CN111072621A - 一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法 - Google Patents

一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超声辅助双水相‑响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，通过构建乙醇与硫酸铵的双水相体系，结合超声波提取花青素，将花青素选择性的分配到上相中，然后进行体外抗氧化活性评价，本发明将超声波和双水相结合，实现优势互补，方法简单，快速有效，无污染对设备要求低，易于连续生产和放大生产，通过该方法花青素的萃取率达到2.494mg/g，通过体外抗氧化活性结果评价萝卜中花青素具有良好的清除自由基的活性。

Description

一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素 的方法
技术领域
本发明涉及植物中花青素的提取方法，优化过程以及体外抗活性评价，尤其涉及一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法及该方法获得的花青素的体外抗氧化活性的评价方法。
背景技术
心里美(Spring watermelon)，又称水果萝卜，隶属十字花科二年或一年生草本植物，叶簇平展且植株粗壮，外皮浅绿，果肉紫红，富含花色素，糖类物质，维生素C，叶黄素，钙，磷和铁等多种人体需要的营养物质。现代研究表明萝卜具有很高的食用保健功效，常吃可起到降低血脂、预防心血管疾病、抗癌、抗炎抑菌等疾病的作用。
目前对植物中花青素的提取方法主要包括溶剂浸提法、超声波萃取法、微波萃取法、超临界流体萃取法、酶萃取法、双水相萃取法等，由于单一的提取方法并不能对目标物进行特定有效的提取，因此两种或多种萃取方法联用逐渐受到关注。超声辅助是应用超声波在传递过程中存在的正负压强交变周期，介质被撕裂成许多小空穴瞬时闭合，微小气泡的爆裂会产生极大的压力，使植物细胞壁及整个生物体的破裂在瞬间完成，同时产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率。超声波作为一种辅助提取手段主要集中在中草药成分、植物油、多酚、芳香成分、多糖等成分的提取研究领域。
天然产物中如心里美含有众多的活性成分，传统的萃取分离技术会消耗大量的有机溶剂及药物原料，消耗时间长且萃取效率低。近年发展趋势看，天然产物提取分离的研究逐渐趋向通过多种方法联合使用，充分利用集成化优势，解决传统的单一方法的不足。为此我们提出一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法及该方法获得的花青素的体外抗氧化活性的评价方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，包括如下步骤：
步骤1：对心里美萝卜清洗、自然晾干、去皮后切片烘干除去水分，干燥后粉碎过筛备用；
步骤2：建立乙醇/硫酸铵的双水相萃取体系；
步骤3：将步骤1中备用的萝卜粉末与乙醇/硫酸铵双水相萃取剂混合，进行超声提取得到花青素。
进一步的，步骤1的心里美萝卜清洗表面污垢后自然晾干，将萝卜肉和外皮分开后，萝卜肉切成薄片，放进烘箱烘干，待萝卜片烘干后采用粉粹机粉碎，萝卜粉末过80目筛，密封置于干燥皿备用。
进一步的，步骤2中所述的乙醇/硫酸铵的双水相萃取体系的pH为2-4。
进一步的，步骤2中乙醇的质量分数为27％，硫酸铵的质量分数为20％。
进一步的，步骤2中所述的乙醇/硫酸铵的双水相萃取体系的pH为3。
进一步的，步骤2中萝卜粉末与乙醇/硫酸铵双水相萃取剂按照1g：30mL 的比例混合。
进一步的，步骤3中所述的超声提取的温度为49.78℃-50℃。
进一步的，步骤3中所述的超声提取的时间优选为24.08min-25min。
进一步的，提取冷却后，以3500r/min转速离心5min，静置分相。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用超声辅助双水相提取萝卜中花青素，通过单因素考察结合响应面进行优化，并通过体外抗氧化作用来评价花青素的活性。乙醇/硫酸铵双水相中由于小极性乙醇，强电解质的盐增加了介电常数，在超声波的作用下，硫酸铵瞬间激化，增加了超声波的穿透性，促进溶剂与目标分子的作用，花青素快速破壁渗入双水相中，由于两相性质差异，极性较小的花青素最终被分配到含醇量多的上相，实现提取和纯化的一步化，减少传统溶剂提取所带来的杂质，简化纯化步骤。
本发明采用超声波作为提取动力，双水相作为提取溶剂，两者结合能够协同发挥超声波的破壁，高效率性以及双水相的选择性，纯化富集作用，该方法快速有效，无污染，有机溶剂残留低，对设备要求低，易于放大生产，花青素的萃取率可以达到2.494mg/g。经过双水相初步纯化后花青素显示出良好的体外抗氧化活性。
本发明通过构建乙醇与硫酸铵的双水相体系，结合超声萃取法来萃取心里美萝卜中的花青素。通过对双水相体系的筛选、超声条件的优化并结合响应面优化法建立一种简便高效的提取方法。采用紫外分光光度法结合pH示差法对花青素进行定量，此外研究花青素的抗氧化活性以及稳定性。
附图说明
图1是本发明单因素考察中双水相萃取体系的硫酸铵质量分数对花青素提取得率影响的结果分析图。
图2是本发明单因素考察中料液比对花青素提取得率影响的结果分析图。
图3是本发明单因素考察中超声时间对花青素提取得率影响的结果分析图。
图4是本发明单因素考察中超声温度对花青素提取得率影响的结果分析图。
图5是本发明单因素考察中pH值对花青素提取得率影响的结果分析图。
图6是本发明响应面设计结果图。
图7是本发明制得的产物的DPPH清除试验结果分析图。
图8是本发明制得的产物的羟基自由基清除试验结果分析图。
图9是本发明制得的产物的超氧阴离子清除试验结果分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-9，本发明提供一种技术方案：
本发明所采用的技术手段以及实验步骤如下：
1)通过对双水相萃取体系的组成研究，建立乙醇/硫酸铵的双水相萃取体系。
2)心里美萝卜去皮后切片烘干除去水分，干燥后粉碎过筛，与乙醇/硫酸铵双水相萃取剂混合，进行超声提取，提取液经放置分相后取上相进行含量测定。
3)采用体外抗氧化活性方法研究花青素的抗氧化能力，包括DPPH自由基，羟基自由基以及超氧阴离子清除试验，以Vc为阳性对照，清除率为指标进行评价。
实施例1单因素实验
(1)心里美萝卜的预处理
心里美萝卜购自徐州，萝卜清洗表面污垢后自然晾干，为方便烘干，将萝卜肉和外皮分开后，萝卜肉切成薄片，放进烘箱烘干，待萝卜片烘干后采用粉粹机粉碎，粉末过80目筛后密封置于干燥皿备用。
(2)乙醇/硫酸铵双水相体系的构建：
准确称取一定量的硫酸铵于离心管中，加入一定体积的去离子水后超声溶解，待硫酸铵溶解后，用盐酸调节溶液pH，摇匀后加入一定体积的无水乙醇，摇匀，静置直到分相，得到乙醇/硫酸铵双水相萃取剂。
(3)将步骤(1)得到的心里美萝卜粉末与乙醇/硫酸铵双水相萃取剂混合，进行超声提取，提取液经放置分相后取上相，按照pH示差法进行含量测定：
C(mg/g)＝ΔA*MW*DF*V*1000/ε*m*L (1)
ΔA＝(A510-A700)pH＝1.00-(A510-A700)pH＝4.50；MW为矢车菊素 -3-葡萄糖分子量＝449.2g/mol；DF为稀释倍数＝10；V为提取液体积(L)；ε为矢车菊素-3-葡萄糖消光系数＝26900L/(mol*cm)；m为萝卜粉末(g)；L 为光程＝1cm。
分别考察双水相萃取体系中硫酸铵质量分数(17％、18％、19％、20％、 21％)，心里美萝卜粉末与乙醇/硫酸铵双水相萃取剂的料液比(20:1、30:1、 40:1、50:1、60:1，mL/g)、超声提取的时间(10min、15min、20min、25min、30min)、超声提取的温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、乙醇/硫酸铵双水相萃取剂的pH值(1、2、3、4、5)对心里美萝卜花青素提取率的影响。
结果如图1-5所示。
双水相体系的建立，选择乙醇/硫酸铵的成相范围进行筛选，如图1所示，结果得到乙醇的质量分数为27％，硫酸铵的质量分数为20％对应的花青素提取率最高。
对超声提取条件的优化，分别考察超声时间和温度，结果如图3、图4所示，超声温度最优为50℃，超声时间最优为25min。
如图2所示，粉碎后的萝卜粉末与乙醇硫酸铵双水相体系的按1g：30mL 的比例混合花青素提取率最高；如图5所示，双水相体系的pH为3时，提取得率最高。
实施例2响应面优化实验设计
采用响应面优化法的Box-Behnken设计进行优化实验，鉴于单因素考察结果，选择超声温度、时间以及pH进一步考察因素和因素之间交叉作用对萃取率的影响。采用BBD实验设计能够减少实验次数，且设计不会超出实验安全范围。设计总共有17组实验，其中包括12个因子点和5组中心点的重复性实验，采用Design-Expert软件8.0版用于回归分析和优化。拟合模型由以下二次方程解释：
Figure 1
Y为响应值(即萃取率)，Xi和Xj为自变量，β0为回归方程截距,βi,βii及βij分别为一次项、二次项和交叉项系数。
通过实施例1的单因素考察，选择pH、超声时间和超声温度进行响应面的BBD设计，如图6，结果显示超声时间和温度对实验结果影响显著，优化组合为超声温度49.78℃，时间24.08min和pH为3.00，预测实验值为2.336％，经实验验证为2.494±0.133％。
实施例3心里美萝卜中花青素的萃取
超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，包括以下步骤：
(1)心里美萝卜的预处理
萝卜清洗表面污垢后自然晾干，为方便烘干，将萝卜肉和外皮分开后，萝卜肉切成薄片，放进烘箱烘干，待萝卜片烘干后采用粉粹机粉碎，粉末过 80目筛后密封置于干燥皿备用。
(2)乙醇/硫酸铵双水相体系的构建：
准确称取一定量的硫酸铵于离心管中，加入一定体积的去离子水后超声溶解，待硫酸铵溶解后，用盐酸调节溶液pH为3，摇匀后加入一定体积的无水乙醇，摇匀，静置直到分相，得到乙醇/硫酸铵双水相萃取剂，其中乙醇的质量分数为27％，硫酸铵的质量分数为20％。
(3)超声辅助双水相萃取心里美萝卜中花青素
萝卜粉末过80目筛，与乙醇/硫酸铵双水相萃取剂按照1g：30mL的比例混合，在超声温度为50℃下超声提取25min，提取冷却后，以3500r/min转速离心5min，静置分相，取上相进行紫外检测，按照pH示差法进行含量测定：
C(mg/g)＝ΔA*MW*DF*V*1000/ε*m*L (1)
ΔA＝(A510-A700)pH＝1.00-(A510-A700)pH＝4.50；MW为矢车菊素 -3-葡萄糖分子量＝449.2g/mol；DF为稀释倍数＝10；V为提取液体积(L)；ε为矢车菊素-3-葡萄糖消光系数＝26900L/(mol*cm)；m为萝卜粉末(g)；L 为光程＝1cm。
实施例4本发明得到的花青素的体外抗氧化活性研究
采用体外抗氧化活性方法研究花青素的抗氧化能力，包括DPPH自由基，羟基自由基以及超氧阴离子清除试验，以Vc为阳性对照，清除率为指标进行评价。
用实施例3制得的花青素配制一系列不同浓度的花青素溶液，加入到三个抗氧化体系DPPH自由基，羟基自由基以及超氧阴离子，以Vc作为阳性对照，清除率作为活性大小指标来评价花青素的抗氧化能力。
1.DPPH清除试验
量取2.00mL不同浓度的上相提取液，加入0.1mmol/L的DPPH-乙醇溶液2.00mL，混匀后置于暗处避光反应30min，以Vc为对照品，于517nm处测定吸光度A1，以乙醇代替样品测定吸光度A0，按照以下公式计算清除率：
DPPH·(％)＝(A0-A1)/A0*100
2.超氧阴离子清除试验
量取4.00mL Tris-HCl(50mmol/L,pH＝8.20)，在37℃下保温25min后，加入0.5mL不同浓度的上相提取液以及0.5mL 5mmol/L的邻苯三酚溶液，在37℃下反应10min后取出，以Vc为对照品，于318nm处测定吸光度A1，以蒸馏水代替样品测定吸光度A0，以蒸馏水代替邻苯三酚测定吸光度A2，按照以下公式计算清除率：
O2 -·(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0*100
3.羟基自由基清除试验
量取1.00mL不同浓度的上相提取液，加入0.5mL 7.5mmol/L水杨酸-乙醇溶液和硫酸亚铁溶液，摇匀后加入0.5mL 8.8mmol/L的过氧化氢溶液，于 37℃水浴反应30min后取出，以Vc为对照，在525nm处测定吸光度A1，以蒸馏水代替硫酸亚铁溶液测定吸光度A2；取蒸馏水代替样品溶液做空白对照测定吸光度A0，计算清除率：
OH·(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0*100。
如图7所示，花青素随着浓度的增加，其DPPH自由基的清除率逐渐增加，花青素浓度为20.00μg/mL时达到最大清除率为86.30±0.14％，而Vc在浓度为10μg/mL时达到最大清除率为95.18±0.14％。
如图8所示，相同浓度范围内(0.10-0.20mg/mL)，Vc和花青素均具有清除羟基自由基的能力，其中Vc的能力明显高于花青素提取液，当浓度为 0.40mg/mL时，Vc和花青素的清除率分别为97.86±0.87％和61.56±1.12％。
如图9所示，一定浓度范围内(0.20-0.40mg/mL)，随着浓度的升高，Vc 和花青素对超氧阴离子的清除率逐渐升高，且Vc的清除率明显高于花青素提取液，当浓度为0.35mg/mL时，两者均达到最大，其最大清除率分别为 86.91±0.47％和62.57±1.38％。
本发明采用超声辅助双水相提取萝卜中花青素，通过单因素考察结合响应面进行优化，并通过体外抗氧化作用来评价花青素的活性。乙醇/硫酸铵双水相中由于小极性乙醇，强电解质的盐增加了介电常数，在超声波的作用下，硫酸铵瞬间激化，增加了超声波的穿透性，促进溶剂与目标分子的作用，花青素快速破壁渗入双水相中，由于两相性质差异，极性较小的花青素最终被分配到含醇量多的上相，实现提取和纯化的一步化，减少传统溶剂提取所带来的杂质，简化纯化步骤。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：对心里美萝卜清洗、自然晾干、去皮后切片烘干除去水分，干燥后粉碎过筛备用；
步骤2：建立乙醇/硫酸铵的双水相萃取体系；
步骤3：将步骤1中备用的萝卜粉末与乙醇/硫酸铵双水相萃取剂混合，进行超声提取得到花青素。
2.根据权利要求1所述的一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，步骤1的心里美萝卜清洗表面污垢后自然晾干，将萝卜肉和外皮分开后，萝卜肉切成薄片，放进烘箱烘干，待萝卜片烘干后采用粉粹机粉碎，萝卜粉末过80目筛，密封置于干燥皿备用。
3.根据权利要求1所述的一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，步骤2中所述的乙醇/硫酸铵的双水相萃取体系的pH为2-4。
4.根据权利要求1所述的一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，步骤2中乙醇的质量分数为27％，硫酸铵的质量分数为20％。
5.根据权利要求3所述的一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，步骤2中所述的乙醇/硫酸铵的双水相萃取体系的pH为3。
6.根据权利要求1所述的一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，步骤2中萝卜粉末与乙醇/硫酸铵双水相萃取剂按照1g：30mL的比例混合。
7.根据权利要求1所述的一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，步骤3中所述的超声提取的温度为49.78℃-50℃。
8.根据权利要求1所述的一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，步骤3中所述的超声提取的时间优选为24.08min-25min。
9.根据权利要求8所述的一种超声辅助双水相-响应面优化萃取心里美萝卜中花青素的方法，其特征在于，提取冷却后，以3500r/min转速离心5min，静置分相。
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