CN111122815B - 一种评价道路雨水毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种评价道路雨水毒性的方法。该方法包括收集待测路面的原位模拟雨水，得到道路沉积物样品；过滤所述道路沉积物样品，取不同体积的过滤后的道路沉积物样品进行冻干，稀释至相同体积，得到一系列不同浓度的工作液；将所述工作液加入生物细胞中培养进行毒性试验检测细胞毒性，得到等效面积ETAi与活生物细胞存活率的曲线；比较不同道路的ETA50，即半数生物细胞存活率对应的等效面积，以表征不同道路的水体毒性的大小。该方法利用等效面积可以直观、简便的表征水体的总体毒性，且该方法以采样点的等效面积来表征毒性，等效面积越小，毒性越大。

Description

一种评价道路雨水毒性的方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种评价道路雨水毒性的方法。
背景技术
城市道路雨水被视为缓解城市水资源短缺的替代水资源，因此，越来越受到关注。由于频繁的交通等人类针对不同土地用途的活动，道路表面沉积了大量的有毒污染物，如重金属和多环芳烃(PAH)，而沉积物(RDS)是道路污染物的主要载体，道路表面的有毒污染物主要沉积在RDS上。当降雨发生时，RDS和附着在上面的沉积物被冲到雨水径流中，威胁道路雨水回用安全。
目前，有较多的研究人员关注RDS污染的雨水径流，但是仅限于污染物本身，如附着在RDS上的重金属(Cr、Cu、Ni、Pb、Zn)的堆积和冲刷过程，研究16种与RDS相关的PAH在城市环境中的空间分布。为了解RDS污染的雨水是否可以安全再利用，针对特定的污染物类型，由于RDS所含污染物种类的多样性及其毒性水平，无法对其再利用风险进行全面的调查。在这方面，迫切需要一种能够反映RDS中所有污染物所产生的综合风险的方法。
毒性试验已广泛应用于水资源的检测中，使用活生物体，如细胞、微生物、植物和动物进行毒性试验是一种相对全面的检测方法，在检测过程中，所有污染物发挥了相对综合的作用，使用活生物体检测的方法可以用来表征污染物是否具有危害效应。
RSD的负荷水平和空间分布收到城市道路环境如交通、土地利用和路面状况等的强烈影响，导致不同的道路采样点之间的污染物种类和附着在RDS上的负荷不同，不同道路产生的雨水径流的质量和毒性也不相同。为了确保道路雨水回用的安全，有必要知道哪些地方的雨水可以用于一定的回用目的。选择合适的道路位置收集雨水径流，对雨水的安全再利用具有重要意义。雨水中的污染物种类多，如积尘、有机物、轮胎污染物等，且雨水中的沉积物等污染物的含量大，雨水径流污染受降雨、采样方法等多种因素的影响，收集较为困难。现有技术中，多采用萃取的方法处理雨水，萃取其中的某类污染物，易将杂质引入到待测样品中；同时在RDS污染雨水径流领域的毒性试验并没有得到广泛的开展，如何使不同道路之间的RDS毒性具有可比性成为当前研究的热点内容之一。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的不同道路间雨水间的毒性不具有可比性、检测方法少等缺陷，从而提供一种评价道路雨水毒性的方法。
为此，本发明提供了以下技术方案。
本发明提供了一种评价道路雨水毒性的方法，包括以下步骤，
(1)收集待测路面的原位模拟雨水，得到道路沉积物样品；
(2)过滤所述道路沉积物样品，取不同体积的过滤后的道路沉积物样品进行冻干，稀释至相同体积，得到一系列不同浓度的工作液；
(3)将所述工作液加入生物细胞中培养进行毒性试验检测细胞毒性，得到等效面积ETAi与活生物细胞存活率的曲线，其中，
Figure BDA0002331382190000021
其中，A为待测路面的采样面积(m2)；
Vi为冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积(ml)；
V为所述道路沉积物样品的体积(L)；
(4)比较不同道路的ETA50，即半数生物细胞存活率对应的等效面积，以表征不同道路的水体毒性的大小。
所述步骤(2)中，过滤所述道路沉积物样品，取不同体积的过滤后的道路沉积物样品进行冻干，然后用培养基溶解稀释至相同体积，得到一系列不同浓度的工作液；所述培养基为所述步骤(3)中的生物细胞的培养液。
所述步骤(2)，冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积不大于15ml。
所述步骤(1)中，收集待测路面的原位模拟雨水的方法为干湿真空法。
所述步骤(1)中，收集待测路面的原位模拟雨水的具体步骤包括，
待测路面经6-8个干燥日后进行采样，收集道路表面的沉积物；
然后在道路表面喷洒溶剂，以收集粘附于路面上的沉积物；
清洗前述步骤采用的收集器，收集清洗液并与前述步骤的收集物混合，即得到道路沉积物样品。
其中，干燥日不能是雨天，经6-8个干燥日可以保证路面积累一定量的沉积物。
所述道路沉积物样品的体积为1-5L。
所述步骤(2)中，所述过滤的滤膜孔径为0.2-0.5μm；
所述滤膜为纤维素膜。
所述生物细胞为藻类、植物细胞或动物细胞。
所述生物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的评价道路雨水毒性的方法，该方法包括收集待测路面的原位模拟雨水，得到道路沉积物样品；过滤所述道路沉积物样品，取不同体积的过滤后的道路沉积物样品进行冻干，稀释至相同体积，得到一系列不同浓度的工作液；将所述工作液加入生物细胞中培养进行毒性试验检测细胞毒性，得到等效面积ETAi与活生物细胞存活率的曲线；比较不同道路的ETA50，即半数生物细胞存活率对应的等效面积，以表征不同道路的水体毒性的大小。该方法利用等效面积可以直观、简便的表征水体的总体毒性(总体毒性是指水体中不同数量(负荷/浓度)和不同毒性水平污染物的毒性)，且该方法以采样点的等效面积来表征毒性，等效面积越小，毒性越大，可以直观比较不同采样点水体毒性的大小，不受样品浓度、采样方法等因素的影响。
2.本发明提供的评价道路雨水毒性的方法，该方法通过对模拟雨水进行毒性测试，可以表征雨后道路雨水的毒性，本发明提供的评价道路雨水毒性的方法对道路雨水的回收具有重要意义。
该方法可用于雨水、污水、废水、再生水等水体的检测，如道路雨水、生活污水、再生水、工业废水、屋顶雨水等水体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中采样点待测路面的等效面积与中国仓鼠卵巢细胞存活率的曲线图；
图2是本发明实施例2中12个采样点待测路面的等效面积与中国仓鼠卵巢细胞存活率的曲线图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
以下实施例中用到的真空吸尘器为：品牌：海尔；型号：ZTBJ1200,China；功率：1200W。
实施例1
本实施例提供了一种评价道路雨水毒性的方法，包括以下步骤，
(1)在采样点的路缘和路中间地带之间的位置设置一个框架，作为采样区域，这是因为该区域通常有较高的RDS负荷和污染物的积累。待测路面经过7个干燥日后，采用干湿真空法在采样点采集路面上的沉积物，这是因为6-8天后道路表面的积尘量达到平衡，沉积物成为恒定值，干湿真空法采样可以保证路面上所有的样品都可以被收集，采样过程中以超纯水作为溶剂。本实施例以超纯水为空白组进行实验。
距离道路边缘2m的位置作为采样点，用包装胶带标出一定区域作为待测路面，该待测路面的采样面积为4.5m2，模拟雨水的操作为，使用真空吸尘器在采样点收集沉积物，包括三步，第一步是在采样区域内，用吸尘器刷子自左至右对路面上的干样进行收集，重复三次；第二步是在不产生径流的前提下，使用超纯水喷洒路面，使粘附在路面上的微粒溶解在水中，然后对湿的路面进行真空吸尘以收集颗粒污染物；第三步是施用超纯水彻底清洗吸尘器的刷子、容器和软管，使所有的样品被收集，洗涤水转移至取样容器中，即得到道路沉积物样品，道路沉积物样品的体积为4L，然后道路沉积物样品过孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，滤膜为纤维素膜，然后按照表1分别取0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL和15mL过滤后的道路沉积物样品进行冻干，分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9，冻干至道路沉积物样品形成粉末，然后用培养基将9个冻干后的道路沉积物样品粉末进行稀释，稀释至体积为1ml，得到9个不同浓度的工作液。
表1冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
V<sub>i</sub>(ml) 0.1 0.5 1 2 4 6 8 10 15
(2)中国仓鼠卵巢细胞的培养过程：
细胞复苏：将事先冻存的中国仓鼠卵巢细胞从冰箱中取出，用水浴锅在37℃进行溶解，在溶解时遵循慢冻速溶的原则，待其完全溶解便迅速取出；取出后，将其倒入15mL的离心管中，用细胞培养基定容至10mL，再放入离心机旋转1-2min，使细胞沉淀在离心管的底部，将离心管中液体倒掉后，再重新加入5mL的细胞培养基用吸管进行吹打，使沉淀的细胞重新均匀分布在培养基中，再转移进细胞培养瓶中置于CO2培养箱中培养24h。
细胞传代：培养24h后，将细胞培养瓶拿出来用显微镜观察细胞生长状况，如果生长状况不佳，便继续培养，反之，为了给予细胞充足的生长空间和营养物质，便需要进行传代工作。先将培养瓶中的液体倒掉，加入少量的PBS缓冲溶液覆盖细胞生长的壁后倾倒掉，随后加入足量的胰酶对生长在细胞培养瓶中的细胞进行消化，从聚集生长的条状消化成一颗一颗生长的球状，加入胰酶后进行轻微晃动1-2min，使其充分与细胞接触；晃动结束后倒掉胰酶，再加入少量的PBS缓冲溶液覆盖瓶细胞生长的壁后迅速倒掉，最后根据细胞的数量进行细胞培养基的添加，一般加入5-10mL的培养基，用吸管吹打细胞生长的壁，让贴壁的细胞溶入细胞培养基中后，轻轻吹打，使细胞在溶液中分布均匀，按1：1和1：2的配比重新将细胞培养在新的3个细胞培养瓶中，随后放入CO2培养箱中培养24h。
细胞种板：将生长良好的细胞按细胞传代的步骤进行至重新加入培养基并混匀的地方后，用10μL的移液枪吸取10μL的细胞液于细胞计数板中，用细胞计数板数细胞，再计算细胞的平均密度。按照每100μL有1000个细胞配置细胞液用于种板。用联排移液枪使96孔板中每个孔中有100μL的细胞液；同时为了防止挥发，96孔板的最外一圈加入100μL的PBS缓冲溶液，并且盖上封板膜，随后放入CO2培养箱中进行培养24h。
目标物暴露：将培养24小时的96孔板取出，撕去封板膜，随后清空板中所有液体。
(3)将不同浓度的工作液放入96孔板中进行中国仓鼠卵巢细胞存活率的测定。再将96孔板的四周加入PBS缓冲溶液并盖上封板膜防止挥发，随后放入全自动振荡仪以300r/min振荡10min，结束后放入CO2培养箱中培养72小时。
细胞染色：按1：9的配比将CCK-8试剂与F12K完全培养基混合，按照所需染色的板决定配置染色液的剂量。随后将培养72h的96孔板取出，撕去封板膜后清空板中所有工作液。用联排移液枪在每个种过细胞的孔中加入100μL的染色液，随后放入CO2培养箱中培养3h，并在3h时取出用酶标仪(型号：Molecular Devices,SpectraMax L,USA)在450nm下测得96孔板中溶液的吸光度，计算仓鼠卵巢细胞存活率，用作图软件Sigmaplot得到等效面积ETAi与仓鼠卵巢细胞存活率的曲线，并从曲线上读取仓鼠卵巢细胞存活率为50％时对应的等效面积ETA(50)，即半数仓鼠卵巢细胞存活率对应的等效面积；
其中，等效面积
Figure BDA0002331382190000081
A为待测路面的采样面积(m2)，Vi冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积(ml)，V为道路沉积物样品的体积(m3)；ETAi用于表征不同道路的水体毒性的大小。
待测路面的等效面积ETAi与仓鼠卵巢细胞存活率的曲线见图1，图1中是待测路面的等效面积与仓鼠卵巢细胞存活率的曲线图，读取曲线的半数仓鼠卵巢细胞存活率对应的等效面积ETA(50)，用以表征该路面的毒性大小。
实施例2
本实施例对实施例1中的评价道路雨水毒性的方法进行了验证，包括以下步骤，
(1)选取12个不同道路位置的雨水作为采样点，编号依次为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12，进行沉积物的收集，12不同道路位置的坐标见表2；在采样点的路缘和路中间地带之间的位置设置一个框架，作为采样区域。待测路面经7个干燥日后，采用干湿真空法在采样点收集道路沉积物样品，采样过程中以去离子水作为溶剂。
表2 12个采样点的地理坐标及道路特征
Figure BDA0002331382190000082
Figure BDA0002331382190000091
其中，DTVa是采样点的交通量；Rb是住宅面积在该坐标下总面积的占比；Cb是商业用地在该坐标下总面积的占比；Ib是工业用地在该坐标下总面积的占比；STDc是路面粗糙度。
按照实施例1中的步骤在12个采样点收集待测路面的沉积物，模拟雨水，得到12个道路沉积物样品，12个采样点的道路沉积物样品的体积见表3；每个采样点的道路沉积物样品均按照以下方法进行处理，得到一系列浓度不同的工作液：
道路沉积物样品过0.45μm滤膜进行过滤，然后取9个不同体积的过滤后的道路沉积物样品，冻干使其形成粉末，然后用培养基将冻干后的道路沉积物样品进行稀释，稀释至相同体积，均得到一系列不同浓度的工作液；其中，12个道路沉积物样品的体积和各个道路沉积物样品的冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积见表3。
(2)中国仓鼠卵巢细胞的培养过程：
细胞复苏：将事先冻存的中国仓鼠卵巢细胞从冰箱中取出，用水浴锅在37℃进行溶解，在溶解时遵循慢冻速溶的原则，待其完全溶解便迅速取出；取出后，将其倒入15mL的离心管中，用细胞培养基定容至10mL，再放入离心机旋转1-2min，使细胞沉淀在离心管的底部，将离心管中液体倒掉后，再重新加入5mL的细胞培养基用吸管进行吹打，使沉淀的细胞重新均匀分布在培养基中，再转移进细胞培养瓶中置于CO2培养箱中培养24h。
细胞传代：培养24h后，将细胞培养瓶拿出来用显微镜观察细胞生长状况，如果生长状况不佳，便继续培养，反之，为了给予细胞充足的生长空间和营养物质，便需要进行传代工作。先将培养瓶中的液体倒掉，加入少量的PBS缓冲溶液覆盖细胞生长的壁后倾倒掉，随后加入足量的胰酶对生长在细胞培养瓶中的细胞进行消化，从聚集生长的条状消化成一颗一颗生长的球状，加入胰酶后进行轻微晃动1-2min，使其充分与细胞接触；晃动结束后倒掉胰酶，再加入少量的PBS缓冲溶液覆盖瓶细胞生长的壁后迅速倒掉，最后根据细胞的数量进行细胞培养基的添加，一般加入5-10mL的培养基，用吸管吹打细胞生长的壁，让贴壁的细胞溶入细胞培养基中后，轻轻吹打，使细胞在溶液中分布均匀，按1：1和1：2的配比重新将细胞培养在新的3个细胞培养瓶中，随后放入CO2培养箱中培养24h。
细胞种板：将生长良好的细胞按细胞传代的步骤进行至重新加入培养基并混匀的地方后，用10μL的移液枪吸取10μL的细胞液于细胞计数板中，用细胞计数板数细胞，再计算细胞的平均密度。按照每100μL有1000个细胞配置细胞液用于种板。用联排移液枪使96孔板中每个孔中有100μL的细胞液；同时为了防止挥发，96孔板的最外一圈加入100μL的PBS缓冲溶液，并且盖上封板膜，随后放入CO2培养箱中进行培养24h。
目标物暴露：将培养24小时的96孔板取出，撕去封板膜，随后清空板中所有液体。
(3)将12个道路沉积物的一系列不同浓度的所有工作液放入96孔板中进行中国仓鼠卵巢细胞存活率的测定，其中浓度相同的不同采样点的工作液放置在同一列。再将96孔板的四周加入PBS缓冲溶液并盖上封板膜防止挥发，随后放入全自动振荡仪以300r/min振荡10min，结束后放入CO2培养箱中培养72小时。
细胞染色：按1：9的配比将CCK-8试剂与F12K完全培养基混合，按照所需染色的板决定配置染色液的剂量。随后将培养72h的96孔板取出，撕去封板膜后清空板中所有液体。用联排移液枪在每个种过细胞的孔中加入100μL的染色液，随后放入CO2培养箱中培养3h，并在3h时取出用酶标仪(型号：Molecular Devices,SpectraMax L,USA)在450nm下测得96孔板中溶液的吸光度，计算仓鼠卵巢细胞存活率，用作图软件Sigmaplot得到等效面积ETAi与仓鼠卵巢细胞存活率的曲线图，并从曲线上读取仓鼠卵巢细胞存活率为50％时对应的等效面积ETA(50)，即半数仓鼠卵巢细胞存活率对应的等效面积；12个采样点的待测路面的采样面积、冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积、等效面积ETA和仓鼠卵巢细胞存活率的实验数据见表3；
表3 12个采样点的待测路面的采样面积(A)、冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积(Vi)、等效面积ETA和仓鼠卵巢细胞存活率的实验数据
Figure BDA0002331382190000111
Figure BDA0002331382190000121
12个采样点的等效面积与仓鼠卵巢细胞存活率的曲线图见图2。
图2比较了12个不同道路采样点基于ETA的RDS的毒性，研究发现，与住宅道路相比，商业和工业路段的ETA50值一般较小。例如，S6采样点为深圳集成电路设计应用产业园(靠近校园与许多工业工厂和工业分数的67％)和S11(靠近繁忙的购物中心)的ETA(50)值为44.1cm2和21.6cm2，S2采样点为南山区丽山路(位于一个安静的住宅区)有更高的ETA(50)值，136.6cm2，这说明商业和工业区产生的RDS对CHO细胞的毒性要高于住宅区，这是由于商业和工业地区的车辆交通更加频繁，导致有毒污染物的排放量更高。因此，用ETA(50)值比较不同的道路站点之间的RDS毒性准确可行，且ETA(50)值越小，说明雨水的毒性越大。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)收集待测路面的原位模拟雨水，得到道路沉积物样品；
(2)过滤所述道路沉积物样品，取不同体积的过滤后的道路沉积物样品进行冻干，稀释至相同体积，得到一系列不同浓度的工作液；
(3)将所述工作液加入生物细胞中培养进行毒性试验检测细胞毒性，得到等效面积ETAi与活生物细胞存活率的曲线，其中，
Figure FDA0003408488290000011
其中，A为待测路面的采样面积，单位为m2；
Vi为冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积，单位为ml；
V为所述道路沉积物样品的体积，单位为L；
(4)比较不同道路的ETA(50)，即半数生物细胞存活率对应的等效面积，以表征不同道路的水体毒性的大小。
2.根据权利要求1所述的评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，过滤所述道路沉积物样品，取不同体积的过滤后的道路沉积物样品进行冻干，然后用培养基溶解稀释至相同体积，得到一系列不同浓度的工作液；所述培养基为所述步骤(3)中的生物细胞的培养液。
3.根据权利要求2所述的评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，所述步骤(2)，冻干前经过滤的道路沉积物样品的体积不大于15ml。
4.根据权利要求1所述的评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，收集待测路面的原位模拟雨水的方法为干湿真空法。
5.根据权利要求4所述的评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，收集待测路面的原位模拟雨水的具体步骤包括，
待测路面经6-8个干燥日后进行采样，收集道路表面的沉积物；
然后在道路表面喷洒溶剂，以收集粘附于路面上的沉积物；
采用收集器收集前述沉积物，清洗收集器，收集清洗液并与前述步骤收集的沉积物混合，即得到道路沉积物样品。
6.根据权利要求5所述的评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，所述道路沉积物样品的体积为1-5L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述过滤的滤膜孔径为0.2-0.5μm；
所述滤膜为纤维素膜。
8.根据权利要求1-6任一项所述的评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，所述生物细胞为藻类、植物细胞或动物细胞。
9.根据权利要求8所述的评价道路雨水毒性的方法，其特征在于，所述生物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
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