CN111051879B - 用于检测液体中污染物存在的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过分析保持昏睡状态的小的(0.1cm‑5cm)底栖水生大型无脊椎动物的运动行为来在线评估水溶液毒性的自主方法。

Description

用于检测液体中污染物存在的方法
技术领域
本发明涉及一种通过分析保持昏睡状态的小的(0.1cm-5cm)底栖水生大型无脊椎动物的运动行为来在线评估水溶液的毒性的自主方法。
背景技术
从环境保护和健康的角度来看，水资源的质量是一个主要的社会问题。为此，欧洲联盟成员国为自己制定了重要的指导方针，即处理废水(91/271/EEC)、限制优先控制物质进入环境(2013/39/EU)、从源头上减少污染物的进入并在整个领土实现水体的“良好状态”(WFD 2000/60/EC)。
虽然大部分城市和工业排放物经过了处理阶段，但是这些现在被设计成主要消除有机物质并限制与氮和磷的输入有关的水生环境的富营养化，这取决于接收水系统的敏感度。然而，排放仍然是污染物(微污染物)进入环境的重要载体(Cairns和Van Der Schalie，1980)，构成了今天废水处理管理人员的主要问题和保护环境和水资源的关键因素。
自1991年以来，欧洲城市废水处理指令(UWWT)确立了地方当局《监测废水收集系统和处理厂，以保持和核实其效率》的原则。法国立法最近的变化，特别是2015年7月21日的部级命令，要求在卫生系统层面采取自我评估的办法。当今，这些自我评估系统以精确采样(平均24小时)为依据，这使得不能够知道厂的动态操作。
由于预期会有更严格的立法，并且为了限制污染物进入环境，确实需要一种工具来分析公共和私人水管理人员在线排放的质量。除了监管方面，自我监测工具的开发将是一个真正的机会，可以完善管理人员对其排放的认识，特别是其随时间的演变，并实时表征其质量，以优化卫生系统的管理。
为了获得全面、可靠和对环境有意义的评估，选择了生态毒理学值。由于强烈的时间不均匀性和构成它们的大量分子，用目前的技术来对排放物进行表征的化学分析似乎很困难(Cairns和Van Der Van，1980；Sornom，2012)。此外，仅仅知道一些产品的浓度不足以产生有用的管理信息(Cairns和Van Der Schalie，1980年)，因此使用综合了所有环境因素和排放物中存在的污染物的生物活性部分的生物工具更有希望。此外，无需像目前Afnor标准化毒性试验那样进行点取样，即可在线评估排放质量，这将有可能避免目前生物评估的许多限制(点评估、样品在运输和储存过程中变性、响应时间长)。
使用生物工具，包括运动行为分析来评估排放物的毒性质量，是一个可靠且充分的解决方案，因为已知这种生物标志物无处不在，具有普遍性，而且响应时间非常短(Blaxter和Hallers–Tjabbes，1992；Hellou，2011)。该生物标志物特别是基于生物体的化学受体响应(Gerhardt，1996)。对运动行为的在线监测使得能够检测比常规致死性研究更低的污染物浓度(灵敏度提高10-1000倍)(Hellou等人，2008；Robinson，2009)，并在排放到自然环境中之前，以小的时间步进了解排放物的毒性。
使用水生大型生物来评估水生环境的持续毒性的想法不是新的。开始基于对鱼类的监测而开发装置(Henderson和Pickering，1963)，然后被改进以跟踪无脊椎动物，如钩虾(Gammarus)、纹石蚕(Hydropsyche)(Gerhardt，1996)、水蚤(Daphnia)(Ren等人，2007；Jeon等人，2008，Chevalier，2014)。所有这些工作都证实了在水中污染物的早期和敏感评估中使用运动活性的生物标志物的现实意义。既然现实意义的证明不再需要，有必要将工具的这个概念应用于废水的分析并使它们成为自主的。要做到这一点，必须克服重要的障碍，即设计一种能够在几周内同时对几个大型生物进行长期监测的装置，并且该装置适用于接收排放水(图1)。还需要开发一种适用于城市和工业排放的在线现场评估的有毒信号。后者必须检测低浓度污染物，同时排除暴露条件固有的混杂因素，即可能影响生物测定的运动行为的工业或城市场所(泵、人类活动、交通工具通行等)存在的振动和排放水中主要离子的物理化学组成的自然变化。
分析程序之一包括在整个暴露期间监测这些活的大型生物，以研究它们的行为，并在整个暴露期间连续推断测试介质的毒性。为此，将生物体布置在一个容器中，该容器的至少一个观察侧透明，并且通过与观察侧相对布置的成像仪通过观察侧获取容器的图像。
然而，在活生物体的情况下，对于活生物体对所考虑的潜在有毒排放物的暴露的反应，甚至它们不可避免的损失，存在一些不确定性。因此，有必要同时研究几个生物，并对结果进行统计处理，以消除这些危害。然而，将几个活生物体放在同一个容器中通常是不合适的，因为大型生物体可能相互干扰，这可能使监测结果的解释复杂化。
本发明方法的原理是基于大型生物在稳定和受控的观察条件下在其暴露之前的昏睡状态。这种昏睡在本文对应于观察到的物种的最小运动行为和营养活动的缺乏(运动的极度减少、觅食和进食行为的缺乏)。由于所用生物体的化学接受能力以及面对随后的化学压力时的回避行为，暴露环境中污染物的存在会导致从这种昏睡状态中退出。本发明的方法事先不需要对照液体。为了确保检测这种从昏睡状态退出的反应的可靠性，研究一批在生物特征方面同质的个体是有利的：在性别、大小、生殖状态方面标准化的个体，来自单一种群，优选在移植到观察室中之前在实验室饲养。生物在观察期内保持这种同质性也是必要的(无蜕皮、产卵、生长)。按照定义总是处于运动中并且缺乏运动就等同于死亡的生物(例如水蚤)无法达到这种昏睡状态。能够达到这种状态的生物是底栖水生大型无脊椎动物。
本发明的方法特别有利，因为它允许在2至30天的追踪中以自主的方式进行在线毒性评估，其中评估频率的时间步长小(2至120分钟)。
附图说明
图1：由Irstea–ViewPoint开发的毒性仪的照片
图2：电导率突然变化期间运动指数变化的记录图
图3：定期添加灭多威(methomyl)污染的溶液(100μg/L)期间3周内运动指数的变化
图4：在28天的时间内监测废水处理厂出口处处理过的水的毒性质量。
图5：钩虾(Gammarus fossarum)的照片(钩虾科(Gammaridae)的片脚类动物，8-30mm)
图6：被衣山蛭(Erpobdella testacea)的照片(环节动物门蛭亚纲(水蛭)，15-40mm)
图7：耳萝卜螺(Radix auricularia)的照片(有肺目腹足纲，6-30mm)
图8：斑马鱼盒(ZebraBox)的照片
定义
对于本发明的目的，“运动”是指空间位置的改变。这种变化可以用许多方式来表征，例如测量行进的距离、速度、旋转、整个身体或其一个部分(头部、腿部等)的方向变化。
对于本发明的目的，“行为”是指单位时间内的运动度量。
对于本发明的目的，昏睡是指一批个体的状态，其特征在于：
-平均行为(i)在至少6小时，优选12小时的时间内保持不变，并且(ii)与在观察该批个体的第一小时期间测量的行为相比，降低了至少60％，优选80％并且有利地90％，
-无营养活性。
对于本发明的目的，从昏睡中醒来是指在至少10分钟的时间内，一批个体的平均行为增加至少两倍。
对于本发明的目的，“饲养”是指将底栖水生大型无脊椎动物保持在受控条件下(pH、摄食、电导率、发光度)，以便使实验中使用的一批个体均质化(能量储备、生理状态)，并消除在收集过程中变弱的个体，并使它们适应未来的暴露条件。
对于本发明的目的，“运动指数”对应于根据研究环境(现场或实验室)在10％至80％的最低个体行进距离值上计算的平均距离。运动指数是这些最短距离的平均值。这个运动指数是根据可以在2到120分钟之间选择的积分时间步长计算的。行进距离的值在计算指数之前被平方，因此运动指数以mm2/单位时间表示。
对于本发明的目的，“污染物”是指能够在暴露的底栖水生大型无脊椎动物中引起回避行为的所有化学物质(植物保护产品、重金属、PAH、有机污染物质、药物残留等)。
具体实施方式
本发明涉及一种用于检测液体，优选水中污染物的存在的方法，其包括以下步骤：
a)将一批小的底栖水生大型无脊椎动物调节进入昏睡状态
b)将所述底栖水生大型无脊椎动物浸没在液体中，每个生物被单独隔离，
c)在暴露期间连续记录每个水生生物的行为；
d)通过处理装置分析行为数据，以确定所述底栖水生大型无脊椎动物的行为
e)基于所述底栖水生大型无脊椎动物的行为，确定有毒污染物的存在；
其特征在于，对数据的分析包括为所述底栖水生大型无脊椎动物的每一个物种确定代表该物种底栖水生大型无脊椎动物在给定时间段内的运动的平均行为，在观察期间，将底栖水生大型无脊椎动物置于其中毒性的不存在会导致整批底栖水生大型无脊椎动物保持昏睡状态的条件下，所述条件有利于维持所述底栖水生大型无脊椎动物的生命，并且包括在观察期间无食物供应，
并且其特征在于，毒性存在的确定包括将所述平均行为与昏睡状态的平均行为进行比较，当平均行为在至少10分钟内增加至少两倍时，确定毒性存在。
可以将底栖水生大型无脊椎动物置于没有刺激的适当条件下，以达到昏睡状态。本发明方法中使用的物种必须能够在隔离环境中，在恒定的光照条件和温度下，在没有食物供应，发育阶段(蜕皮、变态等)或生殖事件(产卵、无性生殖)无变化的情况下存活至少一周。
本发明的方法是特别有利的，因为它在至少两天，优选至少两周，特别优选30天的长时间内是自主的。
将每个底栖水生大型无脊椎动物在观察室内单独隔离，以确保来自一个个体的数据不会被一个或多个其他个体的存在所干扰，并通过大量重复确保可靠的评估。
有利地，在本发明的方法中包括并观察每种物种的至少12个底栖水生大型无脊椎动物，优选至少16个底栖水生大型无脊椎动物(图1)。
优选地，在步骤c)中，通过使用成像仪进行同步图像采集或通过阻抗测量来记录每个底栖水生大型无脊椎动物的行为(“Monitoring Behavioural Responses to Metalsin Gammarus pulex(L.)(Crustacea)with Impedance Conversion,Almut Gerhardt,Environ.Sci.和Pollut.Res.2(1),1995)。
连续对图像进行分析并计算运动指数，并实时在线传输(在网站上)。
优选地，根据本发明的方法在步骤a)之前进行如下步骤：选择底栖水生大型无脊椎动物，使得每个物种代表尽可能同质的生物种群：在性别、大小、繁殖状态、未被寄生方面标准化。有利的是，每个物种的个体来自单一种群。
还需要该生物种群保持其同质性：不蜕皮、不产卵、不进食。
所选择的底栖水生大型无脊椎动物的能量储备允许它们在没有食物供应的情况下，在根据本发明的方法的整个实施期间保持存活，优选至少一周，特别优选一个月。因此，图像采集不受液体中食物供应的干扰。水蚤不适应本发明的方法，因为它们不支持长期节食。
优选地，预先选择底栖水生大型无脊椎动物以代表在大小、性别和未被寄生方面同质的种群。
为了避免在液体中产生会干扰图像采集的幼仔，将优选在此过程中不会有幼仔的个体，例如非雌性或性不成熟的个体。
优选在此过程中不会变异的个体。
优选地，应在步骤b)之前饲养底栖水生大型无脊椎动物，以便使它们适应测量条件。
所述底栖水生大型无脊椎动物可以属于同一个物种或者选自几个物种，优选不同的系统发生顺序的物种，优选最多三个物种。
所述底栖水生大型无脊椎动物的尺寸小，优选小于5cm，优选小于2cm，特别优选小于1cm。
有利地，腹足纲、水蛭和/或甲壳纲是优选的。
优选地，所述腹足纲物种是萝卜螺属(Radix)，优选耳萝卜螺。
优选地，所述水蛭物种是棘蛭目(Arhynchobdellida)，优选为石蛭科(Erpobdellidae)，例如被衣山蛭。
优选地，所述甲壳纲物种是片脚类动物，优选钩虾科，例如钩虾。
有利地，在无污染物的本发明方法的物理化学条件下，所述底栖水生大型无脊椎动物在30天的节食中的存活率超过80％。
优选地，在步骤c)中每66毫秒(15赫兹)采集一次图像，并在20秒内积分。
实施例
在实施例中，仅示出了来自单个种群并在实验室中饲养了两周的在尺寸、性别、未被寄生方面标准化的底栖水生大型无脊椎动物。将底栖水生大型无脊椎动物放置在照相机监控下的笼子中，其中16个个体被单独放置在50mL体积的水中。
笼子由中性材料(聚丙烯)制成，且不使用有毒产品(无胶水)。将这些笼子(图1)连接到预鼓泡的、热调节的且过滤的液体供应源，然后在接收流速为6L/h的流出物的室内循环。
在暴露期(30天)期间，将底栖水生大型无脊椎动物暴露在有利于其维持的条件下(13±2℃，氧饱和且无捕食者)，并进行节食以使它们的行为同质化(所选择的底栖水生大型无脊椎动物的能量储备允许它们在这些条件下存活一个月)。
通过分析底栖水生大型无脊椎动物的逃逸行为来在线评估液体毒性的可能应用之一是分析处理结束时的城市或工业废水。该工具被设计为可运输的并在现场进行测量，以便进行实时且连续的评估。在污水处理厂进行了一项初步实验，目的是将可以通过激活底栖水生大型无脊椎动物而影响其行为并使毒性评估有偏差的所有可能的因素(泵振动、人类活动、交通工具通行等)纳入处理过的水的毒性的监测。此外，处理过的水随着时间的推移而具有自然的物理化学变化(取决于向集水区的排放、雨季、处理厂操作等)。为了测量这两个因素的影响，即现场干扰和物理化学变化，将三个毒性仪放置在与未污染的水相连的处理厂中9天。前2天让生物探针达到昏睡状态，其特征是不活动，这在本结果中没有显示。这两天之后，毒性监测开始。在第四天，将富含盐的溶液突然加入到毒性仪1和2中，以使电导率从400μS·cm–1分别变成1400和1900μS·cm–1。电导率的这些变化由电导率计连续测量。图2显示了三个毒性仪的追踪。由于厂的固有活动引起的振动干扰，每个毒性仪的运动指数在电导率强烈变化期间或整个实验期间没有变化。经验表明，所开发的毒性分析方法排除两个重要的混杂因素，即电导率随时间的变化和由于处理厂的活动引起的干扰的存在。因此，该工具和计算方法适用于在线评估处理过的水的毒性。
进行了一项实验以验证毒性仪对毒性的检测及其计算运动指数的方法。将三个毒性仪连接到未受污染的水中，然后毒性仪1在第1、2和3周接收一次20–24小时的污染事件，毒性仪2在第2和3周接收一次20–24小时的污染事件，毒性仪3作为对照，以确保生物探针的潜在激活不是因干扰(强烈振动)而产生的。污染事件对应于添加浓度为100μg·L–1的杀虫剂灭多威。选择高浓度是为了确保观察对选定底栖水生大型无脊椎动物的运动行为的影响(暴露48小时后，水蚤的LC50为28μg·L–1)。图3显示了三个追踪。据观察，监测方法可以在3小时内检测出产品的毒性，即使是在几次污染之后。值得注意的是，在污水处理厂出口环境中，这些浓度可能是典型的。
在确认了所开发的运动指数检测到了环境浓度下的污染物的毒性，并且对主要离子含量的变化不敏感后，监测了离开处理厂的水的毒性。将两个毒性仪在处理厂的排放物上串联，并且将一个与未受污染的水相连，以确保现场的对照条件。监控如图4所示。该监测表明，当毒性仪与处理出口处的水(浑浊的水，高TSS含量)相连时，所开发的装置允许在毒性仪中对底栖水生大型无脊椎动物的运动活性进行为期一个月的自主监测。对照在追踪中显示出恒定的且非常低的运动指数，对应于现场暴露的一批个体的昏睡状态的保持。相反，两个与该对照平行的连接到同一排放水的毒性仪同时检测到两次从昏睡状态退出的事件，追踪流出物毒性质量的降低；第一次是在2016年10月7日上午11:30到下午4:30，第二次是在2016年10月10日上午10:00到下午12:30。因此，所开发的工具和方法允许通过分析底栖水生大型无脊椎动物的逃逸行为，以自主方式在线监测水溶液的毒性质量。
该评估的步骤依次是物种的选择、收集、饲养两周、分选(标准化)、装笼、将毒性仪放入流出物中以及对底栖水生大型无脊椎动物的运动行为进行连续的单独分析。
实施例1：底栖水生大型无脊椎动物的物种选择、收集、饲养及分选
I.材料
-物种选择：鱼网、筛柱、聚乙烯桶、用于在16升水族箱中在13℃下饲养的设施。
-收集：鱼网、具有1.6mm、2mm、2.5mm网格的真空筛柱和筛网、聚乙烯桶。
-饲养：用于在16升水族箱中在13℃下饲养的设施。
-分选：光台；透明的Pyrex培养皿；网格；抄网；聚丙烯桶(食品桶型)，聚苯乙烯板。
II.方法
II.1.物种选择
物种选择是关键步骤，因为它直接影响毒性评估的现实意义。在实验室中测试的物种库中验证的选择标准及其理由如下：
-物种的分布区域与研究地点之间具有对应关系，以便在发生事故的情况下不会将生物污染带入水生环境中。
-全年大量存在于环境中，使得其在任何给定时间不受生物库的限制。
-在节食时可以存活超过30天，因为毒性仪旨在在一个月内保持独立，并且食物供应的存在将改变视频跟踪的质量。
-不同的系统发生顺序，代表河岸生物多样性，并对污染物的存在敏感。通过增加物种多样性，对污染物的灵敏度谱更大，具有不同的灵敏度。使用该毒性仪的评估是有意义的，因为它具有环境代表性。
-可以连续地并随时间测量行为，以便获得在线诊断并在出现问题时迅速通知管理人员。
-一种物种水平放置，其他两种物种垂直放置，以优化毒性仪(30cm立方体)中的空间。
-易于处理、可运输和可堆叠，使得安装保持容易。
在欧洲被选择用于排放物的毒性评估的底栖水生大型无脊椎动物是钩虾(图5)，将其放置在水平笼子中，被衣山蛭(图6)和耳萝卜螺(图7)，将它们放置在垂直笼子中。
II.2.底栖水生大型无脊椎动物的收集
底栖水生大型无脊椎动物来自全年具有高密度的来源种群。在所开发的实施例中，这些生物体来自Ain省Saint-Maurice-de-Remens镇的前Bugey豆瓣菜田，该地区被定义为收集站。
在每个物种的不同生境中使用稳态干扰进行收集。
然后将在湍流底部收集的样品置于1.60mm、2.00mm、2.50mm网格的真空筛柱和筛网上。然后使用桶在筛柱上冲洗，然后直接在河中冲洗。底栖水生大型无脊椎动物被包含在多种筛子中。
根据所需底栖水生大型无脊椎动物的数量，重复进行多次此操作。
II.3.在植入毒性仪中之前饲养底栖水生大型无脊椎动物
在饲养之前，将每个物种与其它的底栖水生大型无脊椎动物、植物碎片和矿物质分离。然后将它们放置在含有现场水的16L的水族箱中，所述现场水用新鲜的井眼水进行滴水更新(体积每天更新四次)，该井眼水电导率为450μS·cm–1，并通过连续鼓泡进行充氧。将水族箱放在温度调节为13±1℃的水浴中，每天暴露于14小时白天/10小时夜晚的光周期中。自由采食，并且建议的饲养时间为两周。饲养的目的是消除在收集过程中变弱的底栖水生大型无脊椎动物，以确保所使用的底栖水生大型无脊椎动物具有一定的“生理同质性”，而与季节无关(能量储备、行为活动速率例如运动、进食)，并使他们适应未来的暴露条件。饲养水的特征如下：温度＝13±1℃；电导率＝450±50μS·cm–1；pH＝7.6±0.2；光周期＝14小时白天/10小时夜晚。在毒性仪中安装之前的最后两天，将底栖水生大型无脊椎动物放在黑暗中。
II.4.底栖水生大型无脊椎动物的分选(标准化)
底栖水生大型无脊椎动物的制备在暴露前几天在实验室中完成。底栖水生大型无脊椎动物是雄性的(对于钩虾属、萝卜螺属和水蛭，是雌雄同体的)，没有被寄生，并且每个物种的大小均一。分选是在光台上用来自饲养介质的水进行的。用肉眼进行性别鉴定。分离底栖水生大型无脊椎动物并将其与适当的食物一起放入聚丙烯(一种没有毒性作用的材料)笼中。
使用网格，根据每个物种的大小、性别和未被寄生标准对底栖水生大型无脊椎动物进行分选，然后转移到第二个培养皿中。只有那些刚蜕皮的钩虾才能加入毒性仪，以避免由于蜕皮而引起的激活。
步骤2：建立实验
应在研究地点安装设施，以监测底栖水生大型无脊椎动物的运动行为。将底栖水生大型无脊椎动物分别放置在单元格中，以监测底栖水生大型无脊椎动物的运动行为。毒性仪或
Figure BDA0002391355360000125
(图8)(Viewpoint，http://www.viewpoint.fr/en/p/equipment/ zebrabox)适用于这种监测。
将要测试的溶液进行预过滤(<500μm)、鼓泡并进行温度调节。
将毒性仪或
Figure BDA0002391355360000126
单元连接到要测试的溶液，并在生物探针和测量工具(毒性仪或
Figure BDA0002391355360000127
)的电源安装后48小时开始对毒性质量进行在线评估。
每台
Figure BDA0002391355360000128
均配备一台摄像机，毒性仪配备三台摄像机(每侧一台)。
摄像机连续拍摄底栖水生大型无脊椎动物的个体运动。
计算机处理图像并实时计算运动指数。
每2至120分钟可以进行一次毒性质量评估。
在线毒性评估是自动进行的，可以持续2到30天。
连接到互联网的计算机可以在网站上实时传达结果。
如果检测到毒性，则可以通知负责工具操作的人员(SMS、电子邮件等)。
在非连接的情况下，数据存储在SD卡中。

Claims (23)

1.用于检测液体中污染物的存在的方法，其包括以下步骤：
a)将一批选自腹足纲动物、水蛭和/或甲壳纲动物的小于2cm的小的底栖水生大型无脊椎动物调节进入昏睡状态
b)将所述底栖水生大型无脊椎动物浸没在所述液体中，每个生物被单独隔离，
c)在暴露期间连续记录每个水生生物的行为；
d)通过处理装置分析行为数据，以确定所述底栖水生大型无脊椎动物的行为
e)基于所述底栖水生大型无脊椎动物的行为，确定有毒污染物的存在；
其特征在于，对数据的分析包括为所述底栖水生大型无脊椎动物的每一个物种确定代表该物种底栖水生大型无脊椎动物在给定时间段内的运动的平均行为，在观察期间，将底栖水生大型无脊椎动物置于其中毒性的不存在会导致整批底栖水生大型无脊椎动物保持昏睡状态的条件下，所述条件有利于维持所述底栖水生大型无脊椎动物的生命，并且包括在观察期间无食物供应，
其特征在于，毒性存在的确定包括将所述平均行为与昏睡状态的平均行为进行比较，当平均行为在至少10分钟内增加至少两倍时，确定毒性存在，
并且其特征在于，所述底栖水生大型无脊椎动物被调节进入具有如下特征的昏睡状态：
-平均行为(i)在至少6小时的时间内保持不变，并且(ii)与在观察该批个体的第一小时期间测量的行为相比，降低了至少60％，
-无营养活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其用于检测水中污染物的存在。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底栖水生大型无脊椎动物被调节进入具有如下特征的昏睡状态：
-平均行为(i)在至少12小时的时间内保持不变，并且(ii)与在观察该批个体的第一小时期间测量的行为相比，降低了至少80％，
-无营养活性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)之前进行如下步骤：选择底栖水生大型无脊椎动物，使得每个物种代表尽可能同质的生物种群：在性别、大小、生殖状态、未被寄生方面标准化。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所使用的物种必须能够在隔离环境中，在恒定的光照条件和温度下，在没有食物供应，发育阶段或生殖事件无变化的情况下存活至少一周。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，通过使用成像仪进行同步图像采集来记录每个水生生物的行为。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述底栖水生大型无脊椎动物选自一种或多种不同系统发生顺序的物种。
8.根据权利要求7所述的方法，所述底栖水生大型无脊椎动物选自一个到三个物种。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述底栖水生大型无脊椎动物小于1cm。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述方法中包括并观察至少12个底栖水生大型无脊椎动物物种。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述底栖水生大型无脊椎动物是非雌性或性不成熟的个体。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述腹足纲动物是萝卜螺属。
13.根据权利要求12所述的方法，所述腹足纲动物是耳萝卜螺。
14.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述水蛭是棘蛭目。
15.根据权利要求14所述的方法，所述水蛭是石蛭科。
16.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述甲壳纲动物是片脚类动物。
17.根据权利要求16所述的方法，所述甲壳纲动物是钩虾科。
18.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其在步骤a)之前包括如下步骤：选择底栖水生大型无脊椎动物，以使每个物种代表在大小、性别和未被寄生方面同质的种群。
19.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，底栖水生大型无脊椎动物的每个物种都来自单个种群。
20.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，在步骤b)之前具有如下步骤：饲养所述底栖水生大型无脊椎动物，以使其适应测量条件。
21.根据权利要求20所述的方法，其中饲养步骤是指将底栖水生大型无脊椎动物保持在在pH、摄食、电导率和发光度方面受控的条件下，以便使实验中使用的一批个体均质化，并消除在收集过程中变弱的个体，并使它们适应未来的暴露条件。
22.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述底栖水生大型无脊椎动物不是雌性底栖水生大型无脊椎动物。
23.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，所述底栖水生大型无脊椎动物在节食30天时的存活率超过80％。
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