CN111100193B - 一种真菌药敏性靶点及基于该靶点的药物分子设计和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种真菌药敏性靶点及基于该靶点的药物分子设计和应用，涉及药物靶标材料技术领域。本发明以与氰烯菌酯结合的禾谷镰刀菌肌球蛋白‑5马达结构域关键氨基酸为靶点设计药物分子，证明针对禾谷镰刀菌肌球蛋白Myosin‑5马达结构域与氰烯菌酯互作的关键氨基酸是一个可靠的药物分子设计靶点，可用来进行新型的抗小麦赤霉病药物研发。本发明以禾谷镰刀菌肌球蛋白‑5马达结构域为靶点进行高通量药物筛选，证明该蛋白是一个可靠的靶点，可用来进行新型的抗真菌药物研发。

Description

一种真菌药敏性靶点及基于该靶点的药物分子设计和应用
技术领域
本发明属于药物靶标材料技术领域，具体涉及一种真菌药敏性靶点及基于该靶点的药物分子设计和应用。
背景技术
禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌是引起小麦、玉米和大麦的叶部病害、根腐病和幼苗枯萎病的植物病原体，而水稻恶苗病菌是引起水稻恶苗病的镰刀菌属的植物病原体。这些病原体不仅造成大量的产量损失，而且感染了谷物会产生包括对人和动物有毒的霉菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。氰烯菌酯是一种新型氰基丙烯酸酯类杀菌剂，已知通过非竞争性抑制I型肌球蛋白的ATP酶活性发挥功能，从而阻止菌丝生长。研究发现氰烯菌酯只对与禾谷镰刀菌PH-1菌株Myosin-5具有97％以上氨基酸序列同源性的小麦赤霉病菌、水稻恶苗病菌、瓜类枯萎病菌(F.verticillioidies)和人类角膜炎病菌等几种镰刀菌具有较高的抑菌活性，而对同源性只有82.30％～89.66％的多种病原菌如灰霉病菌(Botrytiscinerea)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)和小麦白粉病菌(Blumeria graminis)几乎没有抑制作用，将禾谷镰刀菌敏感菌株PH-1的Myosin-5与稻瘟病菌的Myosin-5进行同源置换后，禾谷镰刀菌突变体对氰烯菌酯表现抗性，说明Myosin-5序列的差异导致不同病原菌对氰烯菌酯药敏性差异。
通过基因组重测序和遗传转化的方法发现禾谷镰刀菌Myosin-5(FGSG_01410)第135、151、204、434、577或581氨基酸位点可发生总频率为27.2％的突变，显著降低对氰烯菌酯的敏感性，表现为低水平抗药性；第418、424或577位氨基酸可发生总频率为5％的突变，对氰烯菌酯产生中等水平的抗药性；第216、217或420位氨基酸可发生67.8％的突变，对氰烯菌酯产生高水平抗药性；说明禾谷镰刀菌对氰烯菌酯较易产生抗药性，且高水平抗性的频率较高。另外水稻恶苗病菌Myosin-5第219位氨基酸突变也会对氰烯菌酯产生高水平抗药性。
氰烯菌酯与靶标肌球蛋白-5的互作机制尚不明确，氰烯菌酯活性位点的鉴定对于高活性肌球蛋白小分子抑制剂的设计及高通量药物筛选具有重要的现实意义，并一直是实验室基础研究及企业应用研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种真菌药敏性靶点及其基于该靶点的药物分子设计和应用，氰烯菌酯敏感性关键氨基酸的鉴定，证实A/T135、V/M151、P/S204、K/R/E216、S/P/L217、K/M375、Y409、S/R418、F419、I/R424、E/K/G/D420、C423、I/M434、A/T/G577、R/H/G580和I/F581是氰烯菌酯药敏性的关键靶点，可用于抗真菌药物分子设计；同时所述靶点可靠，可用于高通量药物分子筛选，以上设计和筛选的药物分子对肌球蛋白-5具有亲和性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种真菌药敏性靶点肌球蛋白-5，所述靶点肌球蛋白-5含有与化合物小分子肌球蛋白抑制剂结合的马达结构域，所述马达结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选的，所述靶点肌球蛋白-5来源于禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)。
优选的，所述化合物小分子肌球蛋白抑制剂与所述马达结构域的结合域由第115位氨基酸至595位氨基酸组成。
优选的，所述结合域包括：A/T135、V/M151、P/S204、K/R/E216、S/P/L217、K/M375、Y409、S/R418、F419、I/R424、E/K/G/D420、C423、I/M434、A/T/G577、R/H/G580和I/F581氨基酸位点，还包括肌球蛋白-5的马达结构域，或所述肌球蛋白-5马达结构域的大片段或功能域。
优选的，所述化合物小分子肌球蛋白抑制剂与所述结合域中的任意一个或多个氨基酸位点结合，或与肌球蛋白-5整个马达结构域结合，或与肌球蛋白-5马达结构域的大片段结合，或与肌球蛋白-5的功能域结合。
本发明还提供了所述靶点肌球蛋白-5在设计所述靶点肌球蛋白-5的抑制剂分子中的应用。
本发明还提供了一种靶点肌球蛋白-5的抑制剂分子，所述抑制剂分子针对所述肌球蛋白-5的马达结构域内A/T135、V/M151、P/S204、K/R/E216、S/P/L217、V/I/K/M375、Y409、S/R418、F419、I/R424、E/K/G/D420、C423、I/M434、A/T/G577、R/H/G580和I/F581中的任意一个或多个氨基酸设计得到，或针对肌球蛋白-5整个马达结构域设计得到，或针对肌球蛋白-5整个马达结构域的大片段设计得到，或针对肌球蛋白-5功能域设计得到，且能够与所述肌球蛋白-5马达结构域内的所述氨基酸结合。
本发明还提供了所述抑制剂分子在制备对病原真菌引起的植物或人畜病害具有防治作用的药物中的应用。
本发明提供了所述靶点肌球蛋白-5在高通量筛选抗真菌药物中的应用。
本发明提供了一种抗真菌药敏性靶点肌球蛋白-5，揭示氰烯菌酯与肌球蛋白-5的互作位点，证实禾谷镰刀菌Myosin-5蛋白的马达结构域是氰烯菌酯的作用靶点，本发明实施例中，证实A/T135、V/M151、P/S204、K/R/E216、S/P/L217、K/M375、Y409、S/R418、F419、I/R424、E/K/G/D420、C423、I/M434、A/T/G577、R/H/G580和I/F581等肌球蛋白形成的口袋结构的位点是氰烯菌酯药敏性的关键靶点，可作为肌球蛋白抑制剂分子设计的重要靶点。
本发明建立了在分子水平上鉴定氰烯菌酯的活性位点，以氰烯菌酯作为先导化合物、以禾谷镰刀菌肌球蛋白-5马达结构域的氰烯菌酯结合活性位点进行新型的化学分子设计，以禾谷镰刀菌肌球蛋白Myosin-5马达结构域为靶点进行高通量药物筛选，均证明该蛋白是一个可靠的靶点，可用来进行新型的抗小麦赤霉病药物研发，为现有抗真菌药物研发提供一个新的思路和方向。
附图说明
图1为通过ADP-GloTMKinase Assay(Promega)试剂盒法测定Myosin-5(1-736)酶活性图；其中A表示氰烯菌酯可以抑制肌球蛋白-5的ATP酶活性，B表示氰烯菌酯与肌球蛋白-5的结合力为0.36μM；
图2为Myosin-5(1-736)和FgCaM与氰烯菌酯复合体晶体结构图；
图3为氰烯菌酯抑制禾谷镰刀菌肌球蛋白-5与氰烯菌酯结合部位氨基酸突变体蛋白的ATP酶活性；
图4为肌球蛋白-5与氰烯菌酯结合部位氨基酸突变的禾谷镰刀菌对氰烯菌酯敏感性测定图；A代表肌球蛋白-5与氰烯菌酯结合部位的氨基酸突变的禾谷镰刀菌在没有氰烯菌酯处理条件下的生长示意图，B代表肌球蛋白-5与氰烯菌酯结合部位的氨基酸突变的禾谷镰刀菌对氰烯菌酯敏感性测定；
图5为以氰烯菌酯为先导化合物，以禾谷镰刀菌的氰烯菌酯结合部位为靶点，展示先导化合物氰烯菌酯结构及其与靶蛋白的结合方式。A代表靶蛋白肌球蛋白-5活性腔主视图，B代表靶蛋白活性腔侧视图，C代表先导化合物与靶标蛋白关键氨基酸残基，D代表先导化合物与靶蛋白结合方式；
图6为以氰烯菌酯为先导化合物进行设计的一系列化合物结构通式；
图7为目标化合物与靶蛋白结合方式预测图；
图8为目标化合物抑制的ATP酶活性的筛选图；
图9为以肌球蛋白-5为靶点在化合物库中进行活性化合物的筛选图；
图10为目的线性载体获得示意图。
具体实施方式
一种真菌药敏性靶点肌球蛋白-5，所述靶点肌球蛋白-5含有与化合物小分子肌球蛋白抑制剂结合的马达结构域，所述马达结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述靶点肌球蛋白-5(Myosin-5)优选来源于禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)。本发明所述化合物小分子肌球蛋白抑制剂与所述马达结构域的结合域优选由第115位氨基酸至595位氨基酸组成，所述结合域优选包括：A/T135、V/M151、P/S204、K/R/E216、S/P/L217、K/M375、Y409、S/R418、F419、I/R424、E/K/G/D420、C423、I/M434、A/T/G577、R/H/G580和I/F581氨基酸位点，还包括肌球蛋白-5整个马达结构域，大片段及结构域。本发明所述化合物小分子肌球蛋白抑制剂与所述结合域中的任意一个或多个氨基酸结合，与肌球蛋白-5整个马达结构域结合，与肌球蛋白-5整个马达结构域大片段结合，与肌球蛋白-5功能域结合。
本发明将所述靶标肌球蛋白-5与氰烯菌酯共结晶，将得到的晶体进行衍射和三维结构解析，得复合体三维结构。本发明对所述共结晶、衍射和三维结构解析的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。
本发明在所述复合体三维结构的所述氰烯菌酯结合域位置进行氨基酸突变，测定突变体蛋白在氰烯菌酯处理下的ATP酶活性和禾谷镰刀菌氨基酸突变体的氰烯菌酯药敏性，筛选得到对氰烯菌酯药敏性相关的肌球肌球蛋白-5的位点A/T135、V/M151、P/S204、K/R/E216、S/P/L217、K/M375、Y409、S/R418、F419、I/R424、E/K/G/D420、C423、I/M434、A/T/G577、R/H/G580和I/F581。其中抗性表型如表1所示，
表1突变体抗性表型
Figure BDA0002341795960000051
本发明对所述氨基酸突变的方法并没有特殊限定，优选利用QuickChange Method(Agilent)进行。本发明所述ATP酶活性的测定方法优选包括ADP-GloTMKinase Assay(Promega)。本发明对所述ADP-GloTMKinase Assay(Promega)的方法并没有特殊限定，按照试剂盒的说明书进行即可。本发明所述氨基酸突变的位置优选位于肌球蛋白-5形成的氰烯菌酯结合的口袋结构中。本发明所述ADP-GloTMKinase Assay(Promega)的方法是检测激酶反应中所形成的ADP，ADP随后被转化成ATP，然后ATP再被Ultra-GloTM萤光素酶转化成光。筛选的标准是发光信号的强弱，因为其与激酶活性正相关。
本发明提供了所述靶点肌球蛋白-5在设计所述靶点肌球蛋白-5的抑制剂分子中的应用。本发明所述应用优选以氰烯菌酯为先导化合物，以禾谷镰刀菌肌球蛋白-5的氰烯菌酯结合部位为靶点，进行分子设计及活性筛选。本发明所述抗真菌药物优选的可抑制肌球蛋白-5的ATP酶活性，所述抗真菌药物中优选含有三氟甲基。本发明所述筛选优选基于ADP-GloTMKinase Assay(Promega)的方法进行，本发明对所述方法并没有特殊限定。
本发明还提供了一种靶点肌球蛋白-5的抑制剂分子，所述抑制剂分子针对所述肌球蛋白-5的马达结构域内A/T135、V/M151、P/S204、K/R/E216、S/P/L217、V/I/K/M375、Y409、S/R418、F419、I/R424、E/K/G/D420、C423、I/M434、A/T/G577、R/H/G580和I/F581中的任意一个或多个氨基酸设计得到，且能够与所述肌球蛋白-5马达结构域内的所述氨基酸结合。本发明所述抑制剂分子对于病原真菌引起的植物或人畜病害具有防治作用。
本发明还提供了所述抑制剂分子在制备对病原真菌引起的植物或人畜病害具有防治作用的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，利用本领域的常规剂型即可。本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供了所述靶点肌球蛋白-5作为靶点在高通量肌球蛋白抑制剂小分子筛选中的应用。本发明所述应用以禾谷镰刀菌肌球蛋白-5为靶点，进行高通量药物筛选。本发明所筛抗真菌药物优选的可抑制肌球蛋白-5的ATP酶活性，所述抗真菌药物为吴茱萸碱(吲哚喹唑啉)及吴茱萸酰胺(邻氨基苯甲酸衍生物)。本发明所述筛选优选基于ADP-GloTMKinase Assay(Promega)的方法进行，本发明对所述方法并没有特殊限定。
下面结合实施例对本发明提供的真菌农药氰烯菌酯药敏性靶点及其基于该靶点的药物分子设计和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)肌球蛋-5马达结构域Fg Myosin-5(1-736)由禾谷镰刀菌中克隆得到：
克隆引物：
F：TATATAGGATCCATGGGAATATCGAGACGCCCG(SEQ IDNO.2)；
R：TATATAGCGGCCGCTTAAGATTCGGCTCGGTAGGCAAG(SEQ ID NO.3)；
PCR扩增程序：98℃预变性1min；98℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保持。
PCR扩增反应体系(50μL)：5×HF buffer10μL，10mM dNTPS 1μL，Phusion HighFidelity 0.5μL，DNA 1μL(50ng/μL)，引物F和R各1μL，ddH2O 35.5μL。
酶切体系(25μL)：PCR片段(400ng/μL)1μL，限制性内切酶-1 1μL，限制性内切酶-21μL，10×HF buffer 2.5μL，ddH2O 19.5μL。
酶切程序：37℃孵育2h。
将得到的克隆基因与表达载体pFastBac1-H8连接，得到表达载体pFastBac1-FgMyosin-5(1-736)-H8，经过酶切验证和序列比对证明序列正确无误，可进行下一步的操作。
实施例2
利用昆虫细胞表达系统通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体(Bacmid)上，即将测序正确的含表达载体pFastBac1-FgMyosin-5(1-736)-H8的昆虫sf9细胞转化到DH10Bac细胞中，进行蓝白斑筛选，37℃恒温培养16h后挑取单克隆于液体LB培养基中37℃活化16h。提取穿梭质粒DNA转染昆虫sf9细胞后，得到子代病毒即为重组病毒P0代。将病毒P0代上清再次侵染昆虫sf9细胞，获得P1代重组病毒，使用病毒P1代上清侵染昆虫sf9细胞获得表达的重组蛋白FgMyosin-5(1-736)-H8。可使用Western blot或SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白的表达。
实施例3
FgMyosin-5(1-736)-H8蛋白的纯化
表达：吸取P1代病毒上清以1:100的体积比侵染每毫升含2～3×106的昆虫sf9细胞，细胞在27℃摇床125rpm摇培48h。
裂解：收集细胞，向收集的沉淀中加入适量的(不超过超离管总体积的三分之二)昆虫细胞裂解液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)，震荡使沉淀充分重悬，置于冰上在超声破碎仪中裂解昆虫sf9细胞，功率为30％，超声5s，间隔10s，共30min。使用超高速冷冻离心机在4℃条件下18000rpm离心60min，收取上清，弃沉淀。
上样：使用AKTA pure蛋白纯化仪，将5mL His-Trap预装柱安装在仪器上，使用Buffer A(20mM Tris-HCL，150mM NaCL，25mM imidazole，pH8.0)平衡机器及预装柱，平衡完毕后进行上清上样，使带有His Tag的目的蛋白与预装柱中的NTA beads结合(5mL/min上样速度)。
洗脱：待所有目的蛋白与beads结合完成后，用新鲜的BufferA将预装柱清洗干净(直到软件中的A280及A245曲线平稳)，换用梯度浓度咪唑的蛋白质洗脱液Buffer B(20mMTris-HCl，150mM NaCl，500mM imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白，当显示屏上A280曲线开始出现峰形时收集样品，待样品收集完毕后用1M咪唑和去离子水分别清洗预装柱及机器。
电泳：取洗脱收集到的蛋白样品加入到sample buffer，100℃煮沸10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，然后进行考马斯亮蓝染色、脱色。根据电泳结果用50kDa的超滤管对收集到的蛋白质样品进行浓缩，使得样品体积最终为1.0mL以便于进行分子筛分离。
凝胶过滤层析：将上述样品添加至24mL的Superdex 200 increase 10/300 GL中，利用分子量的大小进一步纯化。流速为0.5mL/min，收集蛋白在A280对应的吸收峰。利用50kDa的超滤管对收集到的蛋白质样品进行浓缩，使得样品最终浓度为10mg/mL以便于进行蛋白结晶筛选。
实施例4
FgMyosin-5(1-736)-H8蛋白与氰烯菌酯的共结晶、X光衍射、结构解析
FgMyosin-5(1-736)-H8蛋白与氰烯菌酯的共结晶：按蛋白(靶标蛋白与氰烯菌酯的摩尔比优选为1:1)与晶体生长缓冲液体积1:1的比例(0.2μL+0.2μL)通过The PhoenixLiquid Handling System加入到96孔晶体板中，并用透明封口膜封闭。将晶体板置于20℃，32％湿度的环境中，每天通过显微镜观察直到晶体出现。利用终浓度为20％EnthyleneGlycol作为保护液，以1:1的体积比(V/V)加入到盛有FgMyosin-5(1-736)-H8蛋白与氰烯菌酯复合体晶体的96孔晶体板中，使用Cyro LoopTM(Hampton Research)的尼龙环将单个晶体从液滴中挑出，之后整体置于提前用液氮冷却的圆形套管中冷冻保存。
FgMyosin-5(1-736)-H8蛋白与氰烯菌酯的复合体晶体的X光衍射：在美国芝加哥Argonne National Laboratory的APS(Advanced Photon Source)第21号部门(LS-CAT)具有ID-D光束照射设备，对蛋白晶体进行衍射数据的收集。在这过程中，晶体应始终处于100K氮气束流的保护中，以避免晶体在X射线的照射下产生热量使其受到损害，若检测到衍射分辨率较高的晶体，则需要对其所有衍射数据进行收集。
FgMyosin-5(1-736)-H8蛋白与氰烯菌酯的复合体晶体的结构解析：所有X光衍射的数据均利用XDS进行了初步处理，随后使用CCP4数据包进行了整合，人源Myosin 1c(PBDcode:4BYF)作为分子模型，利用COOT进行初始模型的建立以及利用PHENIX programpackage进行优化，优化得到的FgMyosin-5(1-736)-H8与氰烯菌酯复合体晶体结构如图2所示。
实施例5
FgMyosin-5(1-736)-H8蛋白ATP酶活性检测
采用ADP-GloTMKinase Assay(Promega)的方法来检测FgMyosin-5(1-736)-H8蛋白在氰烯菌酯存在和不存在两种情况下的ATP酶活性(水解ATP的能力)，后续FgMyosin-5(1-736)-H8氨基酸突变蛋白ATP酶活性检测也基于此方法。ADP-GloTMKinase Assay(ADP-GloTM激酶检测试剂盒)是一个发光法的激酶检测试剂盒，它检测激酶反应中所形成的ADP，ADP随后被转化成ATP，然后ATP再被Ultra-GloTM萤光素酶转化成光。发光信号与激酶活性正相关。
在含有0.5mM ATP的1×Kinase Reaction Buffer A(40mM Tris pH 7.5、20mMMgCl2和0.1mg/mL BSA)中进行ATPase分析。为了测定氰烯菌酯对FgMyosin-5(1-736)的抑制反应，反应混合液中包含：0.5μM FgMyosin-5(1-736)、0.1μM FgCam、0.5mM ATP以及一系列浓度梯度的氰烯菌酯，氰烯菌酯溶解在1×Kinase Reaction Buffer A中。25℃孵育30min，外源添加5μL ADP-GloTM来终止ATPase反应并耗尽上述反应未消耗的ATP，然后在25℃继续孵育40min。加入10μL Kinase Detection Reagent将ADP转化为ATP，在室温下与Ultra-GloTM萤光素酶和萤光素一起孵育40min，以通过酶标仪测量荧光素酶的发光信号来检测剩余的ATP。结果如图1所示，A图表明随着氰烯菌酯的浓度逐步提高，其荧光素酶的信号强度逐步降低，表明反应体系中剩余的ATP含量逐步降低，说明肌球蛋白-5的ATP酶活性受到抑制，导致形成的ADP含量降低，可被转化为ATP的ADP含量不足；B图说明以肌球蛋白的ATP酶活性为测定标准，得到氰烯菌酯对肌球蛋白-5的抑制中浓度为0.36μM。
实施例6
FgMyosin-5(1-736)-H8与氰烯菌酯结合部位氨基酸突变的蛋白ATP酶活性检测
点突变：FgMyosin-5(1-736)-H8氨基酸点突变使用QuickChange Method(Agilent)，使用模板为pFastBac1-FgMyosin-5(1-736)-H8所有的质粒均经过测序验证正确。
ATP酶活性检测：使用与实施例5中相同的测定方法。
实施例7
FgMyosin-5(1-736)-H8与氰烯菌酯结合部位的氨基酸突变的禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的敏感性测定
点突变线性载体的构建：
设计引物：A1和A2引物，以PH-1的基因组DNA为模板，通过PCR扩增出Myosin-5的上游DNA序列；
A1序列：TTGCGGTAGGAGAAGATG(SEQ IDNO.4)；
A2序列：AGCCAGCCAACAGCTCCCAAGGGAAACTCTGGAAGC(SEQ IDNO.5)。
设计引物：HPH引物F和HPH引物R，以含有潮霉素的质粒PtrpChptA-PItk为模板，通过PCR扩增获得潮霉素单筛筛选标记基因。
引物HPH-F：GGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGG(SEQ IDNO.6)；
引物HPH-R：GGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTG(SEQ IDNO.7)。
设计引物：
以扩增获得M375K的点突变片段为例，以PH-1的基因组DNA为模板，引物A3和引物M375K mutation R扩增片段1，引物M375K mutation F和引物A4扩增片段2，以片段1和片段2为模板，引物A3和引物A4扩增出含有M375K的点突变DNA片段。其他点突变的获得与M375K片段的获得方法一致。
引物A3：TACGCAAACCGCCTCTCCCCTTCCTCCGTGCCGTGATA(SEQ IDNO.8)
引物M375K mutation R：ggttgctgtagatggcCTTtgcaagggcatcccgag(SEQ IDNO.9)
引物M375K mutation F：ctcgggatgcccttgcaAAGgccatctacagcaacc(SEQIDNO.10)
引物A4：TCGGCTGGGACTTGTGAA(SEQ IDNO.11)
以获得的M375K、Y409A、F419A、C423D、A577F的点突变DNA片段、潮霉素单筛筛选标记基因DNA片段、FgMyosin-5的上游DNA片段为模板，借助Double-jointPCR的反应程序将三个线性片段融合为一个线性片段。
使用的酶为
Figure BDA0002341795960000111
Max Super-Fidelity DNA Polymerase，具体的PCR反应体系和扩增程序如下：
Figure BDA0002341795960000112
Max Super-Fidelity DNA Polymerase的PCR反应体系(25μL)：2×Phanta Max Buffer 12.5μL，dNTP Mix(10mM each)0.5μL，PhantaMax Super-FidelityDNA Polymerase 0.5μL，模板DNA摩尔质量比(1.2:1.7:3)，余量ddH2O。
反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，68℃退火30s(每循环减1℃)，11个循环；72℃延伸1min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，17个循环；72℃延伸10min，15℃保持。
最后将融合PCR产物稀释5倍作为模板，通过普通PCR扩增出大量的线性片段，回收后即为所需要的目的线性载体(图10)。
PEG介导的禾谷镰刀菌原生质体转化：
(1)活化禾谷镰刀菌标准菌株PH-1，将其接种至PDA培养基上生长2天后，用灭过菌的手术刀切割30块菌丝块(菌丝块越小越好)，转移至100mL YEPD液体培养基中。在25℃条件下，175rpm摇床上摇培12～16h，长出浓密的菌丝块即可取出。
(2)在超净工作台中，用灭过菌的三层擦镜纸过滤YEPD培养基中的菌丝块，并用0.7mol/L氯化钠溶液洗涤过滤两次。
(3)取药匙，在酒精灯上灭过菌后，冷却至常温，挖出擦镜纸上的菌丝块，放入灭过菌的50mL三角瓶中。
(4)取50mL离心管，在分析天平上分别称取0.2g蜗牛酶、0.1g崩溃酶、0.1g裂解酶，然后加入20mL的0.7mol/L氯化钠溶液配制成裂解细胞壁的混酶溶液。4℃、4000rpm离心20min后去除酶渣，将上清液迅速倒入有菌丝块的50mL三角瓶中。
(5)在三角瓶上加上封口膜后，于30℃条件下，85rpm摇床上摇培2h。
(6)将得到的混酶裂解溶液在超净工作台中用灭过菌的三层擦镜纸过滤，滤去琼脂块，滤液用50mL离心管承接。另取一管用于配平，两管做好标记后，配平。室温、2000rpm离心5min，弃上清液。然后用20mL的0.7mol/L氯化钠溶液洗涤原生质体，配平，室温、2000rpm离心5min，弃上清。
(7)加入20mL STC溶液洗涤原生质体，配平后，室温、2000rpm离心5min，弃上清液。
(8)加入160μL STC溶液重悬原生质体，充分混匀。在血球计数板上加入5μL原生质体溶液，盖好盖玻片后，在显微镜下计数原生质体的数量。最终使得原生质体的数量为107个/mL。
(9)在上述计数好的原生质体溶液中加入SPTC溶液，使得SPTC溶液：STC溶液的体积比为1:4，混匀后，在冰上冰浴30min，待用。
(10)将上述处理好的原生质体溶液分装至另取的50mL离心管中，每管分装200μL，同时在每管中分别加入10μL 5μg/mL肝素钠溶液、10μg质粒DNA，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置1h，期间每隔15min轻轻转动离心管混匀质粒DNA和原生质体溶液。
(11)在微波炉中融化提前配制好的再生培养基(RM培养基)，放65℃烘箱待用。
(12)向步骤(10)的混合溶液加入1mL SPTC溶液，用移液器轻轻吸打混匀后，放25℃生化培养箱中培养30min。
(13)从烘箱中取出RM培养基，在超净工作台中晾至43℃，逐个将每瓶100mL RM培养基与每管原生质体混合溶液混匀后倒9mm培养皿，每瓶培养基约倒6个培养皿。待培养基晾干凝固后，用保鲜膜封好，做完标记，于25℃生化培养箱中培养12～16h。
(14)待RM培养基上长出菌丝后，在微波炉融化提前配制好的覆盖培养基(SRM培养基)，在超净工作台中晾至43℃。在200mL培养基中加入300μL 105μg/mL潮霉素溶液，充分混匀后倒覆盖，将其覆盖在RM培养基上面，厚度保持适中。待培养基晾干凝固后，用保鲜膜封好，做完标记，于25℃生化培养箱中培养2～7d。
(15)每天查看覆盖培养基，当其上长出白色的单菌落时，则可以挑取转化子。
(16)在微波炉融化提前配制好的PDA培养基，在超净工作台中晾至43℃。在200mL培养基中加入300μL 105μg/mL潮霉素溶液，充分混匀后，倒9mm培养皿，待培养基晾干凝固后，即为含潮霉素的单筛PDA平板。将SRM培养基上长出的白色菌落用灭过菌的牙签分别挑取接种至含潮霉素的单筛PDA平板上，用保鲜膜封好，做完标记，于25℃生化培养箱中培养12～16h。
(17)将在含潮霉素的单筛PDA平板上仍然能生长的菌落(转化子)用灭过菌的牙签转接至不含抗生素的PDA培养基上，用保鲜膜封好，做完标记，于25℃生化培养箱中培养，即为得到禾谷镰刀菌遗传转化的转化子。
分别将得到的突变体对氰烯菌酯敏感性测定，测定方法如实施例5所示，其结果如表2和图3和图4所示：
表2禾谷镰刀菌肌球蛋白-5氨基酸突变体对氰烯菌酯敏感性测定
Isolate IC<sub>50</sub>(μM) 相关系数R RF 抗药性水平
PH-1 2.64 0.92 - -
M375K 413.9 0.98 156.81 高
Y409A 235.80 0.96 89.32 中
Y419A 25.90 0.99 9.81 低
C423D 12.26 0.99 4.64 低
A577F 11.42 0.96 4.33 低
注：表1中IC50：50％抑制效果时有效浓度；RF：抗性菌株IC50与野生型菌株IC50的比值；PH-1为野生型禾谷镰刀菌。
实施例8
以禾谷镰刀菌肌球蛋白-5氰烯菌酯结合部位为靶点，以氰烯菌酯为先导化合物进行小分子设计、合成与活性筛选。
先导化合物：分子对接先导化合物氰烯菌酯与靶标的结合能为-7.3kcal mol-1。先导化合物氰烯菌酯与靶蛋白中的Ser217和Lys537氨基酸残基分别形成氢键作用。根据先导化合物氰烯菌酯的结构及其与靶蛋白的结合方式，可将活性腔分为芳环作用区(图5中A-C紫色所示)和连接链区(图5中A-C中绿色所示)。
目标化合物的设计：
(1)在活性腔闭口端(图5中A-C中蓝色所示)有酪氨酸存在，可通过在先导化合物苯环(特别是对位)上连接不同的电负性原子(如卤素、三氟甲基、甲氧基和羧基等)，以期与靶蛋白形成新的氢键；
(2)根据生物电子等排原理，将苯连的双键以酰胺、磺酰胺和脲基替换；
(3)在活性腔远离苯环的一端，存在较大的空间，存在Asp、Asn、Met等氨基酸残基。为了提高所设计化合物与靶标的亲和力，在(2)中引入的酰胺等片段上连接取代芳环或脂肪环(酰胺取代芳环、卤素取代芳环等)，以期与靶蛋白形成新的相互作用；
(4)对(2)中设计的酰胺和磺酰胺片段翻转，以考察其对活性的影响；
(5)对先导化合物的苯环以不同的杂环替代，考察杂环对活性的影响。
基于上述条件设计了如图6所示的一系列化合物。
目标化合物与靶蛋白结合方式预测：
为了对所设计化合物的合理性进行初步探究，选取具有代表性的化合物与靶蛋白进行分子对接模拟，考察其在活性腔内与氨基酸残基的相互作用模式。分子对接模拟采用AutoDock-Vina软件进行计算，其结果如图7所示。
由对接结果可知，所设计的化合物均可结合于靶蛋白的活性腔内。图7中A中的化合物为A系列代表化合物，该化合物可与靶蛋白中先导化合物结合的关键氨基酸残基Ser217和Lys537形成氢键的同时，在苯环中引入的电负性原子可与Tyr409形成新的氢键作用，该化合物与靶蛋白的结合能为-7.7kcal mol-1，表明设计策略(1)的合理性；图7中B中的化合物为B系列代表化合物，经生物电子等排替换双键的酰胺基团可与Ser217残基形成氢键作用，同时苯环对位引入的氟原子与Tyr409形成氢键，该化合物与靶蛋白的结合能为-8.1kcal/mol，表明设计策略(1)和(2)的合理性；图7中C中的化合物为C系列代表化合物，经生物电子等排替换双键的磺酰胺基团可与Ser217、Lys216和Lys537残基形成氢键作用，新引入的苯环中的酰胺片段也可与Asp536残基形成氢键作用，该化合物与靶蛋白的结合能为-8.4kcal mol-1表明设计策略(1)(2)和(3)的合理性；图7中D中的化合物为D系列代表化合物，经生物电子等排替换双键的脲基团可与Lys216残基形成氢键作用，尽管苯环对位引入的氟原子未能与Tyr409形成氢键作用，但新引入的苯环中的酰胺片段也可与Asp536残基形成氢键作用，该化合物与靶蛋白的结合能为-7.8kcal/mol。综上，分子对接结果表明，所设计化合物不仅能与Ser217、Lys537形成关键的氢键作用，还能与其他氨基酸残基形成新的相互作用，且与靶蛋白的结合能高于先导化合物，验证了设计思路的合理性，进而表明这些化合物可能对靶蛋白具有较好的活性。
目标化合物的活性筛选
采用ADP-GloTMKinase Assay(Promega)的方法来检测目标化合物的活性，为了测定目标化合物对Fg Myosin-5 Myosin-5(1-736)-H8的抑制反应，反应混合液中包含：0.5μMMyosin-5(1-736)-H8、0.1μM FgCam(外源添加钙调蛋白)、0.5mM ATP以及0.5μM的目标化合物，目标化合物溶解在1×Kinase Reaction Buffer A中。25℃孵育30min，外源添加5μLADP-GloTM来终止ATPase反应并耗尽上述反应未消耗的ATP，然后在25℃继续孵育40min。加入10μL Kinase Detection Reagent将ADP转化为ATP，在室温下与Ultra-GloTM萤光素酶和萤光素一起孵育40min，以通过酶标仪测量荧光素酶的发光信号来检测剩余的ATP。设置DMSO对照组和5μM氰烯菌酯对照。初步证明设计的7个系列化合物均可以抑制肌球蛋白-5的ATP酶活性，其结果如图8所示。验证了氰烯菌酯作为先导化合物，肌球蛋白-5与氰烯菌酯结合部位作为分子设计的靶点，设计小分子化合物的思路的合理性。
实施例9
以FgMyosin-5(1-736)-H8为靶点在化合物库中进行筛选
初筛：靶向FgMyosin-5(1-736)-H8的小分子抑制剂的筛选也是基于ADP-GloTMKinase Assay(Promega)的方法，通过不断的优化，将反应体系从25μL降至10μL，FgMyosin-5(1-736)的反应浓度为0.1μM，FgCam(钙调蛋白)的浓度为0.1μM，ATP浓度为20μM，小分子浓度为50μM。整个反应在透明的384孔平底板中完成，设置DMSO对照组和5μM氰烯菌酯对照。
用Janus自动化移液工作站将浓度为2mM化合物库中的小分子化合物转移至透明的384孔板中，每个孔1μL。配制反应预混液，完成后用MultidropTMCombi分液仪将反应体系分装到每个反应孔中，分装完毕后，将384孔板转移至25℃孵育30min，用MultidropTMCombi分液仪外源添加5μL ADP-GloTM来终止ATPase反应并耗尽上述反应未消耗的ATP，然后在25℃继续孵育40min。用MultidropTMCombi分液仪加入10μL Kinase Detection Reagent将ADP转化为ATP，在室温下与Ultra-GloTM萤光素酶和萤光素一起孵育40min，以通过Enspire酶标仪测量荧光素酶的发光信号，测定完成后数据用Graphpad prim软件处理。
复筛：设置化合物浓度梯度：将在初筛中对FgMyosin-5(1-736)的ATP酶活性有影响的化合物从化合物中挑选出来，每个化合物设置3个反应浓度梯度，即1μM、25μM、50μM，每个浓度3次重复，进行进一步的活性验证。实验步骤同上。
图9为以FgMyosin-5(1-736)为靶点在化合物库中进行初步筛选获得结果，基于ATP酶活性检测，采用ADP-GloTM Kinase Assay的方法，以5μM氰烯菌酯为对照药剂，对含有1242个化合物的小分子库进行高通量筛选，获得了8个抑制率超过40％的抑制剂。对初筛得到的化合物进一步的复筛验证，通过浓度依赖效果、化合物影响酶活的选择性、复孔验证化合物影响作用等一系列的复筛验证后，最终确定的先导化合物为吴茱萸碱(吲哚喹唑啉)及吴茱萸酰胺(邻氨基苯甲酸衍生物)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种真菌药敏性靶点及基于该靶点的药物分子设计和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1214
<212> PRT
<213> Fusarium graminearum
<400> 1
Met Gly Ile Ser Arg Arg Pro Lys Asn Lys Gly Ala Gly Ala Ala Ala
1 5 10 15
Asp Gly Ala Ser Gly Gly Ala Lys Pro Lys Lys Ala Thr Phe Glu Thr
20 25 30
Thr Lys Lys Lys Glu Ile Gly Val Ser Asp Leu Thr Leu Leu Ser Lys
35 40 45
Val Ser Asn Glu Ala Ile Asn Glu Asn Leu Lys Lys Arg Phe Glu Gly
50 55 60
Arg Glu Ile Tyr Thr Tyr Ile Gly His Val Leu Val Ser Val Asn Pro
65 70 75 80
Phe Arg Asp Leu Gly Ile Tyr Thr Asp Asp Val Leu Gln Ser Tyr Met
85 90 95
Gly Lys Asn Arg Leu Glu Met Pro Pro His Val Phe Ala Ile Ala Glu
100 105 110
Ala Ser Tyr Tyr Asn Met Lys Ala Tyr Ser Asp Asn Gln Cys Val Ile
115 120 125
Ile Ser Gly Glu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Glu Ala Ala Lys Arg Ile
130 135 140
Met Gln Tyr Ile Ala Ser Val Ser Gly Gly Glu Ser Gly Asp Ile Lys
145 150 155 160
Gln Ile Lys Asp Met Val Leu Ala Thr Asn Pro Leu Leu Glu Ser Phe
165 170 175
Gly Asn Ala Lys Thr Leu Arg Asn Asn Asn Ser Ser Arg Phe Gly Lys
180 185 190
Tyr Leu Gln Ile Tyr Phe Asn Thr Gln Gly Glu Pro Val Gly Ala Asp
195 200 205
Ile Thr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Val Val Gly Gln Ile Thr
210 215 220
Asn Glu Arg Asn Phe His Ile Phe Tyr Gln Phe Ala Lys Gly Ala Ser
225 230 235 240
Gln Gln Tyr Arg Glu Thr Phe Gly Val Gln Lys Pro Glu Thr Tyr Val
245 250 255
Tyr Thr Ser Arg Ser Lys Cys Leu Asp Val Asp Gly Ile Asp Asp Leu
260 265 270
Ala Glu Phe Glu Asp Thr Leu Asn Ala Met Lys Val Ile Gly Leu Ser
275 280 285
Gln Pro Glu Gln Asp Gln Ile Phe Arg Met Leu Ser Ala Ile Leu Trp
290 295 300
Ile Gly Asn Ile Gln Phe Gln Glu Asp Gln Gly Gly Tyr Ala Glu Val
305 310 315 320
Thr Asp Arg Ser Val Val Asp Phe Ala Ala Tyr Leu Met Glu Val Thr
325 330 335
Pro Asp Gln Leu Ile Lys Gly Ile Thr Ile Arg Ile Leu Thr Pro Arg
340 345 350
Asn Gly Glu Val Ile Glu Ser Pro Ala Asn Pro Ala Gln Ala Gln Ala
355 360 365
Thr Arg Asp Ala Leu Ala Met Ala Ile Tyr Ser Asn Leu Phe Asp Trp
370 375 380
Ile Val Glu Arg Ile Asn Lys Ser Leu Lys Ala Arg Gln Pro Thr Thr
385 390 395 400
Asn Thr Ile Gly Ile Leu Asp Ile Tyr Gly Phe Glu Ile Phe Glu Lys
405 410 415
Asn Ser Phe Glu Gln Leu Cys Ile Asn Tyr Val Asn Glu Lys Leu Gln
420 425 430
Gln Ile Phe Ile Gln Leu Thr Leu Lys Ala Glu Gln Glu Glu Tyr Ala
435 440 445
Arg Glu Gln Ile Gln Trp Thr Pro Ile Lys Tyr Phe Asp Asn Lys Val
450 455 460
Val Cys Asp Leu Ile Glu Gln Ile Arg Pro Val Gly Ile Phe Ser Ala
465 470 475 480
Met Lys Asp Ala Thr Lys Thr Ala His Ala Asp Pro Ala Ala Cys Asp
485 490 495
Arg Thr Phe Met Gln Ser Ile Asn Gly Met Ser His Ala His Leu Thr
500 505 510
Pro Arg Gln Gly Asn Phe Ile Ile Lys His Tyr Ala Gly Asp Val Thr
515 520 525
Tyr Thr Val Glu Gly Ile Thr Asp Lys Asn Lys Asp Gln Leu Leu Lys
530 535 540
Gly Leu Leu Ala Leu Phe Gln His Ser Gly Asn Asp Phe Val His Thr
545 550 555 560
Leu Phe Pro Arg Pro Val Asp Thr Asp Asn Arg Lys Gln Pro Pro Ser
565 570 575
Ala Gly Asp Arg Ile Arg Ala Ser Ala Asn Ala Leu Val Asp Thr Leu
580 585 590
Met Lys Cys Gln Pro Ser Tyr Ile Arg Thr Ile Lys Pro Asn Glu Asn
595 600 605
Lys Ser Pro Thr Glu Tyr Asn Gly Pro Asn Val Leu His Gln Ile Lys
610 615 620
Tyr Leu Gly Leu Gln Glu Asn Val Arg Ile Arg Arg Ala Gly Phe Ala
625 630 635 640
Tyr Arg Gln Asp Phe Asp Lys Phe Val Asp Arg Phe Phe Leu Leu Ser
645 650 655
Pro Ala Thr Ser Tyr Ala Gly Glu Phe Thr Trp Glu Gly Thr Thr Glu
660 665 670
Ala Ala Val Lys Gln Ile Leu Lys Asp Thr Ser Ile Pro Lys Glu Glu
675 680 685
Trp Gln Met Gly Val Thr Lys Ala Phe Ile Lys Ala Pro Glu Thr Leu
690 695 700
Phe Ala Leu Glu His Met Arg Asp Arg Tyr Trp His Asn Met Ala Thr
705 710 715 720
Arg Ile Gln Arg Met Trp Arg Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Ala Glu Ser
725 730 735
Ala Thr Arg Ile Gln Arg Leu Trp Arg Lys Lys Arg Thr Gly Ala Glu
740 745 750
Phe Leu Gln Leu Arg Asp Gln Gly His Gln Val Leu Gly Gly Arg Lys
755 760 765
Glu Arg Arg Arg Met Ser Leu Leu Gly Ser Arg Arg Phe Leu Gly Asp
770 775 780
Tyr Met Gly Val Asn Ala Ser Thr Gly Pro Gly Ala Gln Ile Arg Asn
785 790 795 800
Ala Ala Gly Ile Gly Ser Asn Glu Lys Val Val Phe Ser Cys Arg Gly
805 810 815
Glu Ile Leu Glu Ala Lys Phe Gly Arg Ser Ser Lys Ala Ser Pro Arg
820 825 830
Ile Ile Val Val Ser Asn Ser Lys Phe Tyr Ile Ile Ala Gln Met Leu
835 840 845
Val Asn Gly Gln Pro Gln Ile Thr Val Glu Lys Ser Val Pro Leu Gly
850 855 860
Ala Ile Lys Phe Ile Gly Val Ser Ser Ala Arg Asp Asp Trp Phe Ser
865 870 875 880
Leu Gly Ile Gly Ser Pro Gln Glu Ala Asp Pro Leu Met Asn Cys Ile
885 890 895
Phe Lys Thr Glu Met Phe Thr Gln Met Gln Arg Val Met Pro Gly Gly
900 905 910
Phe Asn Leu Lys Ile Ala Glu Thr Ile Glu Tyr Ala Lys Lys Pro Gly
915 920 925
Lys Leu Gln Gln Val Lys Val Leu Lys Asp Ser Gln Val Pro Ala Asp
930 935 940
Tyr Tyr Lys Ser Gly Ala Val His Cys Gln Pro Gly Glu Pro Pro Ser
945 950 955 960
Ser Val Ser Lys Pro Thr Pro Lys Gly Lys Pro Val Pro Pro Arg Pro
965 970 975
Ile Thr Arg Gly Lys Leu Ile Lys Pro Gly Gly Pro Asn Gly Arg Pro
980 985 990
Ser Arg Ile Gln Gly Asn Arg Ala Ala Lys Pro Arg Pro Gly Gly Gly
995 1000 1005
Ala Arg Ala Val Pro Gln Pro Pro Val Ala Val Ser Ala Ala Ala Ser
1010 1015 1020
Ile Pro Ala Ala Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Thr His Asn Ala Leu
1025 1030 1035 1040
Pro Ser His Ala Lys Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Ala Pro Pro Pro
1045 1050 1055
Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ala Arg Pro Pro Ser Pro Pro Arg Val
1060 1065 1070
Met Ala Lys Val Leu Tyr Asp Phe Ala Gly Gln Arg Glu Asn Glu Leu
1075 1080 1085
Ser Ile Ala Ala Gly Glu Ile Val Glu Ile Val Gln Lys Glu Ser Asn
1090 1095 1100
Gly Trp Trp Leu Ala Lys Asn Pro Gln Thr Ala Gln Gln Ala Trp Val
1105 1110 1115 1120
Pro Ala Ala Tyr Val Glu Glu Gln Ala Pro Pro Ala Pro Arg Ala Pro
1125 1130 1135
Pro Ala Pro Pro Arg Ser Lys Pro Thr Pro Pro Ala Pro Pro Ala Lys
1140 1145 1150
Arg Pro Ala Ala Gly Arg Lys Pro Ala Glu Leu Gln Gln Arg Asp Ser
1155 1160 1165
Gly Met Ser Leu Asn Thr Pro Asn Gly Ser Asp Ser Arg Ser Ser Thr
1170 1175 1180
Pro Thr Pro Ser Leu Gly Gly Ser Leu Ala Asp Ala Leu Leu Ala Arg
1185 1190 1195 1200
Lys Asn Ala Met Gln Lys Glu Lys Glu Asp Asp Asp Asp Trp
1205 1210
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatataggat ccatgggaat atcgagacgc ccg 33
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatatagcgg ccgcttaaga ttcggctcgg taggcaag 38
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgcggtagg agaagatg 18
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agccagccaa cagctcccaa gggaaactct ggaagc 36
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggagctgtt ggctggctgg tgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggggagaggc ggtttgcgta ttg 23
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tacgcaaacc gcctctcccc ttcctccgtg ccgtgata 38
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggttgctgta gatggccttt gcaagggcat cccgag 36
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcgggatgc ccttgcaaag gccatctaca gcaacc 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcggctggga cttgtgaa 18

Claims (1)

1.利用肌球蛋白-5的真菌药敏性靶点进行高通量筛选抗真菌药物中的应用，其特征在于，所述真菌为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），所述肌球蛋白-5来源于禾谷镰刀菌，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述靶点为肌球蛋白-5的马达结构域内M375、Y409、F419和C423中的任意一个。
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myosin-5 [Fusarium graminearum PH-1]，Sequence ID: XP_011317208.1;NCBI;《NCBI》;20070907;第1-2页 *
NCBI.myosin-5 [Fusarium graminearum PH-1]，Sequence ID: XP_011317208.1.《NCBI》.2007,第1-2页. *
镰刀菌对氰烯菌酯的抗药性机制及响应调控机制的研究;郑志天;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20190715;第81-109页 *

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