CN111088184A - 多功能屎肠球菌ccfm1106、其饲料添加剂及应用 - Google Patents

多功能屎肠球菌ccfm1106、其饲料添加剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了多功能屎肠球菌CCFM1106、其饲料添加剂及应用，屎肠球菌CCFM1106在体外对PFOS具有很好地吸附能力以降低PFOS浓度、具良好的清除二苯基三硝基苯肼自由基，清除羟自由基的能力和还原能力，改善小鼠因PFOS暴露造成的肝脏肿大，提高CAT、SOD及抗氧化能力的水平，改善肠道菌群紊乱，降低小鼠肠道中S24‑7科、乳酸杆菌属、双歧杆菌属和副拟杆菌的丰度，降低肝病、高血压、糖尿病和肥胖等疾病的发生倾向。屎肠球菌CCFM1106可用于制备具有缓解PFOS毒性的饲料添加剂和药品，具有非常广泛的应用前景。

Description

多功能屎肠球菌CCFM1106、其饲料添加剂及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及多功能屎肠球菌CCFM1106、其饲料添加剂及应用。
背景技术
全氟化合物由于其疏水疏油特性，并且具有良好的热稳定性，化学稳定性和生物稳定性，在各行各业受到了广泛的应用。用于成衣(如防水，防污户外服饰)及家居纺织品(如地毯，家具布料等)，饲料添加剂，个人护理产品(如牙线)以及灭火泡沫等等。而其中PFOS作为是多种氟类化合物的最终转化产物之一，可通过环境暴露，从而直接对人体和动物造成危害，或是进入动植物体内通过食物链在人体内生物累积，因此受到了研究学者越来越多的重视。尽管早在20世纪60年代，PFOS就被看作是潜在污染物，但一直到21世纪，PFOS在人体血液和生物体内被检出，才受到人们的广泛关注，并逐步展开有关方面的研究。人们逐渐意识到PFOS的毒性和危害，因此一系列措施使得PFOS的生产和使用被逐步限制。然而，在部分国家PFOS仍在大量使用，且环境中残留的PFOS还会在未来很长一段时间对整个生态系统造成持久影响。
暴露人群血液中PFOS含量与可能的健康影响之间的关联研究发现，暴露于PFOS可能与血液中总胆固醇浓度的升高，血糖升高、血脂升高及肝酶ALT和ALP浓度上升与体重降低有较明显的关系。这些迹象表明，PFOS可能会影响人体的肝脏功能，脂代谢与免疫功能。而在人体中出现的影响在哺乳动物体内已经被明确发现，PFOS具有肝脏毒性，免疫毒性，生殖毒性，发育毒性，神经毒性等多种毒性作用。PFOS可以导致肝肿大，同时可诱发小鼠肝组织氧化应激，使自由基异常增多，可能是造成肝脏损伤的主要原因。PFOS暴露对水生动物和啮齿动物免疫系统的多个免疫器官均产生不同程度的损伤，造成免疫器官脾脏和胸腺的萎缩老化，明显干扰斑马鱼脾脏白介素的表达，淋巴细胞的凋亡与衰退。在对小鼠的暴露实验中，高剂量PFOS暴露降低小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞的增值功能，显著诱导小鼠肝水肿变性和空泡形成，降低胆汁酸含量，PFOS可介导星形胶质细胞中的JAK2/STAT3通路，导致TNF-α分泌异常引起神经毒性干扰雌激素和雄激素稳态从而影响生长发育。
目前缓解PFOS毒性的方法多是从具有高抗氧化活性的天然化学物质着手，研究中有缓解作用的如槲皮素、番茄红素等都存在价格昂贵且难以获得，对于饲养家禽家畜等动物来说成本太高。此外，PFOS在动物体内富集然后通过食物链进入人体是人体接触PFOS从而造成人体毒害的途径之一，因此，寻找一种能够有效吸附PFOS，缓解动物体内PFOS毒性，并且对动物不存在其他可能有害作用的有效方法显然十分有必要。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供屎肠球菌CCFM1106，保藏编号为GDMCC No：60900。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种饲料添加剂：所述饲料添加剂为使用屎肠球菌CCFM1106生产制得，所述饲料添加剂包括粉态添加剂、液态添加剂。
作为本发明所述的饲料添加剂的一种优选方案：所述饲料添加剂为含有戊糖片球菌CCFM1106的液体或粉剂，所述饲料包括家禽、家畜的饲料。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供屎肠球菌CCFM1106在制备体内非定植益生菌中的应用。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供屎肠球菌CCFM1106在制备缓解PFOS的毒性作用，抗肝病、抗高血压、抗糖尿病、抗肥胖等的药物和饲料添加剂中的应用。
作为本发明所述的应用的一种优选方案：所述屎肠球菌CCFM1106在体外对PFOS具有很好地吸附能力以降低PFOS浓度、具良好的清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)，清除羟自由基的能力和还原能力，改善因PFOS暴露造成的肝脏肿大，降低肝脏中TNF-α的含量，降低血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量，提高CAT、SOD及抗氧化能力的水平，改善肠道菌群紊乱，降低肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度，降低肝病、高血压、糖尿病和肥胖等疾病的发生倾向。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供所述的饲料添加剂在制品缓解PFOS毒性性、抗肝病、抗高血压、抗糖尿病、抗肥胖的功能性饲料添加剂中的应用。
本发明的有益效果：本发明所述屎肠球菌CCFM1106在体外对PFOS具有很好地吸附能力以降低PFOS浓度、具良好的清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)，清除羟自由基的能力和还原能力，改善因PFOS暴露造成的肝脏肿大，降低肝脏中TNF-α的含量，降低血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量，提高CAT、SOD及抗氧化能力的水平，改善肠道菌群紊乱，降低肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度，降低肝病、高血压、糖尿病和肥胖等疾病的发生倾向。屎肠球菌CCFM1106可用于制备具有缓解PFOS毒性的饲料添加剂、药品，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明菌株在体外重悬于浓度为20mg/L PFOS中经过37℃，200rpm摇床12h后，过0.22μm水系滤膜进入超高效液相色谱质谱联用仪中，吸附后PFOS浓度变化示意图。
图2为本发明菌株在体外清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)能力，清除羟自由基能力、还原能力。
图3为本发明菌株干预15天后小鼠暴露于PFOS，小鼠肝脏比重的变化图。其中不同字母代表具有显著差异。
图4为本发明菌株干预15天后小鼠暴露于PFOS，小鼠血清中ALP、ALT、AST水平示意图。其中不同字母代表具有显著差异。
图5为本发明菌株干预15天后暴露于PFOS，小鼠肝脏中CAT、SOD及抗氧化能力的变化示意图。其中不同字母代表具有显著差异。
图6为本发明菌株干预15天后小鼠暴露于PFOS，小鼠肝脏中肿瘤坏死因子α示意图；其中不同字母代表具有显著差异。
图7为本发明菌株干预15天后小鼠暴露于PFOS，小鼠肠道菌群α多样性变化示意图；其中不同字母代表具有显著差异。
图8为本发明菌株干预15天后小鼠暴露于PFOS，小鼠肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度的变化示意图；其中不同字母代表具有显著差异。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明的屎肠球菌(Enterococcus faecium)CCFM1106，于2019年11月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60900。
所述屎肠球菌具有以下生物学特性：
(1)菌体特征：革兰氏阳性，细胞球状，直径0.8～1.0μm，无鞭毛，无芽孢；
(2)菌落特征：菌落乳白色，边缘整齐，圆形，凸起，不透明，表面湿润光滑；
(3)生长特性：该菌株的最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在温度35-37℃下生长最佳，最适生长pH为6.5，培养15h后进入稳定期；
(5)体外具有良好的清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)能力，清除羟自由基能力和还原能力；
(6)屎肠球菌CCFM1106能显著改善PFOS暴露小鼠肝脏肿大；
(7)屎肠球菌CCFM1106能显著降低PFOS暴露小鼠血清中ALP、ALT、AST的水平；
(8)屎肠球菌CCFM1106能显著提高PFOS暴露小鼠肝脏中CAT、SOD和抗氧化能力的水平。
(9)屎肠球菌CCFM1106能够显著降低PFOS暴露小鼠肝脏中TNF-α的含量；
(10)屎肠球菌CCFM1106显著降低小鼠肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度，改善PFOS暴露造成的肠道菌群紊乱，降低肝病、高血压、糖尿病和肥胖等疾病的发生倾向。
所述屎肠球菌CCFM1106的提取方法为：
(一)乳酸菌的分离筛选：
(l)收集若干份健康成人的粪便样本，将样品在含有山梨醇GM17培养基中35℃富集12h；
(2)将富集样品进行梯度稀释后涂布于添加了0.02％嗅甲酚紫的GM17固体平板上，培养24-48h；
(3)选取变色圈明显，并且符合乳酸菌目基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出乳酸菌；
(4)将上述单菌落培养于液体GM17培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。
(二)乳酸菌的初步鉴定：溶钙圈测定法
(l)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体山梨醇GM17培养液中培养24h，然后取l mL培养物8000rpm离心2min；
(2)用0.05M KH2PO4溶液洗涤两次；
(3)将所得菌泥重悬，划线在山梨醇GM17-0.75％CaCO3的固体培养基上，培养24h；
(4)选取溶钙圈明显，且呈凸面圆形、细密色白、无菌丝体的菌落，革兰氏染色后显微镜观察菌体为球状即初步判定为球菌。
(三)乳酸菌的分子生物学鉴定：
(l)单菌基因组抽提：
A.将步骤(二)所筛选得到的乳酸菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液l mL于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
B.用l mL无菌水吹洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；
C.加入200μLSDS裂解液，80℃水浴30min；
D.加入酚-氯仿溶液200μL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为Tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μL；
E.加入400μL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，﹣20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；
F.加入500μL70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；
G.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；
H.50μLddH2O重溶沉淀以备PCR；
(2)16S rDNA PCR
A.细菌16S rDNA 50μLPCR反应体系：
10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模板，0.5μL；ddH2O，38μL。
B.PCR条件：
95℃ 5min；95℃ 10s；55℃ 30s；72℃ 30s；step2-4 30×；72℃ 5min；12℃2min；
(3)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量5μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(4)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为属于屎肠球菌的一种新发现的菌株，-80℃保藏备用。
实施例1：屎肠球菌CCFM1106具有良好的PFOS吸附能力
菌体吸附对屎肠球菌CCFM1106进行纯化和活化培养，按1％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养12h。然后在8000r/min离心5min收集菌体，取沉淀用生理盐水清理后继续在8000r/min离心5min，去沉淀得到活菌体细胞，即湿菌体。将湿菌体重悬于20mg/L PFOS溶液中，并使最终菌体浓度达到1g干菌体/L(将湿菌体重悬于不含PFOS的超纯水中作为空白对照)。使用0.1M的NaOH或HCl溶液将含菌液的PFOS溶液的pH迅速调整至3.0，添加少量的NaOH或HCl(少于0.5ml)其离子强度对PFOS吸附的影响可以忽略。随后将装有100ml样液的250ml锥形瓶置于37℃、200rpm摇床培养，12h后取样测定，2次平行试验取平均值。
PFOS吸附量的测定：吸附实验后，样液在8000r/min离心5min，并用0.22μm的水膜过滤，PFOS浓度用具有Waters SYNAPT MS系统的UPLC-MS测定，采用Acquity UPLC BEH c18柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters Co.)，柱温35℃，进样量1μL。用100％(v/v)的乙腈溶液(溶液A)和0.1％(v/v)甲酸水溶液(溶液B)作为洗脱液，进行梯度清洗，流速是0.3mL/min。
表1梯度洗脱条件
t/min 0-0.5 0.5-5.0 5.0-7.0 7.0-7.5
溶剂A比例 70％ 70-100％ 100％ 100-70％
质谱条件：电离源为ESI源；MRM检测；MS+检测；Capillary(毛细管)；3.0kV；Conc(椎体)：40.00V；Source Temperature(放射源温度)：120℃；Desolvation(去溶剂化)温度：400℃；Conc Gas Flow：50L/h；Desolvation Gas Flow：700L/h.气体流速为0.1ml/min；质子比扫描范围：100-2000；扫面时间1s，间隔0.061s。结果用MassLynxV4.1(Waters公司)分析；根据吸附前后PFOS的浓度差异计算乳酸菌对PFOS的吸附量。测定结果列于图1，CCFM1106对20mg/L的PFOS的吸附率最高达到65.77％(62.97％±2.80％)。
实施例2：屎肠球菌CCFM1106体外具有良好的清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)能力，清除羟自由基能力和还原能力；
将1mL屎肠球菌CCFM1106完整细胞悬液与1mL新鲜配制的DPPH无水乙醇溶液(0.2mmol/L)充分混匀后，37℃条件下避光反应30min。将DPPH与PBS(pH7.2)混合作为对照样品，同样条件培养。7000×g离心10min后，在517nm测定吸光度，并按照以下公式计算乳酸菌清除DPPH自由基的能力：
DPPH自由基清除率(％)＝[1-A517(样品)/A517(对照)]×100％。
将1mL1,10-邻二氮菲1mLPBS(pH7.2)，1mL屎肠球菌CCFM1106完整细胞悬液或以及1mLFeSO4混合均匀(称为“混合物1”)。向“混合物1”中加入1mLH2O2，37℃条件下水浴1.5h，在536nm测定吸光度，表示为A536(样品)。将“混合物1”中的完整细胞悬液换成同体积的蒸馏水，以同样条件培养并检测，表示为A536(空白)。将向“混合物1”加入的H2O2换成同体积的蒸馏水，以同样条件培养并检测，表示为A536(对照)。按照以下公式计算乳酸菌清除羟自由基的能力：
羟自由基清除率(％)＝[A536(样品)-A536(空白)]/[A536(对照)-A536(空白)]×100％
将0.5mL屎肠球菌CCFM1106完整细胞悬液与同体积的铁氰化钾(1％)及PBS缓冲液(pH6.6)混合，振荡使体系均匀。将蒸馏水与铁氰化钾及PBS混合作为空白对照。混合体系在50℃条件下培养20min，快速冷却，并加入0.5mL10％的三氯乙酸。在2000×g离心5min后，取1mL上清与1mL0.1％的氯化铁混合并反应10min。随后在700nm波长下测定吸光度，并使用半胱氨酸(Cysteine)作为表征还原力的标准。实验结果见图2。
实施例3：屎肠球菌CCFM1106能显著改善PFOS暴露小鼠肝脏肿大
6周龄雄性C57BL/6J小鼠24只，适应环境一周后，根据体重随机分为四组：空白对照组、模型组、槲皮素干预组、屎肠球菌CCFM1106干预组，每组含6只小鼠，动物分组及处理方法见表2。
表2动物实验分组及处理方法
Figure BDA0002343733420000081
实施例2中的小鼠于第31天称体重，随后安乐处死，眼眶取血，取出肝脏称湿重以计算脏器系数，按以下公式计算小鼠肝脏的脏器系数：
肝脏脏器系数＝肝脏湿重(g)/安乐死前小鼠体重(100g)
实验结果如图3所示，结果表明服用屎肠球菌CCFM1106能够显著缓解由于PFOS暴露造成的小鼠肝脏肿大。
实施例4：屎肠球菌CCFM1106能显著降低PFOS暴露小鼠血清中ALT、ALP和AST的水平
取实施例3中的血液，静置一小时后，3500r/min，离心15min，取血清待测。采用全自动生化分析仪检测血清中ALT、ALP和AST的含量。ALT、AST作为肝细胞胞质和线粒体中的非特异性功能酶，当肝细胞被破坏时会释放到血液中。ALP一般由肝脏排泄，当肝脏出现损伤时ALP可经淋巴道和肝窦进入血液。实验结果表明(图4)，服用屎肠球菌CCFM1106能够显著降低PFOS暴露小鼠血清中ALT、ALP和AST的含量。表明服用屎肠球菌CCFM1106能够显著缓解PFOS造成的小鼠肝细胞膜结构和功能的损伤。
实施例5：屎肠球菌CCFM1106能显著降低PFOS暴露小鼠肝脏中MDA和GSH的水平
取实施例3中的小鼠肝脏制成10％匀浆，准确称取肝脏按重量(g):体积(ml)＝1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，充分破碎细胞，5000r/min，离心10分钟，取上清测定。肝脏中SOD、CAT、和抗氧化能力T-AOC的水平根据南京建成试剂盒提供的试剂盒进行测定。CAT主要存在于过氧化物酶体中，负责H2O2的还原和细胞膜中不饱和脂肪酸的氧化保护。SOD是体内重要的抗氧化酶，对ROS具有重要的清除作用。抗氧化能力可以表明机体对待氧化应激的水平。实验结果表明(图5)，服用屎肠球菌CCFM1106能够显著提高PFOS暴露小鼠肝脏中CAT、SOD及抗氧化能力的水平。说明屎肠球菌CCFM1106对PFOS造成的肝脏氧化应激损伤能起到有效的改善效果。
实施例6：屎肠球菌CCFM1106能够显著降低PFOS暴露小鼠肝脏中TNF-α的含量
取实施例3中的小鼠肝脏制成10％匀浆，准确称取肝脏按重量(g):体积(ml)＝1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，充分破碎细胞，5000r/min，离心10分钟，取上清肝脏匀浆测定。肝脏中的细胞因子TNF-α含量按照ELISA试剂盒(RD)说明书测定细胞因子含量。实验结果表明服用屎肠球菌CCFM1106能显著改善PFOS暴露造成的小鼠肝脏炎症损伤(图6)。
实施例7：屎肠球菌CCFM1106能显著降低PFOS暴露小鼠肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度，改善PFOS暴露造成的肠道紊乱，降低肝病、高血压、糖尿病和肥胖等疾病发生的倾向。
取实施例3中小鼠第31天的新鲜粪便，采用MP的粪便试剂盒提取小鼠粪便样品中总DNA。具体操作步骤如下主要参照试剂盒说明书进行。以小鼠粪便基因组为模板，以上游引物520F(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)、下游引物802R(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)为引物扩增16S rDNA的V3-V4区片段，目的片段长度为247bp左右。PCR反应结束，将观察到目的条带的所有PCR样品再次进行电泳，配制2.0％琼脂糖凝胶，于120V条件下电泳40min，跑胶结束后，在紫外灯下快速进行目的条带的切割。按照QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒说明书进行目的条带胶回收。根据Qubit DNA3.0试剂盒检测样品DNA浓度，随后根据TurSeq DNA LT Sample Preparation Kit及其说明构建文库，最后根据MiSeq Regent Kit及其说明经过Illumina Miseq测序仪上机测定。测序完成后，剔除掉序列长度＜200bp、引物序列、不能拼接的单序列，按照重叠碱基>10bp且无错配的标准拼接序列。将相似度大于97％序列定义为一个分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)，通过RibosomalDatabase Project(RDP)
Figure BDA0002343733420000101
Bayesclassifier来确定物种。计算样品的α-多样性、β-多样性，用来评估样品的菌群多样性。其中α-多样性用chao1和observed species指数来表征，结果(图7)显示模型组小鼠的肠道菌群α多样性升高，说明PFOS暴露会伴随着一定程度的肠道紊乱。服用屎肠球菌CCFM1106能明显降低肠道菌群的α多样性，改善肠道紊乱情况。
在PFOS染毒后，粪便中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度提高，而服用屎肠球菌CCFM11106还能显著降低PFOS染毒后S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度(图8)；S24-7高度定位于恒温动物的胃肠道，革兰氏阴性非运动型厌氧型微生物，能够发酵多种碳水化合物，和非酒精性脂肪肝和高血压的发生发展有关。乳酸杆菌(Lactobacillus)是正常胃肠道和泌尿生殖器的一部分，是常见的益生菌，在乳酸菌预防实验中PFOS模型组和染毒模型出现丰度上升的情况，乳酸菌可能在PFOS暴露后出现了负反馈调节的现象。双歧杆菌(Bifidobacterium)广泛存在于人和动物的消化道、阴道和口腔等生境中，人和动物肠道菌群的重要组成成员之一，可作为益生菌而用在饲料添加剂、医药和饲料方面。在正常情况下，人体内的肠道微生物形成了一个相对平衡的状态。小鼠在PFOS染毒后，肠道微生物平衡受到破坏，导致肠道菌群紊乱，某些肠道微生物如产气荚膜梭菌等在肠道中过度增殖并产生氨、胺类、硫化氢、粪臭素、吲哚、亚硝酸盐、细菌毒素等有害物质，从而进一步影响小鼠的健康。此时，双歧杆菌(Bifidobacterium)则会产生反馈调节，丰度增多来能抑制有害细菌的生长，抵抗外来污染物的感染，合成人体需要的维生素，促进人体对矿物质的吸收，产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸刺激肠道蠕动，促进排便，防止便秘以及抑制肠道腐败作用、净化肠道环境、分解致癌物质、刺激人体免疫系统，从而提高抗病能力等。副拟杆菌(Parabacteroides)是人体核心菌群之一，通过体内外实验发现副拟杆菌(Parabacteroides)具胆酸转化功能，还可产生大量琥珀酸，可激活肠道FXR信号通路，改善脂代谢紊乱，修复肠壁，激活肠道糖异生，从而调节食欲，促进肝脏糖原合成，改善宿主糖代谢紊乱。另外，研究表明副拟杆菌(Parabacteroides)含量降低，会增加机体患肥胖、非酒精性脂肪肝和糖尿病等疾病的倾向。以上结果表明屎肠球菌CCFM1106在缓解PFOS毒性的基础上，还同时具备调节肠道菌群、调节免疫及肠道屏障、减少肝病、高血压、糖尿病和肥胖的发生。
实施例8：利用本发明屎肠球菌CCFM1106制备该菌的饲料添加剂
选用适合屎肠球菌CCFM1106生长繁殖的培养基后，进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明制备的屎肠球菌CCFM1106，使其浓度达到106CFU/mL以上，进行浓缩后加入菌株保护，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明屎肠球菌CCFM1106活菌的饲料添加剂。
利用本发明能够使用屎肠球菌CCFM1106生产制备其他饲料添加剂，所述饲料添加剂包括粉态添加剂、液态添加剂。所述饲料添加剂包括家畜、家禽等饲料添加剂。
屎肠球菌CCFM1106在体外对PFOS具有良好的吸附作用；所述屎肠球菌CCFM1106在清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)、清除羟自由基、还原能力中表现出高抗氧化作用；所述屎肠球菌CCFM1106显著改善因PFOS暴露造成的小鼠肝脏肿大；显著降低PFOS暴露小鼠肝脏中TNF-α的含量；所述屎肠球菌CCFM1106显著降低PFOS暴露小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量；所述屎肠球菌CCFM1106升高肝脏中CAT和GSH含量，提高肝脏中抗氧化能力；所述屎肠球菌CCFM1106能够改善PFOS暴露小鼠的肠道菌群紊乱，降低肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌属(Parabacteroides)的丰度，降低肝病、便秘、高血压、糖尿病和肥胖的发生倾向。
在PFOS模型小鼠实验中，服用屎肠球菌CCFM1106能够显著改善因PFOS暴露造成的小鼠肝脏肿大；服用屎肠球菌CCFM1106能够显著降低PFOS暴露小鼠肝脏中TNF-α的含量；服用屎肠球菌CCFM1106降低PFOS暴露小鼠血清中ALT、AST、ALP的含量；服用屎肠球菌CCFM1106升高肝脏中CAT和GSH含量，提高肝脏中抗氧化能力；服用能够改善PFOS暴露小鼠的肠道菌群紊乱，降低肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌属(Parabacteroides)的丰度，并使肠道菌群趋于正常化，减少肝病、便秘、高血压、糖尿病和肥胖的发生。体外实验表明，屎肠球菌CCFM1106能够良好的吸附PFOS,能够有效地清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)、清除羟自由基、表现出良好的还原能力。
本发明筛选出对PFOS具有高吸附能力且不在人体中定植并且具有高抗氧化能力的益生菌，不仅能够抑制PFOS造成的氧化应激，而且能够从根本上清除人体内的PFOS。屎肠球菌CCFM1106可用于制备具有缓解PFOS毒性的饲料添加剂和药品，具有非常广泛的应用前景。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.屎肠球菌CCFM1106，保藏编号为GDMCC No：60900。
2.一种饲料添加剂，其特征在于：所述饲料添加剂为使用屎肠球菌CCFM1106生产制得，所述饲料添加剂包括粉态添加剂、液态添加剂。
3.如权利要求2所述的饲料添加剂，其特征在于：所述饲料添加剂为含有戊糖片球菌CCFM1106的液体或粉剂，所述饲料包括家禽、家畜的饲料。
4.屎肠球菌CCFM1106在制备体内非定植益生菌中的应用。
5.屎肠球菌CCFM1106在制备缓解PFOS的毒性作用、抗肝病、抗高血压、抗糖尿病、抗肥胖的药物和饲料中的应用。
6.如权利5所述的应用，其特征在于：所述屎肠球菌CCFM1106在体外对PFOS具有很好地吸附能力以降低PFOS浓度、具良好的清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)，清除羟自由基的能力和还原能力，改善因PFOS暴露造成的肝脏肿大，降低肝脏中TNF-α的含量，降低血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量，提高CAT、SOD及抗氧化能力的水平。
7.如权利6所述的应用，其特征在于：所述屎肠球菌CCFM1106还能够改善肠道菌群紊乱，降低肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度，降低肝病、高血压、糖尿病和肥胖等疾病的发生倾向。
8.权利要求2或3所述的饲料添加剂在制品缓解PFOS毒性、抗肝病、抗高血压、抗糖尿病、抗肥胖的功能性饲料和药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述屎肠球菌CCFM1106在体外对PFOS具有很好地吸附能力以降低PFOS浓度、具良好的清除二苯基三硝基苯肼自由基(DPPH)，清除羟自由基的能力和还原能力，改善因PFOS暴露造成的肝脏肿大，降低肝脏中TNF-α的含量，降低血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量，提高CAT、SOD及抗氧化能力的水平。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述屎肠球菌CCFM1106还能够改善肠道菌群紊乱，降低肠道中S24-7科、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和副拟杆菌(Parabacteroides)的丰度，降低肝病、高血压、糖尿病和肥胖等疾病的发生倾向。
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