CN111094582A - 预测非小细胞肺癌患者对药物的反应的方法 - Google Patents

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CN111094582A CN201880051867.6A CN201880051867A CN111094582A CN 111094582 A CN111094582 A CN 111094582A CN 201880051867 A CN201880051867 A CN 201880051867A CN 111094582 A CN111094582 A CN 111094582A
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Abstract

本发明涉及一种用于确定或预测诊断为非小细胞肺癌的患者对靶向药物治疗的反应的方法。本发明还旨在提供预测被诊断为非小细胞肺癌的患者对特定药物的反应的方法和装置。更具体地说，本发明提供了通过研究药物在所述患者的血液样本中引起的磷酸化水平和表达谱及其抑制来测定激酶活性的方法。

Description

预测非小细胞肺癌患者对药物的反应的方法
技术领域
本发明涉及用于确定或预测诊断为非小细胞肺癌的患者对特定药物的反应的方法和装置。更具体的说，本发明提供了通过研究所述患者的样本(优选血液样本)中的磷酸化水平和表达谱来测定激酶活性的方法。
背景技术
目前肺癌被认为是死亡的最重要原因之一，尤其是50～69岁的成年人。90％的肺癌是由长期吸烟导致的。男性吸烟者一生患肺癌的风险约为17％，女性吸烟者一生患肺癌的风险约为11％。对于不吸烟者，患肺癌的风险约为1％。非吸烟者患肺癌的主要原因是遗传因素、氡气、石棉、空气污染和被动吸烟。肺癌主要有两种类型：非小细胞肺癌(NSCLC)(约占80％)和小细胞肺癌(约占17％)。NSCLC可根据癌细胞的生长类型和扩散程度进一步分类。因此，NSCLC可分为鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌。腺癌在女性、亚洲人和不吸烟者中更为常见。其他不太常见的非小细胞肺癌有多形性癌、类癌、涎腺癌和未分类癌。
通过进行肺组织活检来诊断非小细胞肺癌。根据初步的活检诊断，可以对附近的淋巴结进行活检，看看癌细胞是否已经扩散。NSCLC的分期是基于美国癌症联合委员会(AJCC)TNM系统。T代表肿瘤(它在肺内的生长程度以及其它因素)。根据肿瘤的大小将T类分为不同的级别(0到4)。N代表附近淋巴结中的扩散程度(癌症通常首先扩散到这些豆一样大的免疫系统细胞的聚集体中)。根据非小细胞肺癌细胞是否已经扩散到淋巴结或是否在连接淋巴结的淋巴管中发现，N类分为不同的级别(0到3)。M类是基于NSCLC是否已经转移(扩散)到远处的器官，也就是已经到达的器官。众所周知，大多数类型的肺癌预后不良。根据TNM标准，在美国，不同阶段和存活率如下：
IA期：5年生存率约为49％。
IB期：5年生存率约为45％。
IIA期：5年生存率约为30％。
IIB期：5年生存率约为30％。
IIIA期：5年生存率约为14％。
IIIB期：5年生存率约为5％。
IV期：5年生存率约1％-2％
非小细胞肺癌的治疗方案是根据疾病的阶段而定的，可能包括：手术、化疗、靶向治疗、免疫治疗和放射治疗。早期非小细胞肺癌通常可以单独手术治愈，但更晚期的非小细胞肺癌可能很难治疗，因为标准的癌症治疗，如化疗，不是很有效。但近年来，新型的免疫治疗和靶向治疗改变了对该病的治疗状况，许多新的治疗方法在治疗晚期NSCLC方面显示出巨大的希望。
分子靶向治疗(如小分子和单克隆抗体)的发展显著改善了非小细胞肺癌患者的转移情况，这些患者的肿瘤含有活化癌基因，如表皮生长因子受体(EGFR)和易位基因，如间变性淋巴瘤激酶(ALK)。此外，免疫检查点抑制剂已成功用于非小细胞肺癌的治疗。这种疗法基于T淋巴细胞对抗肿瘤免疫至关重要的事实，这种抗肿瘤免疫需要在共刺激激活的情况下通过抗原特异性T细胞受体激活。过量的免疫激活被一种自然发生的反馈机制所阻止，这种反馈机制导致负性共刺激分子的表达(“检查点”)。这种检查点如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序死亡1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白3和淋巴细胞激活基因3。针对这些检查点的抗体可恢复或增强晚期或转移性NSCLC患者的抗肿瘤免疫反应，并产生肿瘤反应。这种抗体如纳武单抗(Nivolumab)(PD-1抑制剂)、阿特珠单抗(PD-L1抑制剂)、阿维鲁单抗(PD-L1抑制剂)和派姆单抗(PD-1抑制剂)。
特别的，IV期非小细胞肺癌很难治愈，因为它们已经扩散到远处的淋巴结或身体的其他部位。肺部肿瘤通常可以通过手术切除或放射治疗，而不能切除的内脏转移可以通过放射治疗、免疫治疗、靶向治疗或化学治疗。检查点抑制剂可以单独使用，也可以联合使用。不过，并不是所有的病人都对这些疗法有反应。约30％～50％的患者对检查点抑制剂治疗有反应。对于使用检查点阻滞剂的联合治疗，通常超过50％的患者表现出阳性反应。
不幸的是，大多数抗肿瘤治疗都伴随着不良的副作用，如严重的恶心、呕吐或严重的疲劳。此外，虽然抗肿瘤治疗已经成功，但它们并不能在所有接受抗肿瘤治疗的患者中产生显著的临床反应，这使他们遭受到不良的副作用、延误和与无效治疗相关的费用。因此，在给药前，非常需要生物标记物来预测受试者对抗肿瘤药物的反应。
鉴于NSCLC发病率高，目前治疗效果有限，需要一种免疫肿瘤疗法预测的NSCLC生物标记物和一种免疫肿瘤疗法预测的NSCLC生物标记物的检测方法。
此外，NSCLC生物标记物的检测，作为治疗反应的一种精确的早期指示物，通常需要进行肺组织活检，这对患者来说是非常不快。
鉴于上述情况，仍然迫切需要改进方法，以快速准确地预测被诊断为NSCLC的患者对靶向药物治疗的反应，特别是免疫肿瘤学的反应。
发明内容
个体间的药物反应不同。药物可以起到或多或少的作用，但也会引起药物不良反应、毒性和副作用。
本发明提供了使得能够通过测定来自被诊断为NSCLC的患者的样本的激酶活性来确定所述患者对靶向药物治疗的反应的方法和装置。
本发明还提供了一种用于预测诊断为非小细胞肺癌的患者对药物的反应的方法，包括以下步骤：
(a)通过将从所述诊断为非小细胞肺癌的患者获得的血液样本与至少一种蛋白激酶底物接触，测定所述样本的激酶活性，从而提供所述样本的磷酸化表达谱(phosphorylationprofile)，所述磷酸化表达谱包括表1所列的其中至少5个、优选至少8个或至少12个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平；以及，
(b)根据所述磷酸化表达谱确定所述患者对所述药物的反应。
在特定实施例中，所述血液样本包括外周血单个核细胞。
在特定实施例中，所述药物选自由纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Prembrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atozolizumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、吡地利单抗(Pidilizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)和德鲁单抗(Durvalumab)。
在特定实施例中，所述磷酸化表达谱包括表1中所列的其中至少10个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。
在特定实施例中，所述磷酸化表达谱包括表1所列肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。
在特定实施例中，步骤(b)被以下步骤(c)和步骤(d)取代：步骤(c)-从所述磷酸化表达谱计算分类器参数；及步骤(d)-基于所述分类器参数确定所述患者对所述药物的反应。
在特定实施例中，如果所述分类器参数高于第一预定阈值水平，则所述分类器参数指示所述患者是对所述药物的良好应答者；如果所述分类器参数低于第二预定阈值水平，则所述分类器参数指示所述患者是对所述药物的不良反应者。
在特定实施例中，将步骤(b)替换为以下步骤(e)和步骤(f)：(e)-将所述磷酸化表达谱与第一和第二参考磷酸化谱进行比较；所述第一参考磷酸化表达谱代表对所述药物的良好反应者，所述第二参考磷酸化表达谱代表对所述药物的不良反应者；以及，步骤(f)-基于所述磷酸化表达谱与所述第一和所述第二参考磷酸化表达谱的比较来确定所述患者对所述药物的反应。
在特定实施例中，所述磷酸化表达谱或所述分类器参数指示所述患者对所述药物的良好反应、不良反应或不确定反应。
在特定实施例中，所述非小细胞肺癌是IV期非小细胞肺癌。
在特定实施方案中，所述药物在所述患者中的毒性是由步骤(a)中的测定确定的。
另一方面提供如上所述方法在获取患有非小细胞肺癌的患者对药物的敏感性中的用途。
另一方面提供如上所述方法在评估药物的药学或临床价值中的用途。
另一方面提供了一种用于确定被诊断为非小细胞肺癌的患者对药物的反应的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个包括表1所列的其中至少5个肽标记物的阵列、以及计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质上记录有一个或多个用于执行所述方法的程序。
另一方面提供了一种计算机程序产品，用于与具有处理器和连接到处理器的存储器的计算机一起使用，所述计算机程序产品包括计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质具有编码在其上的计算机程序机制，其中，所述计算机程序机制被加载到所述计算机的存储器中，并使所述计算机执行如上所述的方法。这些和其他方面以及实施例在以下各部分和权利要求书中描述。
附图说明
图1显示了30例非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血单个核细胞(PBMC)样本中蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性的无监督(盲)分析，以及与患者对纳武单抗(Nivolumab)反应相关的激酶表达谱。层次聚类分析对具有部分应答(PR)的患者进行共同聚类。PR患者的差分信号(differentiating signals)尤其存在于LAT(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:14)和CBL(SEQ IDNO:15)磷酸化位点上。缩写：PR，部分应答；SD，病情稳定；CBL，E3泛素蛋白连接酶CBL；EPOR，促红细胞生成素受体；FGFR2/3，成纤维细胞生长因子受体2/3；JAK1，酪氨酸蛋白激酶JAK1；LAT，T细胞活化衔接因子家族成员1；PDGFRB：血小板衍生生长因子受体β；ZAP70，酪氨酸蛋白激酶ZAP-70。
图2显示了30例接受纳武单抗(Nivolumab)治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血单个核细胞(PBMC)预处理样本的蛋白酪氨酸激酶活性，以及与进展时间相关的激酶表达谱。磷酸化位点根据与无进展生存期(PFS)估计值的相关性进行分类，无进展生存期(PFS)为由无进展至发生进展的时间截止至250天。在长PFS估计值(>140天)中，差分信号尤其出现在前10个肽标记物上，由人工肽no.4(ART_004；SEQ ID NO:1)、erb-b2受体酪氨酸激酶4(ERBB4；SEQ ID NO:2)、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2,SEQ ID NO:3)、T细胞活化衔接因子(LAT,SEQ ID NO:4和14)、T细胞受体相关蛋白激酶70的ζ链(ZAP70；SEQ ID NO:5)、丝裂原活化蛋白激酶1(MK01；SEQ ID NO:6)、蛋白酪氨酸激酶2β(FAK2；SEQ ID NO:7)、Paxillin(PAXI；SEQ ID NO:8)和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1；SEQ ID NO:21)组成。
图3显示了纳武单抗(Nivolumab)治疗的有部分应答(PR)的非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血单个核细胞(PBMC)样本的激酶活性表达谱在主成分分析(PCA)(6个样本中的5个)中聚在一起。因此，本发明方法能够很好地预测纳武单抗(Nivolumab)治疗的患者的治疗结果。
图4显示了对发现在较早和较晚进展性患者之间有所区别的肽序列进行上游激酶分析的工作流程。这项分析报道了TAM受体激酶。这个免疫受体家族包括激酶MERTK、TYRO3和AXL。表1列出了报告这些异常TAM激酶活性的5个最重要的肽序列，包括ZAP70(SEQ IDNO:5)、DYR1A(SEQ ID NO:11)、FGFR3(SEQ ID NO:13)、KSYK(SEQ ID NO:16)和PRRX2(SEQID NO:20)。
具体实施方式
在描述本发明中使用的方法和装置之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法、组件或装置，因为这些方法、组件和装置当然可以改变。还应理解，本文中使用的术语无意限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料，但是下面将描述优选方法和材料。
在本说明书和所附权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一”和“该”包括复数指代。
本发明中使用的术语“包括”与“包含”同义，是包含性的或开放式的，不排除其它、未列举出的构件、元件或方法步骤的存在。
术语“包括”还包括术语“由...组成”。
当提及诸如参数、量、暂时的持续时间等可测量值时，本文中使用的术语“约”意指包含指定值的±10％或更少、优选±5％或更少、更优选±1％或更少以及更优选±0.1％或更少的变化，此程度范围内的这种变化适合在本发明中执行。应当理解，修饰语“大约”或“约”所指的值本身也被具体地并且优选地公开。
由端点确定的数值范围包括包含在相应范围内的所有数字和分数、以及列举的端点。
本发明提供了能够通过测定从被诊断为NSCLC的患者获得的血样的激酶活性来确定所述被诊断为NSCLC的患者对靶向药物治疗的反应的方法和装置。本发明进一步说明了如何使用该方法和装置来预测被诊断为NSCLC的患者对特定药物的反应和/或耐受性，特别是反应。因此，本发明方法能够加入到目前用于选择NSCLC患者治疗方法的现有测定方法中。
本发明的方法可用于预测或评估对特定药物的原发性耐药性和继发性耐药性。原发性耐药是指非小细胞肺癌患者对特定药物从来都无反应的耐药。继发性耐药是指非小细胞癌患者首次对特定药物产生反应，但在数月或数年后出现耐药性的耐药。就本发明而言，如本文所使用，术语“激酶活性”或“蛋白激酶活性”是指在测定过程中通过一定量的激酶或蛋白激酶作用于底物生成反应产物。
蛋白激酶活性是指蛋白激酶的活性。蛋白激酶是将磷酸盐转移至蛋白质的所有酶的总称。大约百分之二的人类基因组包含蛋白质激酶形成的转录信息。目前已知的蛋白激酶约有518种。然而，由于人类基因组的3％到4％是形成蛋白质激酶的编码基因，因此在人体内可能有更多不同的激酶。
蛋白激酶是一种通过将磷酸基团共价偶联至其它蛋白质来修饰这些蛋白质的激酶。这个过程或活性也被称为磷酸化。因此，磷酸化可视为将磷酸基团添加到底物上的过程。磷酸化通常通过改变激酶活性、细胞定位或与其他蛋白质的结合而导致底物的功能改变。高达30％的蛋白质可被激酶活性所修饰，并且已知激酶可以调节大多数细胞途径，特别是那些参与信号转导、细胞内信号传递的途径。激酶的化学活性包括从ATP或GTP中除去磷酸基团，并将其共价连接到具有自由羟基的氨基酸上，如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸。大多数已知的激酶可同时作用于丝氨酸和苏氨酸，其他的可作用于酪氨酸，还有一些可作用于所有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。用本发明的方法监测的蛋白激酶活性优选地针对作用于丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸的蛋白激酶，优选地针对同时作用于丝氨酸和苏氨酸、作用于酪氨酸或同时作用于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的蛋白激酶，并且更优选地，本发明的方法针对作用于酪氨酸的蛋白激酶。
蛋白激酶根据其磷酸化分离序列上底物的能力进行区分。这些序列是通过对磷酸化位点周围的氨基酸进行测序来确定的，并且通常每个蛋白激酶对应的序列都是不同的。每个底物的识别序列对于每个激酶催化剂都是特异性的。
由于蛋白激酶对细胞有着深远的影响，因此，它们的活性受到高度调节。激酶通过例如磷酸化、与激活蛋白或抑制蛋白或小分子结合、或通过控制它们在细胞中相对于其底物的定位来激活或失活。活性失调是引起疾病的常见原因，特别是癌症，其中，激酶调节控制细胞生长、运动和死亡的许多方面。因此，在比较不同组织样本的激酶活性时，监测组织中的蛋白激酶活性具有重要意义，可以获得大量的信息。
如本发明所述，发明人惊奇地发现，根据对从诊断为非小细胞肺癌的患者获取的样本的激酶活性(优选蛋白激酶活性)的测定，可以预测和/或确定所述诊断为非小细胞肺癌的患者对靶向药物治疗的反应。本发明的方法使得能够提供关于靶向药物治疗的疗效的信息，更具体而言，提供对NSCLC患者的最适合治疗方案的早期确定。
激酶活性的测定是通过将来自诊断为NSCLC的患者的样本与一个或多个激酶底物(优选蛋白激酶底物)接触来进行的，从而产生一个或多个磷酸化表达谱。
本发明使用的所述蛋白激酶底物优选为肽、蛋白质或模拟肽。每类蛋白激酶底物，优选地包括，一个或多个可由样品中存在的蛋白激酶磷酸化的磷酸化位点。因此，将蛋白激酶底物暴露于包含蛋白激酶的样品中，可导致蛋白激酶底物的一个或多个磷酸化位点磷酸化。这种磷酸化活性可以使用本领域已知的技术来测定。因此，在测定方法过程中，样品中存在的激酶将磷酸化一个或多个蛋白激酶底物上的优选一个或多个磷酸化位点。发明人已经观察到对靶向药物治疗有不同反应的NSCLC肿瘤的激酶活性之间的本质差异。因此，发明人观察到，非小细胞肺癌患者样本中存在的激酶将不同程度地磷酸化蛋白激酶底物，这取决于对患者将要接受或正在接受的靶向药物治疗的反应。不同样本之间的磷酸化信号不同，导致磷酸化模式根据对靶向药物治疗的反应而不同。
就本发明而言，如本文所使用，术语“药物治疗”是指使用药物(也被称为药或药剂)，其中，所述药物治疗旨在用于疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或者预防。
因此，本发明提供了一种预测被诊断为非小细胞肺癌的患者对药物的反应的方法，包括以下步骤：
(a)通过将从所述被诊断为非小细胞肺癌的患者获取的样本与至少一种蛋白激酶底物接触，测定所述样本的激酶活性，从而提供所述样本的磷酸化表达谱，所述磷酸化表达谱包括表1所列的其中至少5个、优选至少8个或至少12个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平；以及，
(b)根据所述磷酸化表达谱确定所述患者对所述药物的反应。
显然，使用本发明所述的方法可以监测药物的效果。药物会影响样本中激酶的抑制程度、效力和/或选择性。更大的肽抑制作用是由于药物对样本中激酶的影响较大导致的，因此药物具有更低的选择性。同时，肽抑制的增强会导致更多的正常组织受到药物的影响，使药物的肿瘤组织特异性降低。
如本申请所述，非小细胞肺癌是肺癌的主要类型之一，约占所有肺癌的85％。NSCLC可进一步分为三个亚型，即鳞状细胞癌、大细胞癌和腺癌。腺癌是最常见的类型，始于气道内壁的黏液腺细胞；鳞状细胞癌发生在覆盖气道表面的扁平细胞中，生长在肺中央附近。大细胞癌在显微镜下显得又大又圆。其他不太常见的非小细胞肺癌有多形性癌、类癌、涎腺癌和未分类癌。
如在本发明中所使用的，术语“样本”是指从人体等生物体(病人)或从该生物体的组成部分(如，组织或细胞)获得的样本。血液被认为是结缔组织的一种特殊形式。因此，所述样本可以是血样。肺组织活检会使病人不快。因此，优选除NSCLC肿瘤组织样本外的其他样本。
在本发明中，所述样本优选从诊断为NSCLC的患者获得，并且优选源自所述患者的血液。更优选地，所述血样包括外周血单核细胞(PBMCs)。
所述样本优选为新鲜或新鲜冷冻样本。
更优选地，所述样本是指血液来源的PBMCs的裂解物，其优选通过Ficoll-Isopaque密度离心法或本领域已知的任何方法分离。
在本发明的优选实施例中，所述样本是在本发明的方法步骤实施前，经过制备步骤的样本。优选地，所述制备步骤是所述样本中的蛋白激酶通过裂解从组织中释放的步骤。另外，可以稳定、保持、富集或分离样本中的激酶，并且在步骤(a)中进行的激酶活性的测定可发生在富集或分离的蛋白激酶样本上。通过首先富集样本中的蛋白激酶或从样本中分离蛋白激酶，随后再进行激酶活性的测定将更高效、更可靠。此外，由于富集或分离步骤过程中去除了某些污染物，因此，获得的磷酸化信号的清晰度和强度也将增加。
在特定实施例中，所述样本是从诊断为NSCLC且对一线治疗(例如，铂基治疗方法)无反应的患者获得的。
在特定实施例中，所述样本是从诊断为NSCLC的开始二线疗法(例如，免疫检查点抑制剂，如纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、吡地利单抗(Pidilizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、德鲁单抗(Durvalumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atezolizumab)和/或其组合和/或其组合和/或其类似物，优选纳武单抗(Nivolumab))治疗之前的患者获得的。
如在本发明中使用的，术语“磷酸化表达谱”是指表示存在于蛋白激酶底物上的磷酸化位点(优选一个或多个)的磷酸化水平的数据集。当通过将样本与蛋白激酶底物接触来测定所述样本的激酶活性时，获得特定的磷酸化表达谱。磷酸化表达谱是通过样本中存在的蛋白激酶对蛋白激酶底物的磷酸化产生的，它包括所用蛋白激酶底物上存在的磷酸化位点的磷酸化水平。因此，当在不同的试验条件下使用至少一种蛋白激酶底物时(例如，通过比较在存在和不存在磷酸酶调节化合物或药物的情况下样本在一种肽或蛋白质(蛋白激酶底物)上的磷酸化)，可由此生成磷酸化表达谱。在同一个或相继进行的实验中，将使用多种蛋白激酶底物更频繁地测定样品的磷酸化表达谱。优选地，本发明测定酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸激酶活性水平或表达谱。
应当注意，本领域技术人员将理解，本发明的方法可以使用磷酸化表达谱作为确定和预测患有NSCLC的患者对药物的反应的基础。然而，单个蛋白激酶底物的磷酸化水平也可以用作确定或预测非小细胞肺癌患者对药物的耐药性的基础。
应注意，为了测定蛋白激酶活性，当样本与蛋白激酶底物接触时，需要向样本中添加ATP或任何其他磷酸盐源。ATP的存在将导致蛋白激酶底物磷酸化。或者，蛋白激酶底物的磷酸化可以在没有外源ATP添加的情况下进行。当样本与蛋白激酶底物孵育期间未添加ATP时，内源性ATP(即样本中天然存在的ATP)将作为ATP的主要来源。
可以使用本领域已知的任何方法来监测每个蛋白激酶底物的磷酸化水平。蛋白激酶底物的响应是使用可检测信号来确定的，所述可检测信号是由样本与蛋白激酶底物的相互作用产生的，或者，蛋白激酶底物的响应是例如通过使用质谱法测定质量差来确定的。在确定样本与蛋白激酶底物的相互作用时，信号是磷酸化底物与能够与磷酸化底物结合的分子相互作用的结果。这种结合可以通过表面等离子体共振或通过被标以可检测标记的分子来检测。对于后者，与目标底物(例如，抗体或多核苷酸探针)特异性结合的分子可以通过包含原子(例如，放射性核素)、分子(例如，荧光素)、或因物理或化学性质指示所述分子的存在的酶、颗粒或复合物来被标以可检测标记。当分子与作用于底物以产生可检测原子、分子或其他复合物的“报道”分子(例如，生物分子，如酶)共价结合或以其他方式与之相关联时，该分子也可以被标以可检测的标记。
适于在本发明中使用的可检测标记包括可通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电、光学或化学手段检测的任何组合物。可用于本发明的标记包括：用标记的亲和素或链霉亲和素结合物染色的生物素、磁珠(例如，Dynabeads)、荧光染料(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、德克萨斯红(Texas red)、罗丹明、绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白和其他荧光发射波长的相关蛋白、丽丝胺(lissamine)、藻红蛋白、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX[Amersham]、SYBRGreen I&II[分子探针]等)、放射性标记物(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，荧光素酶、水解酶(特别是碱性磷酸酶、酯酶和糖苷酶等磷酸酶)、或氧化还原酶(特别是辣根过氧化物酶等过氧化物酶))、底物、辅因子、化学发光基团、显色剂和比色标记物如胶体金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)、蛋白质颗粒或珠子。特别地，本领域技术人员熟知的所有可检测标记都可被用作本发明中使用的可检测标记。
本领域技术人员熟知检测这些标记的方法。因此，例如，可以使用照相胶片或闪烁计数器检测化学发光和放射性标记，并且可以使用光电探测器检测荧光标记以检测发射光(例如，如在荧光激活细胞分选术中那样)。酶标记通常通过向酶提供底物并检测酶在底物上的作用产生的有色反应产物来进行检测。比色标记可仅通过将彩色标记可视化来进行检测。因此，例如，在标记是放射性标记的情况下，检测装置包括闪烁计数器、如放射自显影中的摄影胶片、或存储磷光体成像装置。如果标记是荧光标记，可以通过用适当波长的光激发荧光物并检测产生的荧光来检测。荧光可以使用诸如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等电子探测器，通过照相胶片进行视觉检测。类似地，酶标记可以通过为酶提供适当的底物并检测所产生的反应产物来进行检测。此外，简单的比色标记可以通过观察与标记相关联的颜色来进行检测。荧光能量共振转移已适于检测未标记配体的结合，这可能对阵列有用。
在本发明的特定实施例中，蛋白激酶底物对样本的反应是使用被标以可检测标记的抗体来确定的；更具体地说，是荧光标记的抗体。在底物由蛋白激酶底物组成的本发明的那些实施例中，使用荧光标记的抗磷酸酪氨酸抗体、荧光标记的抗磷酸丝氨酸或荧光标记的抗磷酸苏氨酸抗体来确定蛋白激酶底物的响应。在本发明方法中，使用荧光标记的抗磷酸酪氨酸抗体或荧光标记的抗磷酸丝氨酸或荧光标记的抗磷酸苏氨酸抗体，可实现对蛋白激酶活性进行实时或半实时测定，并由此可将蛋白激酶活性表达为源自样本在底物上孵育一定时间后的活性的蛋白激酶的初始速度。
此外，所述样本的激酶活性的测定优选通过将所述样本与表1中所列的至少5个、优选至少8个或至少12个肽标记物接触来进行。
在本发明的另一实施例中，磷酸化表达谱包括表1中所列的至少10个或至少20个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。优选地，将研究表1所列肽标记物中至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。更优选地，将研究表1所列肽标记物中至少5个或至少8个或至少12个中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。在本发明的另一实施例中，磷酸化表达谱包括表1所列肽标记物中的磷酸化位点的磷酸化水平。
本发明上下文中的术语“肽标记物”是指表1中所列的肽可以优选地根据本发明的方法用于测定样本中所述标记物的磷酸化位点的磷酸化水平。所述标记物中存在的单个磷酸化位点的磷酸化水平可以用不同的方式测定和比较。因此，本发明不限于使用与表1所列的任意肽标记物相同的肽。本领域技术人员可以容易地基于表1中所列的肽标记物设计出与所述表中的特定肽相对应的变体肽，并且在测定与表1中所列的所述肽标记物共有的磷酸化位点的磷酸化水平的方法中使用所述变体肽。这些变体肽可比给定肽多或少一个或多个(2、3、4、5、6、7等)氨基酸，并且也可以有氨基酸置换(优选保守性氨基酸置换)，只要这些变体肽保留如所述表中所列的所述原始肽的至少一个或多个磷酸化位点。此外，本领域技术人员还可以通过使用包含表1所列“肽标记物”的氨基酸区域的蛋白质(全长或N-或C-末端截短)作为用于研究表1所列肽的氨基酸区域中存在的位点的磷酸化的来源，来容易地实施本发明的方法。本领域技术人员也可以使用模拟肽。
本文所述方法中使用的蛋白激酶底物意指包括肽、蛋白质或模拟肽，优选地包括表1中肽标记物的磷酸化位点中的一个或多个。所述一个或多个磷酸化位点由样本中存在的蛋白激酶特异性磷酸化，从而提供磷酸化表达谱。更优选地，本发明方法中使用的蛋白激酶底物(肽、蛋白质或模拟肽)包括表1中所列出的至少5、至少10或至少20个肽标记物。更具体地说，所述蛋白激酶底物代表表1所列肽标记物中至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个中存在的一个或多个磷酸化位点。优选地，所述蛋白激酶底物代表表1所列肽标记物中至少5个或至少8个或至少12个中存在的一个或多个磷酸化位点。在更优选的实施例中，蛋白激酶底物包括表1所列所有肽标记物中存在的优选一个或多个磷酸化位点，或由表1所列所有肽标记物中存在的优选一个或多个磷酸化位点组成。
本领域技术人员将理解，当表1所列的肽标记物的数量增加时，将增加本发明所述方法的特异性、准确性和灵敏度。当使用包含表1所列所有肽标记物的磷酸化位点的所有蛋白激酶底物时，将获得最高的方法准确度。发明人发现，尤其是表1所列出的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22的肽标记物，优选SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19，更优选SEQ ID NO:为3、4、5、10、11、13、14、15、16、17、18和20或SEQ ID NO:1、2、3、4，5、6、7、8、9、10、11和12，甚至更优选SEQ ID NO:4、5、11、13、14、15、16和20或SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7和8，甚至更优选SEQ IDNO:5、11、13、16和20，甚至更优选SEQ ID NO:4、14、15和16，甚至更优选SEQ ID NO:4、14和15，使得能够预测非小细胞肺癌患者的药物治疗反应，特别是使用纳武单抗(Nivolumab)治疗的患者的药物治疗反应。
在某些实施例中，特别是具有表1中所列SEQ ID NO 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22所示序列的肽标记物，使得能够预测NSCLC患者的药物治疗反应，特别是使用纳武单抗(Nivolumab)治疗的患者的药物治疗反应。
在某些实施例中，尤其是具有表1中所列SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19所示序列的肽标记物使得能够预测NSCLC患者的药物治疗反应，特别是使用纳武单抗(Nivolumab)治疗的患者的药物治疗反应。
在某些实施例中，尤其是具有表1中所列SEQ ID NO:3、4、5、10、13、14、15、17、18和19所示序列的肽标记物使得能够预测非小细胞肺癌患者的药物治疗反应，特别是使用纳武单抗(Nivolumab)治疗的患者的药物治疗反应。
在某些实施例中，尤其是表1中所列具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21和22所示序列的肽标记物能够预测非小细胞肺癌患者，特别是使用Nivolumab治疗的患者的药物治疗反应。
在某些实施例中，尤其是具有表1中所列SEQ ID NO:3、4、5、10、13、14、15、17和18所示序列的肽标记物使得能够预测非小细胞肺癌患者的药物治疗反应，特别是使用纳武单抗(Nivolumab)治疗的患者的药物治疗反应。
表1所列的肽标记物可作为受试哺乳动物治疗反应的准确早期指标，以测定候选NSCLC抑制剂的有效性。
在特定实施例中，包括表1中所列出的其中至少5个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平的磷酸化表达谱是指所述磷酸化表达谱包括具有SEQ ID NO:5、11、13、16和20所示的5个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平，以及，任选地，表1所列的其中一个或多个不同于SEQ ID NO:5、11、13、16和20所示的肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。
在特定实施例中，包括表1中所列出的其中至少8个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平的磷酸化表达谱是指所述磷酸化表达谱包括具有SEQ ID NO:4、5、11、13、14，15、16和20或SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7和8所示的8个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平，以及，任选地，表1所列的其中一个或多个不同于SEQ ID NO:4、5、11、13、14、15、16和20或SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7和8所示的肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。
在特定实施例中，包括表1中所列出的其中至少12个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平的磷酸化表达谱是指所述磷酸化表达谱包括具有SEQ ID NO:3、4、5、10、11、13、14、15、16、17、18和20所示的或具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12所示的12个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平，以及，任选地，表1所列的其中一个或多个分别不同于SEQ ID NO:3、4、5、10、11、13、14、15、16、17、18和20或SEQ ID NO:1、2、3、4、56、7、8、9、10、11和12所示的肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。
表1：22个包括用于确定激酶活性的磷酸化位点的肽标记物的列表、它们的序列和SEQ ID NO。肽标记物的名称是指相关蛋白质和氨基酸序列的起始和结束位置。
SEQ ID NO 名称 序列 参考
1 ART_004_EAIYAAPFAKKKXC EAIYAAPFAKKK 图2
2 ERBB4_1277_1289 IVAENPEYLSEFS 图2
3 FGFR2_762_774 TLTTNEEYLDLSQ 图1,2
4 LAT_194_206 MESIDDYVNVPES 图1,2
5 ZAP70_485_497 ALGADDSYYTARS 图1,2,4
6 MK01_180_192 HTGFLTEYVATRW 图2
7 FAK2_572_584 RYIEDEDYYKASV 图2
8 PAXI_24_36 FLSEETPYSYPTG 图2
9 TNNT1_2_14 SDTEEQEYEEEQP 图2
10 ANXA1_14_26 IENEEQEYVQTVK 图1,2
11 DYR1A_212_224 KHDTEMKYYIVHL 图2,4
12 41_654_666 LDGENIYIRHSNL 图2
13 FGFR3_753_765 TVTSTDEYLDLSA 图1,2,4
14 LAT_249_261 EEGAPDYENLQEL 图1,2
15 CBL_693_705 EGEEDTEYMTPSS 图1,2
16 KSYK_518_530 ALRADENYYKAQT 图2,4
17 PGFRB_1014_1028 PNEGDNDYIIPLPDP 图1,2
18 EPOR_361_373 SEHAQDTYLVLDK 图1,2
19 JAK1_1015_1027 AIETDKEYYTVKD 图1
20 PRRX2_202_214 WTASSPYSTVPPY 图2,4
21 PDPK1_369_381 DEDCYGNYDNLLS 图2
22 EPHA1_774_786 LDDFDGTYETQGG 图2
还应注意，根据本发明的优选实施例，表1中所列的肽标记物本身可用于实施本发明的方法。然而，本发明还包括在本发明方法中使用的这些肽标记物的类似物和组合物的使用。肽标记物类似物包括序列一致性大于70％的肽标记物，优选大于80％，更优选大于90％。
在又一实施例中，本发明涉及一种用于预测诊断为NSCLC癌的患者对药物的反应的方法，包括以下步骤：
(a)通过将从所述诊断为NSCLC的患者获得的血样与至少一种蛋白激酶底物接触，测定所述样本的激酶活性，从而提供所述样本的磷酸化表达谱，所述磷酸化表达谱包括表1中所列的其中至少5个、优选至少8个或至少12个肽标记物上存在的磷酸化位点的磷酸化水平；以及，
(c)根据所述磷酸化表达谱计算分类器参数(classifierparameter)；以及
(d)根据所述分类器参数确定所述患者对所述药物的反应。
通过建立用于确定非小细胞肺癌患者药物治疗反应预测的分类器参数，本发明提供了用于分析由本发明方法获得的结果的标准。这一标准使一个人能够根据单个或有限数量的数据提供预测或预后。提供预测或预后的人不必解释一整套数据，而是可以根据单个或有限数量的标准得出结论。
本发明使用的术语“分类器参数”是通过建立从患有NSCLC的患者获得的样本的磷酸化表达谱而确定的判别值。该判别值能够确定非小细胞肺癌患者对药物治疗反应的预测。分类器参数包括关于若干种蛋白激酶底物的磷酸化水平的信息。分类是这样一种程序，其根据项目固有的一个或多个特征的定量信息(例如，样本的磷酸化水平或表达谱)和预先标记项目的训练集(药物治疗的临床反应)，将各个项目分成组。分类器参数是通过将“分类器”应用于测得的样品的磷酸化水平来计算得到的。根据这些分类的参数，样本被分配(或预测属于)一个类别(预测所述患者的药物治疗反应)。分类器预先是通过比较已知属于不同相关类别的样本来确定的。例如，分类器可以是数学函数，其使用关于多种蛋白激酶底物的磷酸化水平的信息，其中单个蛋白激酶底物可以基于测得的多个蛋白激酶底物的磷酸化水平(或由此导出的值)进行统计加权。本领域已知开发分类器的几种方法，包括神经网络(多层感知器)、支持向量机、k近邻、高斯混合模型、朴素贝叶斯、决策树、RBF分类器、随机森林、判别分析、线性判别分析、二次判别分析、判别分析-主成分分析、偏最小二乘判别分析、广义距离回归和弹性网络分类。以这种方式确定的分类器参数在将来的单独测试中对相同的实验设置有效。
为分类器参数给予精确的阈值是没有意义的。通过针对任意阈值关联灵敏度和特异性和灵敏度/特异性，可以获得相关的阈值。导致高灵敏度的阈值会导致低特异性，反之亦然。如果有人想增加测试的阳性预测值以确定非小细胞肺癌患者是否会对靶向药物治疗有反应，那么可以改变测试阈值，从而将降低测试的阴性预测值，以确定NSCLC患者是否不会对靶向药物治疗有反应。如果有人想增加测试的阴性预测值以确定非小细胞肺癌患者是否不会对靶向药物治疗有反应，则阈值可以朝相反的方向改变，从而将降低测试的阳性预测值，以确定NSCLC患者是否会对靶向药物治疗有反应。
因此，由诊断工程师来确定所需的阳性预测值/阴性预测值/敏感性/特异性的水平，以及阳性或阴性预测值减少多少是可以接受的。选择的阈值水平可能取决于诊断工程师结合本方法使用的其他诊断参数。
在又一实施例中，本发明涉及本发明的方法，其中，如果所述分类器参数高于第一预定阈值水平，所述分类器参数预测所述患者对所述药物有反应；如果所述分类器参数低于第二预定阈值水平，则所述分类器参数指示所述患者对所述药物无反应。
根据另一实施例，本发明涉及的本发明的方法中，所述不同的磷酸化水平或所述分类器参数指示所述患者对所述药物或靶向药物治疗的效果有反应、无反应或未确定或中间预测。
如本申请中所使用的，NSCLC患者靶向药物治疗反应的预测结果大体上分为两类：无应答者和应答者，以及一些未确定或中间应答者。靶向药物治疗的应答者将因治疗而存活更长时间或具有其它临床获益(例如，生活质量提高、无进展生存期延长等)，而无应答者或对靶向药物治疗产生耐药性的患者将不会从靶向药物治疗中获益。本发明的方法特别使得能够将对靶向药物治疗的应答者(例如，完全应答(CR)、部分应答(PR)、病情稳定(SD))和无应答者(例如，进行性疾病(PD))之间、或接受靶向药物治疗后疾病进展早(如开始治疗后<140天)和晚(如开始治疗后>140天)的患者之间进行区分。
本发明方法中使用的药物可以是任何种类的化学物质，例如，用于治疗、治愈、预防或诊断疾病或用于以其他方式增强身体或精神健康的化学物质。具体地说，所述药物可以是免疫治疗抗体，更优选为针对免疫检查点的免疫治疗抗体，甚至更优选针对CTLA-4、PD-1或PD-L1的免疫治疗抗体。
如本文所使用的，术语“免疫治疗抗体”是指与特定细胞或蛋白质(优选细胞表面蛋白)结合，由此刺激免疫系统攻击这些细胞的抗体类型，优选单克隆抗体。免疫治疗抗体用于疾病的治疗、治愈、预防或诊断，或用于增强身体或精神健康。
如本文所使用的，术语“免疫检查点”是指根植于免疫系统中的抑制通路，其对于维持自身耐受和调节外周组织中生理免疫应答的持续时间和幅度以最小化附带组织损伤至关重要。肿瘤可以指定一个或多个免疫检查点通路作为免疫耐受的主要机制，特别是针对肿瘤抗原特异性T细胞。抗体可以阻断免疫检查点。这种免疫检查点的例子有CTLA-4、PD-1和PD-L1。
更优选地，本发明涉及本发明的方法，在该方法中，所述药物为纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、吡地利单抗(Pidilizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、德鲁单抗(Durvalumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atezolizumab)和/或其组合和/或其类似物。优选地，所述药物为纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atezolizumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、吡地利单抗(Pidilizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)或德鲁单抗(Durvalumab)。更优选的是，所述药物为纳武单抗(Nivolumab)。
另一实施例中，本发明带有磷酸化位点的激酶底物被定位或固定在固体载体上，所述固体载体优选为多孔固体载体。优选地，所述固定的带有磷酸化位点的激酶底物将是固定的蛋白质、肽或模拟肽。更优选地，肽固定在固体载体上。
如本发明所使用的“肽”是指短的截短型蛋白质，其通常由2到100个、优选2到30个、更优选5到30个、甚至更优选13到18个天然存在的或合成的氨基酸组成，这些氨基酸也可以经进一步修饰，包括通过除去水分子使第一氨基酸的α-羧基的肽键与第二氨基酸的α-氨基共价连接。所述氨基酸可以是那些天然存在的氨基酸，也可以是这些氨基酸的化学合成变体或这些氨基酸的修饰形式，这些氨基酸可以通过添加其他化学基团而改变其基本化学结构，这些化学基团可以在天然存在的化合物中共价连接在这些氨基酸上。
如本文所使用的“蛋白质”是指由排列成线性链并通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键连接在一起的氨基酸组成的多肽。
如本发明所使用的“模拟肽”是指在结构上类似于肽并类似于表1中所列肽序列的有机化合物。模拟肽通常是基于现有肽来设计以改变其分子特性。改进的特性可以包括例如提高的稳定性(如抗酶降解性)或增强的生物活性、通过限制优选构象实现的提高的亲和力、及易于合成性。模拟肽相较于肽的结构修饰可以涉及骨架修饰和侧链修饰。
为了测定样本的激酶活性，本领域已知有多种方法和方式。例如，激酶活性可使用ELISA和多重ELISA技术(multiplex ELISAtechniques)、印迹法、质谱法、表面等离子体共振、毛细管电泳、微球阵列(bead arrays)、宏阵列(macroarrays)、微阵列(microarrays)或本领域已知的任何其他方法来测定。根据激酶活性测定方法的类型，固定蛋白质、肽或模拟肽用的固体载体可能不同。在ELISA中，蛋白激酶底物附着在微量滴定板的表面上；而在微阵列中，蛋白激酶底物固定在微阵列基底上和/或微阵列基底中。或者，直接在微阵列基底上原位合成底物。
在本发明的优选实施例中，蛋白质激酶a底物固定在阵列上，优选蛋白激酶底物微阵列，其中蛋白激酶底物固定在固体载体或另一载体上。固定可以是两个或两个以上蛋白激酶底物分子与载体表面附着或粘附，在例如所述载体是多孔或流通式固体载体的情况下其包括附着或粘附在所述载体的内表面上。
在本发明的优选实施例中，蛋白激酶底物阵列是流通式阵列。如本发明所使用的流通式阵列可以由本领域中通常已知的、具有定向贯穿通道的任何载体材料制成，例如在PCT专利申请公开号为WO 01/19517的专利申请中描述的载体材料。典型地，所述载体由金属氧化物、玻璃、氧化硅或纤维素制成。在特定的实施例中，载体材料由选自由氧化锌、氧化锆、氧化锡、氧化铝、氧化钛和铊组成的群组中的金属氧化物制成；在更具体的实施方案中，金属氧化物由氧化铝组成。
因此，在本发明的另一实施例中，所述阵列是
Figure BDA0002381446380000161
在另一实施例中，本发明涉及的本发明的方法中，所述固体载体(微阵列)包括固定在其上的至少5个、至少10个、至少20个表1中所列的肽标记物。
在另一实施例中，本发明涉及的本发明的方法中，所述固体载体(微阵列)包括固定在其上的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个表1中所列的肽标记物。优选地，本发明涉及的本发明的方法中，所述固体载体(微阵列)包括固定在其上的至少5个或至少8个或至少12个表1中所列的肽标记物。
在另一实施例中，本发明涉及的本发明的方法中，所述固体载体(微阵列)包括固定在其上的表1所列的每个肽。
在另一实施例中，本发明涉及的本发明的方法中，所述NSCLC是腺癌或鳞状细胞癌。
在另一实施例中，本发明涉及的本发明的方法中，所述NSCLC是IV期的NSCLC。
在另一实施例中，本发明涉及的本发明的方法中，所述非小细胞肺癌是IV期的腺癌或鳞状细胞癌。
磷酸化水平也可以根据本发明进行测定，而无需生成其磷酸化表达谱。同样，对于本实施例，要使用的肽、蛋白质或模拟肽的量和类型如上所述。
本发明的另一实施例涉及本发明的方法在评估患有非小细胞肺癌的患者对药物的敏感性中的用途。
本发明的另一实施例涉及本发明的方法在评估药物的药物价值中的用途。
本发明的另一实施例涉及本发明的方法在评估药物的临床价值中的用途。
如本文中所使用的，在评估对药物的敏感性、药物的药物价值或药物的临床价值时，包括评估受试者或患者对所述药物的耐药性。在另一实施例中，本发明还涉及一种计算机程序产品，用于与具有处理器和与所述处理器连接的存储器的计算机一起使用，所述计算机程序产品包括计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质上编码有计算机程序机制，其中，所述计算机程序机制可加载到所述计算机的存储器中，使所述计算机执行根据本发明的方法。
本发明还涉及一种计算机系统，该计算机系统包括处理器和耦合到所述处理器并对一个或多个程序进行编码的存储器，其中，所述一个或多个程序指示所述处理器执行本发明的方法。
在另一实施例中，本发明还涉及用于确定被诊断为非小细胞肺癌的患者对药物的反应的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个阵列，所述阵列包括表1中所列的其中至少5个、优选至少10个、更优选至少20个肽标记物，以及计算机可读存储介质，其上记录了一个或多个用于执行本发明方法的程序。在特定实施例中，所述至少一个阵列包括表1中所列的肽标记物中的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个。优选地，所述至少一个阵列包括表1中所列的肽标记物中的至少5个或至少8个或至少12个。
在又一实施例中，本发明还涉及表1中所列的其中至少5种、优选至少10种、更优选至少20种肽标记物在预测诊断为NSCLC癌的患者对药物的反应中的用途。
在特定实施例中，本发明涉及表1所列的其中至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个肽标记物在预测诊断为NSCLC癌的患者对药物的反应中的用途。优选地，本发明涉及表1中所列的其中至少5个或至少8个或至少12个肽标记物在预测被诊断为NSCLC癌症的患者对药物的反应中的用途。在特定实施例中，本发明涉及表1中所列的肽标记物在预测被诊断为NSCLC的患者对药物的反应中的用途。
由于本申请发明人已经确定了一组出奇地有用的肽标记物，用于确定非小细胞肺癌患者对靶向药物治疗的反应的预测方法中，因此本领域技术人员可以执行上文所限定的任意方法，在该方法中，本领域技术人员测定表1中任意肽标记物的激酶活性。此外，该方法可使用如上文所限定的肽、蛋白质或蛋白质模拟物的量和类型来实施。执行这些方法的形式也与上述方法相同。
此外，发明人还惊奇地发现TAM家族受体酪氨酸激酶(RTKs)(包括MER原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)、TYRO3蛋白酪氨酸激酶(TYRO3)和/或AXL受体酪氨酸激酶(AXL))的异常活性可用作预测癌症患者对药物的反应的“通用标记物”，并且优选地通过建立磷酸化表达谱来确定TAM家族RTKs的异常活性，该磷酸化表达谱包括表1中所列的至少ZAP70(SEQ IDNO:5)、PRRX2(SEQ ID NO:20)和KSYK(SEQ ID NO:16)肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平，更优选表1所列的至少ZAP70(SEQ ID NO:5)、DYR1A(SEQ ID NO:11)、FGFR3(SEQ IDNO:13)、KSYK(SEQ ID NO:16)和PRRX2(SEQ ID NO:20)肽标记物。
此外，发明人通过上游激酶分析发现，受体酪氨酸激酶(RTKs)的TAM家族至少部分导致包括表1所列的其中至少5个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平的磷酸化表达谱，特别是表1所列的ZAP70(SEQ ID NO:5)、DYR1A(SEQ ID NO:11)、FGFR3(SEQ ID NO:13)、KSYK(SEQ ID NO:16)和/或PRRX2(SEQ ID NO:20)肽标记物，因此，受体酪氨酸激酶(RTKs)的TAM家族的异常活性可特别用于预测被诊断为NSCLC的患者对药剂的反应。
本发明所用的“受体酪氨酸激酶TAM家族”是指一个跨膜蛋白家族，即受体酪氨酸激酶，它们将信号从细胞外环境传递到细胞质和细胞核。RTKs的TAM家族与其他RTK家族的区别在于激酶结构域(胞质区)内的保守氨基酸序列KW(I/L)A(I/L)ES。细胞外区域中的粘附分子样结构域也具有保守序列。RTKs的TAM家族成员的非限制性例子包括MERTK、TYRO-3和AXL，后者也被称为UFO。
RTKs的TAM家族的示例性人类(智人)成员(human(Homo sapiens)member)包括：
-AXL受体酪氨酸激酶，其NCBI GenbankGene ID为558，Swissprot条目为P30530，后跟Genbank sequence versionNP_001265528.1的一个典型氨基酸序列的GenbankRefSeq，后跟Genbank sequence version NM_001278599.1的一个典型mRNA序列的GenbankRefSeq；
-MER原癌基因酪氨酸激酶，其NCBI GenbankGene ID为10461，Swissprot条目为Q12866，后跟Genbank sequence versionNP_006334.2的一个典型氨基酸序列的GenbankRefSeq，后跟Genbank sequence version NM_006343.2的一个典型mRNA序列的GenbankRefSeq；以及
-TYRO3蛋白酪氨酸激酶，其NCBI Genbank Gene ID为7301，Swissprot条目为Q06418，后跟Genbank sequence version NP_001317193.1的一个典型氨基酸序列的GenbankRefSeq，后跟Genbank sequence versionNM_001330264.1的一个典型mRNA序列的GenbankRefSeq。
鉴于以上内容，另一方面提供了一种用于预测被诊断为癌症的患者对药物的反应的方法，包括以下步骤：
(a)测定从所述被诊断为癌症的患者获得的样本中的RTKs的TAM家族中的至少一个成员的激酶活性，
(b)根据所述RTKs的TAM家族中的至少一个成员的所述激酶活性确定所述患者对所述药物的反应。
在特定实施例中，所述RTKs的TAM家族的至少一个成员是MERTK、TYRO3和/或AXL。优选地，所述RTKs的TAM家族的至少一个成员是MERTK。
所述RTKs的TAM家族的至少一个成员的激酶活性可以通过本领域已知的确定激酶活性的任何方法来确定。
在特定实施例中，所述RTKs的TAM家族的至少一个成员的激酶活性可通过使所述样本与至少一种蛋白激酶底物接触来确定，从而提供所述样本的磷酸化表达谱，所述磷酸化表达谱包括表1中所列的至少ZAP70(SEQ ID NO:5)、PRRX2(SEQ ID NO:20)和/或KSYK(SEQ ID NO:16)中存在的磷酸化位点的磷酸化水平，优选如表1所列至少ZAP70(SEQ IDNO:5)、DYR1A(SEQ ID NO:11)、FGFR3(SEQ ID NO:13)、KSYK(SEQ ID NO:16)和/或PRRX2(SEQ ID NO:20)中存在的磷酸化位点的磷酸化水平，更优选如表1所列的所有肽标记物。
在特定实施例中，所述RTKs的TAM家族的至少一个成员的激酶活性可通过使所述样本与至少一种蛋白激酶底物接触来确定，从而提供所述样本的磷酸化表达谱，所述磷酸化表达谱包括表1所列肽标记物ZAP70(SEQ ID NO:5)、DYR1A(SEQ ID NO:11)、FGFR3(SEQID NO:13)、KSYK(SEQ ID NO:16)和PRRX2(SEQ ID NO:20)中至少3、4或5个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平，优选如表1所列的至少ZAP70(SEQ ID NO:5)，PRRX2(SEQ IDNO:20)和KSYK(SEQ ID NO:16)，更优选如表1所列的至少ZAP70(SEQ ID NO:5)、PRRX2(SEQID NO:20)和KSYK(SEQ ID NO:16)和DYR1A(SEQ ID NO:11)或FGFR3(SEQ ID NO:13)，甚至更优选如表1所列的ZAP70(SEQ ID NO:5)、DYR1A(SEQ ID NO:11)、FGFR3(SEQ ID NO:13)、KSYK(SEQ ID NO:16)和PRRX2(SEQ ID NO:20)中的所有五个。
在特定实施例中，所述样本来自诊断为癌症的患者。
在特定实施例中，所述样本来自外周血或从外周血分离或富集的免疫细胞(例如，外周血单个核细胞(PBMCs))。
在特定实施例中，所述样本来自肿瘤组织，优选包含浸润性免疫细胞的肿瘤组织，如肿瘤浸润性T细胞(TIL)或巨噬细胞。
本发明所用术语“癌症”，是指以细胞生长解除调控或不受调控为特征的恶性肿瘤。在某些实施例中，所述癌症可选自由鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌(anal carcinoma)、阴茎癌和头颈癌组成的群组。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞还未迁移至受试者体内除原发性恶性肿瘤部位外的部位的那些)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，由瘤转移引起的、恶性细胞或肿瘤细胞迁移至不同于原发性肿瘤部分的继发部分的那些)。
在特定实施例中，所述癌症可选自由肺癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、子宫癌、胃食管癌和血癌组成的群组。
在特定实施例中，所述癌症可选自由肺癌、皮肤癌(例如，不可切除的IIIc或IV期黑色素瘤)、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、子宫癌、胃食管癌和血癌的高度突变的癌症组成的群组。
在特定实施例中，所述癌症可选自由肺癌(例如，IV期NSCLC)、皮肤癌(例如，不可切除的IIIc期或IV期黑色素瘤)、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、子宫癌、胃食管癌和血癌的转移形式组成的群组。在特定实施例中，所述癌症是NSCLC。
在特定实施例中，所述癌症是头部和/或颈部癌症，优选是选自于由口腔癌、咽癌、喉癌、唾液腺癌、副鼻窦癌(paranasal sinuses cancer)和鼻腔癌组成的群组中的头部或颈部癌症，更优选选自于由口腔癌、咽癌、喉癌、唾液腺癌、副鼻窦癌和鼻腔癌组成的群组中的头部或颈部癌的晚期形式。
在特定实施例中，所述癌症是IV期NSCLC。
在特定实施例中，所述药物是免疫治疗抗体，更优选为针对免疫检查点的免疫治疗抗体，更优选为针对CTLA-4、PD-1或PD-L1的免疫治疗抗体。针对PD-1或PD-L1的免疫治疗抗体的非限制性例子包括纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Prembrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atezolizumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、吡地利单抗(Pidilizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、德鲁单抗(Durvalumab)和/或其类似物。
在特定实施例中，所述药物选自由纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Prembrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atozolizumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、吡地利单抗(Pidilizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)和德鲁单抗(Durvalumab)组成的群组。
本发明还提供一种用于确定被诊断为癌症的患者对药物的反应的试剂盒，其包括至少一个阵列，该阵列包括表1中所列的至少ZAP70(SEQ ID NO:5)、PRRX2(SEQ ID NO:20)和KSYK(SEQ ID NO:16)，优选表1所列的至少ZAP70(SEQ ID NO:5)、DYR1A(SEQ ID NO:11)、FGFR3(SEQ ID NO:13)、KSYK(SEQ ID NO:16)和PRRX2(SEQ ID NO:20)，更优选表1中所列的所有肽标记物，以及在其上记录有一个或多个用于执行本发明所述方法的程序的计算机可读存储介质。
另一方面提供了一种计算机程序产品，用于与具有处理器和与所述处理器连接的存储器的计算机一起使用，所述计算机程序产品包括其上编码有计算机程序机制的计算机可读存储介质，其中，所述计算机程序机制可以加载到所述计算机的存储器中并使所述计算机执行所述方法，所述方法包括测定从所述诊断为癌症的患者获得的样本中的RTKs的TAM家族的至少一个成员的激酶活性，如本文所述。
本发明的另一实施例涉及包括测定从所述诊断为癌症的患者获得的样本中RTKs的TAM家族的至少一个成员的激酶活性、优选MERTK的激酶活性的方法在评估癌症患者对药物的敏感性中的用途。
本发明的另一实施例涉及包括测定从所述诊断为癌症的患者(如本文所述)获得的样本中RTKs的TAM家族的至少一个成员的激酶活性、优选MERTK的激酶活性的方法在评估药物的药用价值中的用途。
本发明的另一实施例涉及包括测定从所述诊断为癌症的患者(如本文所述)获得的样本中RTKs的TAM家族的至少一个成员的激酶活性、优选MERTK的激酶活性的方法在评估药物的临床价值中的用途。
在又一实施例中，本发明还涉及RTKs的TAM家族的活性、优选MERTK、TYRO3和/或AXL的活性、更优选MERTK的活性在预测诊断为癌症的患者对药物的反应中的用途。
本领域技术人员将理解，与预测诊断为非小细胞肺癌的患者对药物的反应的方法有关的所有特定实施例，包括以下步骤：(a)通过将所述样本与至少一种蛋白激酶底物接触来测定从所述诊断为非小细胞肺癌的患者获得的血样的激酶活性，从而提供所述样本的磷酸化表达谱，所述磷酸化表达谱包括表1所列的其中至少5个、优选至少8个或至少12个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平；以及，(b)根据所述磷酸化表达谱确定所述患者对所述药物的反应，如本文所述，例如，与根据所述磷酸化表达谱计算分类器参数有关的特定实施例、用于确定患者反应的试剂盒和计算机程序产品，也适用于预测诊断为癌症的患者对药物的反应的方法，其包括以下步骤：(a)测定从诊断为癌症的患者获得的样本中RTKs的TAM家族的至少一个成员的激酶活性，(b)根据所述RTKs的TAM家族的至少一个成员的所述激酶活性确定所述患者对本文所述药物的反应。
下文中将通过特定的、非限制性示例对本发明进行举例说明。
示例
示例1：3个月内对纳武单抗(Nivolumab)有短期进展和较晚(或无)进展的非小细胞肺癌患者可根据激酶抑制谱进行区分。
从30例对铂基疗法无反应的非小细胞肺癌患者中分离出PBMCs，其中18例在3个月内出现进展(6例部分应答(PR)，13例病情稳定(SD)，11例进行性疾病(PD))。在治疗开始前1-3天采集样本。在蛋白酶和磷酸酶抑制剂存在下，在MPER缓冲液中溶解PBMCs，并使用动态肽微阵列(PamChip)显示2μg总蛋白的激酶活性谱。所述微阵列包括144种不同的肽，它们是蛋白质酪氨酸激酶的底物。用荧光标记的抗磷酸酪氨酸抗体实时检测激酶活性。在Matlab中对这些谱进行分析，包括归一化步骤(方差稳定归一化(variancestabilizingnormalization)，VSN)和2组比较试验，以识别纳武单抗(Nivolumab)的进展较早和较晚患者的差分信号。
在第一次(对盲样)无监督层次聚类分析中，对纳武单抗(nivolumab)部分应答(PR)的患者样本与主要在LAT(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:14)和CBL(SEQ ID NO:15)磷酸化位点上的差分信号共同聚类，但也在PDGFRB(SEQ ID NO:17)、ANXA(SEQ ID NO:10)、ZAP70(SEQ ID NO:5)、JAK1(SEQ ID NO:19)、EPOR(SEQ ID NO:18)、FGFR2(SEQ ID NO:3)和FGFR3(SEQ ID NO:13)磷酸化位点上(图1)。在随后的监督分析中，激酶活性谱与无进展生存期(PFS)相关(图2)。在两组比较中，在140天之前或之后进展的患者观察到两种不同谱(图2)。较长PFS估计值(>140天)中的差分信号尤其存在于人工肽no.4(ART_004；SEQ ID NO:1)、erb-b2受体酪氨酸激酶4(ERBB4；SEQ ID NO:2)、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2,SEQ IDNO:3)、T细胞活化衔接因子(LAT，SEQ ID NO:4和14)、T细胞受体相关蛋白激酶70的ζ链(ZAP70；SEQ ID NO：5)、丝裂原活化蛋白激酶1(MK01；SEQ ID NO:6)、蛋白酪氨酸激酶2β(FAK2；SEQ ID NO：7)、Paxillin(PAXI；SEQ ID NO:8)和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDPK1；SEQ ID NO:21)的磷酸化位点。有趣的是，激酶活性谱对用纳武单抗(Nivolumab)治疗的患者的治疗结果提供了一个很好的预测。使用本发明的方法，可以将用纳武单抗(Nivolumab)治疗的较早进行性(<140天)或较晚(>140天)或非进行性患者分开(图3)。具有表1所列出的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21和22的磷酸化位点，优选SEQ ID NO:4、5、11、13、14、15、16和20，更优选SEQ ID NO:5、11、13、16和20，被确认为用于区别进行性和非/晚进行性患者的关键生物标记物。
采用统计学分析(2组比较)对较早和较晚进行性患者谱进行区分。分析了表1所列的最显著不同的肽序列，特别是ZAP70(SEQ ID NO:5)、DYR1A(SEQ ID NO:11)、FGFR3(SEQID NO:13)、KSYK(SEQ ID NO:16)和PRRX2(SEQ ID NO:20)的上游激酶活性，其可诱导其磷酸化。使用了来自知识数据库(HRPD、磷位点、反应体和磷酸网)的信息，表明激酶的TAM家族(即AXL、MERTK和TYRO3)在较晚进展性患者中的活性较高(图4)。
示例2：对PD-1阻断药物(PD-1blockers)有反应或无反应的头颈部癌症患者可根据激酶活性谱进行区分。
使用晚期头颈癌患者的血液样本进行临床研究，这些患者接受了PD-1阻断药物的治疗。这允许与临床反应进行比较。
采用统计分析方法(2组比较)对有反应和无反应的患者谱进行区分。分析最显著不同的肽序列的上游激酶活性，其可诱导其磷酸化。使用来自知识数据库(HRPD、磷酸化位点、反应体和磷酸网)的信息获得用于预测诊断为晚期头颈癌的患者对PD1阻滞剂的反应的标记物。
示例3：验证RTKs的TAM家族作为预测癌症患者对药物的反应的通用标记物。
对示例1和2的激酶活性谱进行组合统计分析。
使用来自知识数据库的信息(HRPD、磷位点、反应物和磷酸网)获得用于预测诊断为癌症的患者对药物、优选对PD-1阻断药物的反应的标记物。
序列表
<110> 帕姆基因有限公司
鹿特丹伊拉斯谟大学医学中心
<120> 预测非小细胞肺癌患者对药物的反应的方法
<150> PCT/EP2018/071569
<151> 2018-08-09
<160> 22
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1 5 10

Claims (15)

1.一种预测被诊断为非小细胞肺癌的患者对药物的反应的方法，包括以下步骤：
(a)通过将从所述被诊断为非小细胞肺癌的患者获得的血液样本与至少一种蛋白激酶底物接触，测定所述样本的激酶活性，从而提供所述血液样本的磷酸化表达谱，所述磷酸化表达谱包括表1所列的其中至少5个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平；以及，
(b)根据所述磷酸化表达谱确定所述患者对所述药物的反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液样本包括外周血单个核细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述药物选自由纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Prembrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atozolizumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、吡地利单抗(Pidilizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)和德鲁单抗(Durvalumab)组成的群组。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的方法，其特征在于，所述磷酸化表达谱包括表1所列的其中至少10个肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。
5.根据权利要求1至3任意一项所述的方法，其特征在于，所述磷酸化表达谱包括表1所列肽标记物中存在的磷酸化位点的磷酸化水平。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)替换为步骤(c)和步骤(d)，所述步骤(c)为从所述磷酸化表达谱计算分类器参数；步骤(d)为基于所述分类器参数确定所述患者对所述药物的反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，如果所述分类器参数高于第一预定阈值水平，则所述分类器参数指示所述患者是所述药物的良好反应者；如果所述分类器参数低于第二预定阈值水平，则所述分类器参数指示所述患者是所述药物的不良反应者。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(b)替换为步骤(e)和步骤(f)，所述步骤(e)为将所述磷酸化表达谱与第一和第二参考磷酸化表达谱进行比较；所述第一参考磷酸化表达谱代表对所述药物的良好反应者，所述第二参考磷酸化表达谱代表对所述药物的不良反应者；所述步骤(f)为基于所述磷酸化表达谱与所述第一和所述第二参考磷酸化表达谱的比较来确定所述患者对所述药物的反应。
9.根据权利要求6至8任意一项所述的方法，其特征在于，所述磷酸化表达谱或所述分类器参数指示所述患者对所述药物的良好反应、不良反应或不确定反应。
10.根据权利要求1至9任意一项所述的方法，其特征在于，所述非小细胞肺癌为IV期非小细胞肺癌。
11.根据权利要求1至10任意一项所述的方法，其特征在于，从步骤(a)中的测定确定所述药物在所述患者中的毒性。
12.权利要求1至11任意一项所述的方法在获取患有非小细胞肺癌的患者对药物的敏感性中的用途。
13.权利要求1至11任意一项所述的方法在评估药物的药物或临床价值中的用途。
14.一种用于确定被诊断为非小细胞肺癌的患者对药物的反应的试剂盒，其特征在于，其包括至少一个阵列，所述阵列包括表1中所列的其中至少5个肽标记物，还包括计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质记录有一个或多个用于执行权利要求1至11中任意一项所述的方法的程序。
15.一种计算机程序产品，用于与具有处理器和与所述处理器相连的存储器的计算机一起使用，所述计算机程序产品包括计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质上编码有计算机程序机制，其特征在于，所述计算机程序机制被加载到所述计算机的存储器中，并使所述计算机执行权利要求1至11任意一项所述的方法。
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