座囊菌纲 (dothideomycetes)、酵母菌纲(saccharomycetes)、锤舌菌纲 (leotiomycetes)、卵菌纲(oomycetes)以及它们的组合，甚至更优选地选自葡萄孢属(Botrytis)、白粉菌属(Erysiphe)、镰刀菌属 (Fusarium)、青霉属(Penicillium)、轴霜霉属(Plasmopara)、疫霉属(Phytophthora)、毛壳菌属(Chaetomium)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、交链孢属(Alternaria)、念珠菌属(Candida)、细基格孢属(Ulocladium)、附球菌属(Epicoccum) 和枝孢属(Cladosporium genera)及它们的组合，并且更优选地选自灰霉菌(B.cinerea)、葡萄白粉菌(E.necator)、茄镰胞菌(F.solani)、球毛壳菌(C.globosum)、产黄青霉(P.chrysogenum)、扩展青霉 (P.expansum)、葡萄霜霉病菌(P.viticola)、致病疫霉(P.infestans)、绿色木霉(T.viride)、哈茨木霉(T.harzianum)、烟曲霉菌 (A.fumigatus)、链格孢菌(A.alternata)、黄曲霉(A.flavus)、多变拟青霉(P.variotii)、黑曲霉(A.niger)、白色念珠菌(C.albicans)、葡萄孢菌(U.botrytis)、黑附球菌(E.nigrum)、灰霉菌(B.cinerea)、灰葡萄孢(P.roqueforti)、芽枝状枝孢霉(C.cladosporioides)、谢瓦散囊菌(E.chevalieri)、出芽短梗霉(A.pullulans)及它们的组合。
在一个具体实施方案中，Willaertia magna种的原生动物以活形式或以死形式(特别是以细胞裂解物形式)，或以活和死形式的混合物使用。在一个具体实施方案中，所用的混合物包含50％或更多的死形式，特别是细胞裂解物形式的原生动物，例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多的死形式(相对于失活前总的原生动物数量)，特别是细胞裂解物形式的原生动物。
在一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia magna种的原生动物用于对抗感染植物的真菌病。优选地，该植物选自草、双子叶植物、一年生，两年生和多年生植物、蔬菜植物或收获的蔬菜、果类植物或树木或收获的水果、谷物、产油植物、产蛋白质的植物、木质植物，并且特别选自衍生自以下的植物或产品：马铃薯、甜菜根、甘蔗、烟草、藤本植物、小麦、油菜、大麦、大米、玉米、高粱、小米、大豆、豆类、番茄、黄瓜、生菜、草莓、苹果树、梨树、柑橘类水果、香蕉、菠萝、桃、杏树、樱桃树、核桃树和榛子树。
在一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia magna种的原生动物用于对抗感染表面、材料、设备零件和/或通风系统的真菌。
在一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia magna种的原生动物用于对抗感染人或动物健康的真菌。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia 属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗茄镰胞菌以治疗植物(谷物和玉米)真菌病。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia 属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗球毛壳菌以治疗植物(优选感染谷物或大米)的真菌病，或用于处理纤维素基产品 (诸如纸张和建筑材料)的污染。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia magna种的原生动物用于对抗葡萄霜霉病菌以治疗植物真菌病，优选感染藤本植物的真菌病。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia magna种的原生动物用于对抗致病疫霉以治疗植物真菌病，优选感染马铃薯的真菌病。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia 属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗青霉属(诸如产黄青霉)、曲霉属(诸如黑曲霉)或枝孢属(诸如芽枝状枝孢霉) 的霉菌，以处理内部环境(诸如墙壁、材料、设备零件和通风系统等) 的污染。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia 属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗绿色木霉和/或哈茨木霉，以处理食品或内部环境(诸如墙壁、材料、设备零件和通风系统等)的污染。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia 属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗烟曲霉菌以治疗医院内疾病，特别是呼吸道疾病。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia 属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗链格孢菌以治疗植物的真菌病，优选马铃薯早疫病，或用于治疗人的皮肤病变、真菌病和上呼吸道感染。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia 属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗多变拟青霉以在食品(优选谷物)中处理真菌污染和/或形成真菌生物膜，或用于治疗人的真菌病、肺炎、鼻窦炎。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia 属(特别是Willaertia magna种)的原生动物用于对抗黑曲霉以在食品、内部环境(例如墙壁、材料、设备零件和通风系统等)中处理真菌污染和/或形成真菌生物膜，或用于治疗人的内耳真菌病或肺曲霉病。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式的Willaertia属(特别是Willaertiamagna种)的原生动物用于对抗白色念珠菌以治疗人的真菌病。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式的Willaertia属(特别是Willaertiamagna种)的原生动物用于对抗葡萄孢菌以治疗植物的真菌病，在食品中处理真菌污染和/或形成真菌生物膜以及用于治疗癣菌病。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式的Willaertia属(特别是Willaertiamagna种)的原生动物用于对抗黑附球菌或出芽短梗霉以在食品或化妆品中处理真菌污染和/或形成真菌生物膜或处理内部环境(诸如墙壁、材料、设备零件和通风系统等)的污染。
在另一个具体实施方案中，活形式或死形式的Willaertia属(特别是Willaertiamagna种)的原生动物用于对抗黄曲霉、灰葡萄孢、灰霉菌、芽枝状枝孢霉或谢瓦散囊菌以在食品或化妆品中处理真菌污染和/或形成真菌生物膜。
本公开还涉及植物药物组合物，其包含有效量的活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia magna种的原生动物。
在一个具体实施方案中，该植物药物组合物包含有效量的细胞裂解物形式的Willaertia magna种的原生动物。
在一个具体实施方案中，该植物药物组合物还包含一种或多种配制剂，特别是水，以及在合适的情况下，一种或多种另外的活性佐剂。
在一个具体实施方案中，该植物药物组合物是具有固体干燥制剂 (优选为脱水或冻干形式)的组合物。干燥形式的植物药物组合物意欲在使用前被重构溶剂重构以备用。重构溶剂优选是水。
在另一个具体实施方案中，该植物药物组合物是具有浓缩液体制剂的组合物。浓缩液体形式的植物药物组合物意欲在使用前被稀释溶剂稀释以备用。稀释溶剂优选是水。
在另一个具体实施方案中，该植物药物组合物是具有直接备用的液体制剂的组合物。
以其最终的即用形式，上述植物药物组合物可以以各种方式并根据各种处理程序施用于植物。特别地，可以在收获之前或之后在叶、土壤、花、树枝、茎、树干、根和/或果实上施用该植物药物组合物。该植物药物组合物优选通过喷雾施用。该植物药物组合物还可以以与其他植物药物产品、肥料、浇水等的混合物形式施用。
对于非治疗用途，可以将活形式或死形式的Willaertia magna种的原生动物直接与转化/生产设备的零件以及与食品或化妆品接触的表面或待处理植物直接接触。例如，可以通过例如以气雾剂水溶液形式的喷雾进行处理。因此，这种原生动物也可以与其他消毒剂和/或杀虫剂联合使用。
本公开内容还涉及药物组合物，其包含作为抗真菌药的有效量的活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia magna种的原生动物以及药学上可接受的载体。特别地，所述药物组合物可以是包含活性物质的敷料、膏状物、膏药、凝胶、糊剂、洗剂、泡沫、油、乳剂、水溶液、水悬浮液、霜剂、软膏、粉末或待施用于在皮肤或粘膜上的喷雾剂。
为了用作抗真菌药物，活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的特别是Willaertia magna种的原生动物可以局部施用于皮肤或粘膜的病灶上(例如以霜剂、软膏、喷雾剂或粉末的形式施用于皮肤或粘膜，典型地施用于阴道或肛门粘膜)。
本公开还涉及包含作为抗真菌药的有效量的原生动物和药学上可接受的载体的药物组合物。特别地，所述药物组合物可以是包含活性物质的敷料、膏状物、膏药、凝胶、糊剂、洗剂、泡沫、油、乳剂、水溶液、水悬浮液、霜剂、软膏、粉末或待施用于皮肤或粘膜的喷雾剂。
本公开的另一个主题是用于对抗真菌增殖的方法，除了应用于人体或动物体的治疗方法之外，其包括以下步骤：使活形式或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物的Willaertia magna种的原生动物与所述真菌接触。
附图说明
图1：变形虫对灰霉菌萌发的影响。在不存在变形虫且存在灰霉菌孢子的情况下，在微孔板中进行测试。孵育24小时后观察。敏感菌株：B05.10和M421。耐药菌株：M426。(抑制呼吸的杀菌剂)
图2：变形虫对灰霉菌萌发的影响。在MC培养基中的灰霉菌孢子+500个变形虫和灰霉菌孢子+存在下，在微孔板中进行测试。敏感菌株：B05.10和M421。耐药菌株：M426。(抑制呼吸的杀菌剂)。在MC培养基中有50000个变形虫。孵育24小时后观察。
图3：培养基(MC)对灰霉菌敏感菌株萌发的影响。在灰霉菌孢子+培养基(MC)存在下，在微孔板中进行测试。敏感菌株：B05.10 和M421。孵育24小时后观察。
具体实施方式
下文中的实施例使得可以阐明本发明，但本质上不是限制性的。
实施例1：对19个菌株的真菌-Willaertia相互作用的真菌DNA的qPCR分析。
通过将孢子与“Willaertia magna”变形虫参考ATCC PTA-7824 接触，根据24孔板中的变形虫/孢子之比＝10个变形虫/孢子，对19 个真菌菌株(表1)进行了相互作用测试。
在第一个板中，将每个菌株的单独孢子在相同条件下(在2ml MEAc中)孵育。接触3H后，将溶液以14000rpm离心5分钟。然后，去除上清液，将沉淀物吸收到200μl中进行DNA提取。
为了在第二个板中在24H时进行测试，在24小时后将上清液直接从孔中移出，并将“孢子-变形虫混合物”吸收到200μl中以提取 DNA。每个步骤通过显微镜观察进行监测。在用细砂研磨步骤之后，根据制造商的说明，使用“NucleoSpin plant II-Macherey-Nagel”试剂盒对样品(200μl)进行DNA提取。
单独真菌和Willaertia-真菌复合物的DNA的qPCR扩增在 CFX96-Biorad仪器上进行。以最终体积20μl进行定量，其中包含5μl DNA、引物(300nM)和10μl SybrGreen-Mix。使用以下程序：在 95℃下变性10分钟的步骤，以及在“95℃下15秒+60℃下1分钟”的35个循环的扩增步骤。
根据之前步骤中验证的方案，对19个真菌菌株进行测试。在启动分子分析之前，在显微镜下观察板。结果是每种条件(孢子3H、孢子24H、孢子-变形虫3H和孢子-变形虫24H)重复三次获得的qPCR 曲线。假设qPCR分析使用通用引物，则使用一系列的产黄青霉真菌来大致估计每个测试扩增的DNA量。这些数据使得可以评估在不存在变形虫的对照中从孢子阶段到菌丝体的传代，以及在变形虫存在下对萌发的抑制程度。
结果和结论：表1：对单独孢子进行的测试(3和24小时的差异) 与接触24小时后与变形虫发生相互作用的孢子之间的qPCR扩增差异。ΔCq(3H-24H)：3H和24H时，孢子之间的循环数之差。ΔCq (T24H-Willaertia24H)：孵育24小时后，单独孢子(T24H)和存在变形虫的孢子(变形虫24H)之间的循环数差异。
Figure BDA0002414537650000111
Figure BDA0002414537650000121
*：ΔCq(T24H-Willaertia24H)的值为负，因为对应于“真菌-变形虫24H”测试(低真菌生物量)的Cq值大于24H的对照测试的Cq值(高生物量)。
qPCR分析使得可以定量真菌生物量并区分真菌的发育阶段以及显示对具有明显差异的19个经处理的菌株的抑菌和/或杀菌作用。在存在和不存在变形虫的两种测试之间，Cq循环数的差异非常显著，在某些情况下超过10个循环。这些结果反映出在抑制孢子萌发后孵育24小时后，在变形虫存在下存在极低的真菌生物量。通过测试菌株的3H和24H孢子之间的扩增差异，可以清楚地观察到3H的孢子阶段与24H之后形成的菌丝体之间的差异。
qPCR结果完美地反映了在显微镜下进行的用于开发此方案的视觉观察结果。
实施例2：研究Willaertia magna对灰霉菌生长的影响。
原理：所进行的测试是基于实验室中用于评估常规杀真菌分子功效的测试。通过使各种浓度的变形虫与真菌的孢子接触，分析了 Willaertia magna变形虫(ATCC PTA-7824菌株)对灰霉菌孢子萌发的影响。孵育24小时后，将在变形虫存在下的灰霉菌孢子的萌发与不存在变形虫的对照进行比较。
方案：将灰霉菌菌株在21℃的交替日光-紫外光(12H/12H)下保持在培养基(基于燕麦片)上。菌株具有对属于细胞呼吸抑制剂的杀真菌剂敏感或耐药的表型。所测试菌株的参考是：菌株B05.10(敏感的)、M421(从田间分离的敏感的)和M426(从田间分离的耐药的)。
为了测试Willaertia magna变形虫对灰霉菌分生孢子萌发的影响，将真菌孢子与各种浓度的变形虫一起孵育。在96孔板中，最终体积50μl中，每孔将500个灰霉菌孢子与5×102和5×104个变形虫接触。在培养基(MC)中制备测试的变形虫。
还在相同条件下制备以下对照：
-在YBA液体培养基中的灰霉菌孢子
-培养基(MC)中的灰霉菌孢子
-与抑制呼吸的杀真菌剂一起的灰霉菌孢子。
每个条件均重复三次测试。将板在黑暗中于21℃孵育24H或 48H。在倒置显微镜下观察灰霉菌分生孢子的萌发，并针对每种情况拍摄一系列照片。
结果和结论：24小时后观察孢子可以证实在高浓度变形虫下真菌的萌发减慢。不管灰霉菌菌株如何，当真菌与形成融合层的一定数量的变形虫接触时，这种效果就更加明显(图2)。当比例较低(500 个变形虫)时，与对照相比，效果不明显(图1和图2)。B05.10菌株是一种收集菌株，且其活力/活度较低。与野生型菌株(从田间采集) 相比，其需要更多的时间来开发。单独的培养基(MC)不影响真菌的生长，甚至培养基似乎会刺激灰霉菌孢子萌发(图3)。
这些结果表明，在实验条件下，Willaertia magna对灰霉菌的萌发具有功效，其中观察到定性的剂量效应。
实施例3：Willaertiamagna对藤本植物(葡萄霜霉病菌)霜霉病的功效：
原理：在年轻的赤霞珠植物上进行测试。在对照条件下用泵喷雾器处理每组植物。用测试溶液处理植物后，有意用葡萄霜霉病感染植物。孵育7至10天后，评估疾病的严重性，以评估相对于未处理植物上的疾病严重性，各种产品的功效。
方案：
赤霞珠植物的插条在温室(温度为15℃-30℃)中生产，六种植物组成六组，用于研究每种测试条件。
将Willaertia magna细胞在培养基中培养，直到获得每升9×109个细胞的所需浓度。
测试了各种样品：
1.阴性对照，条件1：未经处理。
2.培养基的对照，条件2：稀释介质。
3.杀真菌剂，条件3：培养基中的Willaertia magna。
4.杀真菌剂，条件4：条件3的样品，在稀释介质中稀释。
5.杀真菌剂，条件5：将条件3的样品置于机械应力下以杀死 Willaertia细胞。将样品在一定压力下通过泵通过实际上关闭的强真空阀，导致一些细胞死亡和一些死细胞裂解。在显微镜下观察获得的样品，其带有无活力标记(台盼蓝)，以计数剩余的活细胞(未用台盼蓝标记)。
6.杀真菌剂，条件6：将条件4的样品置于机械应力下以杀死Willaertia细胞。将样品在一定压力下通过泵通过实际上关闭的强真空阀，导致一些细胞死亡和一些死细胞裂解。在显微镜下观察获得的样品，其带有无活力标记(台盼蓝)，以计数剩余的活细胞(未用台盼蓝标记)。
7.阳性对照，条件6：相当于3kg/ha的波尔多混合物。
通过喷雾，在整株植物上，将每个样品施用于六组植物之一。
24小时后，将葡萄霜霉病菌孢子囊的悬浮液喷雾在叶的下表面。然后，将植物在24±5℃的环境中孵育，在有利于疾病发展的湿度下的单个腔室中每天照射14小时。7至10天后，针对每种植物和每个叶阶段，在每种条件下进行杀菌剂功效的评估。该评估基于真菌病变的目测观察，其由两个部分组成：感染的表面积和孢子形成的强度。标度为0-100％(以5％为增量)；单独观察每片叶。根据下式计算功效：功效＝100×[(NT-T)/NT](NT是未处理植物的平均侵袭度，T是处理植物的平均侵袭度)。结果列于表2。
表2：测试条件和功效结果
Figure BDA0002414537650000151
结果和结论：在未经处理的植物上，疾病的严重程度很高 (56.3％)。喷雾稀释介质后，该值还很高(55％)。
用活形式的Willaertia magna处理的植物上观察到极少量的疾病：葡萄霜霉病菌的感染是叶表面积的2.5％-1.3％(相比之下，未经处理的阴性对照为56％)。也就是说，其功效超过95％，接近于参考杀真菌剂(3kg/ha的波尔多混合物)的功效，从而能够以100％的功效完全控制葡萄霜霉病(无霜霉病侵袭)。
在用通过泵和强真空阀通过机械作用失活的死形式的Willaertia magna处理的植物上观察到少量疾病：葡萄霜霉病菌的感染是叶表面的30％-仅1.3％(未经处理的阴性对照为56％)。
总之，在实验条件下，活形式和死形式的Willaertia magna都具有很高的抗葡萄霜霉病的活性。

Claims (6)

1.Willaertia magna种的原生动物作为抑真菌剂和/或杀真菌剂的非治疗用途，用于对抗选自以下的真菌：灰霉菌(B.cinerea)、茄镰胞菌(F.solani)、球毛壳菌(C.globosum)、产黄青霉(P.chrysogenum)、葡萄霜霉病菌(P.viticola)、绿色木霉(T.viride)、哈茨木霉(T.harzianum)、烟曲霉菌(A.fumigatus)、链格孢菌(A.alternata)、黄曲霉(A.flavus)、多变拟青霉(P.variotii)、黑曲霉(A.niger)、白色念珠菌(C.albicans)、葡萄孢菌(U.botrytis)、黑附球菌(E.nigrum)、叶牙枝孢霉(C.herbarum)、灰葡萄孢(P.roqueforti)、芽枝状枝孢霉(C.cladosporioides)、谢瓦散囊菌(E.chevalieri)、出芽短梗霉(A.pullulans)及它们的组合，其特征在于，这些原生动物对应于以编号PTA-7824保藏于ATCC的菌株。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，Willaertia magna菌株的原生动物以活或死形式或细胞裂解物形式或作为活形式和/或死形式和/或细胞裂解物形式的混合物使用。
3.根据权利要求1或2所述的用途，用于对抗植物寄生真菌的增殖。
4.根据权利要求3所述的用途，用于治疗藤本植物的真菌病。
5.根据权利要求3所述的用途，用于治疗真菌葡萄霜霉病。
6.根据权利要求1或2所述的用途，
(i)用于消毒空气处理设施的网络，
(ii)用于在食品、食品转化/生产设备、食品转化/生产工厂、化妆品、与食品或化妆品接触的表面中对抗真菌污染和/或形成真菌生物膜，或
(iii)用于处理内部环境的污染。
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