CN111033249B - 用于监测体脂肪降解的电化学条带及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对作为诸如食物或体育锻炼等外部参数的函数的代谢变化的个人化监测的领域。更具体地，本发明涉及用于确定脂肪代谢的生物标志物、特别是甘油的量的电化学条带。

Description

用于监测体脂肪降解的电化学条带及其制备方法
本发明涉及对作为诸如饮食或体育锻炼等外部参数的函数的代谢变化的个人化监测的领域。更具体地，本发明涉及用于测定脂肪代谢的生物标志物、特别是甘油的量的电化学条带。
个体的体脂肪量根据不同的参数而变化，特别是根据他(她)的饮食和体育活动而变化。现在已经很好地确立了这两个参数对脂肪量的影响。因此，能够评估这些参数的影响可能会令寻求减少脂肪量的人感兴趣。对个体的新陈代谢的更好的认知将使其能够确定饮食和锻炼的最佳组合以减轻体重。
为了了解外部参数对人体脂肪量的直接影响，可以追踪反映脂肪降解的生物标志物的演化。已经描述了与脂解(lipolysis)有关的各种生物标志物，例如酮、游离脂肪酸和甘油。
甘油是受关注的标志物，因为其在血液中的量直接反映着脂解。因此，通过分析循环甘油的量，我们可以随时了解人体是否在利用其脂肪储备，并评估脂解水平。监测甘油循环量可提供有关身体的脂肪降解的实时信息。因此，测量希望减轻体重的个体的脂解水平可提供有关其饮食和/或体育锻炼的有效性的信息。分析循环甘油的量还可以在早期阶段检测恶病质(不可逆的体重减轻)并在治疗期间监测其演变，尤其是在患有癌症的个体中；实际上，在这些患者中，高脂解是恶病质的标志物(Ebadi和Mazurak，2015年，Mediators ofinflammation)。
因此，一种易于使用、可靠且可获取的监测脂肪量演化的手段将特别令人感兴趣。
现有技术
在申请WO2016/178823中描述了一种用于检测和量化血液中的酮的系统。该文献描述了通过羟基丁酸脱氢酶和NAD的存在来监测循环酮水平的电化学测试条带。这些条带具有允许同时量化酮和葡萄糖的特殊性，适用于监测糖尿病患者的血糖紊乱。
在申请US2004/0043376中描述了用于在节食期间测量脂肪损失的条带。这些条带允许通过比色法监测血浆样品中的循环酮。但是，该系统不适用于全血检测。对获得血浆的需求涉及到在实验室中处理样品。另一方面，电化学测试条带可商购以量化酮并因此监测酮症。
全血糖检测系统可用于监测糖尿病患者的血糖水平。这些系统基于电化学测试条带的使用和通过安培法对血液中存在的葡萄糖量的分析。这种条带是公知的并且例如在专利申请EP2812444和WO200042422中进行了描述。
虽然酮的量被认为指示着脂肪损失，但它不是可靠的标志物。因此，需要一种基于与脂解紧密相关的标志物来监测脂肪降解的系统。
本发明的优点
本发明提供了用于对血液中的甘油进行量化的电化学测试条带。
循环甘油是脂质降解的直接结果，反映了体脂肪降解的代谢。因此，它是监测脂肪降解的特别相关的生物标志物。
本发明的测试条带使个人能够使用便携式装置在没有科学装置的情况下进行自我测试。由于结果通过简单阅读获得，因此无需任何特殊知识即可进行分析。
有赖于本发明，可以以简单和个人化的方式建立所消耗的食物(遵循的饮食)与其对脂肪代谢的影响之间的相关性。类似地，例如可以根据体育活动的强度和/或持续时间来获得与体育活动的相关性。因此，本发明提供了一种简单和创新的方式来鉴定出饮食和体育活动的最佳组合以减轻体重并实现个人的目标。所述装置可以连接到智能手机或其他IT支持上可用的应用程序，以有助于随时间推移进行数据记录、分析和监测。本发明还使得可以在监测与疾病相关的恶病质的情况下、特别是在癌症患者中监测脂肪降解。
有赖于与诸如专利申请WO2016/097615中所描述的读取装置相关联的电化学条带，个人可以获得关于燃烧的脂肪量的实时信息。这种分析可以在体育运动后立即进行，也可以在饮食开始几小时后进行。
具体实施方式
本发明的第一目的涉及一种用于检测体液样品中的甘油的电化学测试条带，其包含：
-电绝缘基板层
-至少两个电极，从而具有工作电极、参比电极和对电极，在两电极条带构造中，参比电极和对电极的功能由同一个电极执行
-至少与电极数量一样多的电轨道
-含有甘油特异性酶的酶层，所述甘油特异性酶选自(i)甘油激酶和甘油磷酸氧化酶，或(ii)甘油脱氢酶，所述酶层被设置在所述电极上
-辅因子层，其中(i)当所述酶是甘油激酶和甘油磷酸氧化酶时，所述辅因子选自三磷酸腺苷(ATP)和氯化镁(MgCl2)，或(ii)当该酶为甘油脱氢酶时，所述辅因子选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，
-至少一个膜层
-处于电极和顶层之间的间隔层，所述间隔层产生限定测量室容积的空间
-用于接收样品的测量室，所述测量室至少部分地覆盖所述电极和所述酶层
-顶层。
该条带的使用原理如下：将生物流体样品沉积在测量室中，这在基板层和顶层之间的空间中直接进行或者经由顶层上的缺口(当存在时)进行。样品与工作电极的接触由于原位存在的酶而引起电化学反应。
为了使用测试条带，首先将其插入装有电流计的特定读取器中；将后者连接到例如在诸如智能电话等移动电话上可用的应用程序，其能够解读与由电化学反应产生的微电流相对应的信号。然后，该应用程序将结果提供给用户。
生物流体样品可以是任何可能含有甘油的样品，包括唾液、汗液、泪液、血液等的样品。在优选的处理方式中，生物流体样品是血液样品。要施加到测试条带上的血滴的体积通常在0.3至5微升之间。
基板层提供支撑功能。基板层的材料可以选自电绝缘材料。它可以是塑性材料，例如聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚酯、聚酰亚胺、聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯等，也可以是其他材料，例如金属、陶瓷、复合材料。当基板层不是由绝缘材料制成时，其被绝缘层覆盖。这样的基板层可以由钝化铝制成。因此，在本发明的意义上，“电绝缘基板层”是指由电绝缘材料制成的基板层，或者当该基板层不是由绝缘材料制成时，是指被电绝缘膜覆盖的基板层。
基板的形状可以有所变化，例如矩形、三角形、带缺口或圆形末端的复杂形状。
典型地，一个电化学条带具有3个电极，每个电极起着确定的作用。第一电极称为“工作电极”，用于测量酶促反应的产物，无论产物是氧化产物还是还原产物。第二电极，即所谓的“参比电极”，用于设定参比电势(用于在该电极和工作电极之间进行的测量的电势差)。第三电极称为“对电极”，用于补偿电解质溶液(即样品)和工作电极之间交换的电荷。测量期间所测得的电流是在工作电极和所述对电极之间测量的。
可以添加其他电极来支持其他特征，例如检测测试条带是否插入仪表、检测测量室的填充等。
本发明的条带包括至少2个电极，但是也可以包含3、4、5个以上的电极，这取决于条带的构造及其执行的功能。如果测试条带只有两个电极，则参比电极和对电极的功能由同一个电极执行。如果测试条带具有3个电极，则这些电极优选对应于工作电极、参比电极和对电极。
电极的形状不受约束；例如，其可以是矩形的，并且与生物流体样品的接触表面为0.5mm2至2mm2。
工作电极优选地由碳或铂制成，但是也可以由其他金属、金属合金或导电聚合物制成。
在特定实施方式中，工作电极由铂制成。优选地，这种电极未被功能化。
在另一个具体实施方式中，工作电极由碳制成并且通过添加普鲁士蓝来功能化。或者，可以将其他催化剂施加到工作电极上，例如铁/亚铁氰化物离子、锇络合物、二茂铁或其衍生物之一如二茂铁-甲醇、氧化还原聚合物(聚苯胺型、聚吡咯型、聚二茂铁型氧化还原聚合物)、四甲基联苯胺。
在优选的实施方式中，电极由碳制成并且通过添加二茂铁甲醇而功能化。
参比电极优选包含银或氯化银，但是也可以用其他金属氧化物或盐(特别是银)或者用氧化还原聚合物(特别是聚二茂铁)制成。
对电极可以由任何合适的导电材料制成，例如碳、铂、银或任何其他金属或其他导电材料。
所述条带具有至少等于电极数量(即至少两个)的电轨道的数量。测试条带可以具有未与电极连接的轨道；例如，未与电极连接的轨道可用于允许仪表检测测试条带。电轨道优选地由碳制成，但是也可以由诸如银或铜等金属制成。其宽度可以为0.1mm至1mm，并且其长度必须足以将连接器连接到电极。
条带上的酶层必须对要检测的生物标志物(即甘油)具有特异性。由于酶的催化特性，一旦与甘油接触，酶就会对其进行改性。通过检测电极上的微电流，这种改性可以揭示改性的甘油或甘油副产物的存在，而且还可以量化样品中存在的甘油。酶层至少施加到工作电极上，但是也可以施加在整个电极表面上。
在第一实施方式中，选择用于揭示甘油存在的酶是甘油激酶和甘油磷酸氧化酶。任选地，条带还可包含过氧化物酶。
在一个具体实施方式中，含有甘油激酶和甘油磷酸氧化酶的酶层也含有过氧化物酶。在另一个具体实施方式中，过氧化物酶可以包含在单独的层中。
在第二实施方式中，选择用于揭示甘油存在的酶是甘油脱氢酶。任选地，条带还包含黄递酶。
在一个具体实施方式中，含有甘油脱氢酶的酶层也含有黄递酶。在另一个具体实施方式中，黄递酶可以包含在单独的层中。
条带还包含与选择的特定甘油酶协同作用的辅因子。
当酶是甘油激酶和甘油磷酸氧化酶时，辅因子是三磷酸腺苷(ATP)和氯化镁(MgCl2)。当酶是甘油脱氢酶时，辅因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。
酶层和辅因子层在工作电极上的堆叠构成“敏感层”。该敏感层允许检测甘油。它必须位于基板层和顶层之间，但其内部布置可能会有所不同。特别地，酶层和辅因子层的顺序可以变化。另一方面，如上所述，酶层和辅因子层可以是不同的或包括在同一层中。在不影响测试条带的功能的情况下，敏感层可以仅施加到工作电极上，也可以与测量室相同大小。
敏感层不包括工作电极。然而，当其被功能化时，工作电极参与反应，因此可以认为属于敏感层。
本发明的敏感层还包含膜层。该膜层可以具有不同的功能，例如将其他成分保持在电极附近、阻挡干扰物(过滤)、用氧富集该层等，并且可以在同一敏感层中添加若干膜层。根据期望的功能，这种层可以由不同的材料制成。优选添加壳聚糖膜层，尤其是为了维持表面酶，但也可以选择
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羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸纤维素、聚(4-乙烯基吡啶)膜等的层。
在一个优选的实施方式中，除了酶和辅因子外，敏感层还包含含有戊二醛的壳聚糖膜。
在另一个优选的实施方式中，除酶和辅因子外，敏感层还包含羟丙基甲基纤维素膜。
在一个具体实施方式中，敏感层可以包含表面活性剂。其可以以不同水平添加。表面活性剂可用于修改电极或基板的表面电压性质，以将样品引导到电极上，或更通常地用于改善沉积过程。它们也可用于在沉积过程中提高组分的溶解度。作为实例，此类表面活性剂可以选自十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X-100等。
在一个优选的实施方式中，敏感层包含表面活性剂。特别优选的表面活性剂是Triton X-100。
在高度优选的实施方式中，敏感层包含酶(甘油激酶、甘油磷酸氧化酶和过氧化物酶)、辅因子ATP和MgCl2、羟丙基甲基纤维素、二茂铁甲醇和表面活性剂。该敏感层可以以包含敏感层的所有组分的单个层沉积。
在另一个具体实施方式中，敏感层可以包含交联剂(允许进行交联)。优选在沉积时将它们添加到膜层中。根据期望的效果，它们也可以与酶层或辅因子层一起施用，或者在酶层或辅因子层之间施用，以及在酶层与辅因子层之间或在酶层或膜之间施用。优选的交联剂是戊二醛，但是可以使用诸如PEDGE(聚乙二醇二缩水甘油醚)、EDC/NHS(盐酸化1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)之类的其他交联剂。
因此，除了酶、辅因子、膜层和表面活性剂之外，敏感层还可包含至少一种交联剂。
在具体实施方式中，敏感层包含普鲁士蓝、酶(甘油激酶和甘油磷酸氧化酶)、辅因子ATP和MgCl2、壳聚糖膜层和作为交联剂的戊二醛。
在另一具体实施方式中，敏感层不包含普鲁士蓝，但是包含酶(甘油激酶和甘油磷酸氧化酶)、辅因子ATP和MgCl2和羟丙基甲基纤维素的膜层。它还可包含过氧化物酶、二茂铁甲醇和表面活性剂。
图3示出了构成敏感层的不同层的堆叠的示例，换句话说，这些层的功能布置允许检测测量室中甘油的存在。
在电极和顶层之间施加间隔层，所述间隔层形成限定测量室容积的空间。此外，该间隔层使电极绝缘。
在具体实施方式中，暴露于样品的电极表面可以由布置在电极和间隔层之间的附加的薄绝缘层限定。
该间隔层可以由电绝缘材料(例如塑料或陶瓷)组成，也可以由覆盖有薄绝缘层的非绝缘材料组成。它的形状将大致等同于基板层的形状，减去对应于测量室的部分。在一个具体实施方式中，可以在测试条带的边缘和测量室之间形成通道，以允许样品通过毛细作用向测量室移动。
最后，顶层将条带覆盖。其界定测量室的上部，并保护测试条带的所有层。其可能有一个开口或缺口，以利于样品的沉积。其还可包含通风孔。其可以用例如聚合物等任何合适的材料制成，并且优选厚度在数十微米量级。
图4示出了本发明的条带的示例性示意图。
作为指示，电化学条带的尺寸通常在0.5至1cm宽，3至5cm长，0.05至0.5mm厚的量级。其必须具有足够的刚性才能插入阅读器中。
本发明的第二个目的涉及一种制备本发明的电化学条带的方法，该方法包括沉积以下要素的步骤：
-电绝缘基板层
-至少两个电极
-至少与电极数量一样多的电轨道
-含有甘油特异性酶的酶层，
·甘油激酶和甘油磷酸氧化酶，或
·甘油脱氢酶，所述酶层沉积在电极上，或
-包含辅因子的层，其中
·当酶为甘油激酶和甘油磷酸氧化酶时，所述辅因子选自三磷酸腺苷(ATP)和MgCl2，
·当酶为甘油脱氢酶时，所述辅因子选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)
-至少一个膜层
-位于电极和顶层之间的间隔层，
-顶层，所述顶层可被缺口穿透以有助于样品的沉积。
在优选的实施方式中，通过丝网印刷来沉积电轨道。它们也可以通过雕刻、光刻或本领域技术人员已知的任何其他技术来沉积。
在一个具体实施方式中，将酶、辅因子和膜层沉积(滴铸)然后干燥，但是它们也可以通过喷墨印刷、喷雾、浸渍-收缩等施涂。可以将酶和辅因子沉积在两个分开的层中或同时沉积在单个层中。在优选的条带实施方式中，酶、辅因子和膜包含在单个层中。当通过添加二茂铁甲醇使碳电极功能化时，可以在沉积敏感层之前将二茂铁甲醇直接添加到工作电极中。然而，在优选的实施方式中，当敏感层的所有组分同时沉积在单个层中时，可以通过将其添加到敏感层的溶液中而同时添加。因此，要沉积在电极上的所有组分都沉积在单个层中。
制备本发明的条带的方法还可以包括沉积额外的酶的层。这些额外的酶可以与甘油特异性酶一起沉积在单个层中，也可以沉积在分开的层中。在敏感层包含另外的酶的情况下，(全部)酶可以先后沉积在一起，或者通过在(基本)酶和额外的酶之间沉积辅因子层来沉积。在一个优选的实施方式中，额外的酶首先直接沉积在电极上。但是，当敏感层经一次沉积并包含所有组分时，所述额外的酶与其他组分同时添加。
当甘油中的特定酶是甘油激酶和甘油磷酸氧化酶时，额外的酶是过氧化物酶。
当甘油中的特定酶是甘油脱氢酶时，额外的酶是黄递酶。
当工作电极由碳制成时，其可以通过添加选自例如普鲁士蓝、铁/亚铁氰化物离子、锇络合物、二茂铁或其衍生物之一(例如二茂铁-甲醇)、氧化还原聚合物(聚苯胺型、聚吡咯型、聚二茂铁型氧化还原聚合物)、四甲基联苯胺的溶液来功能化。例如，当通过添加普鲁士蓝溶液使电极功能化时，则随后沉积该溶液，然后在高温(例如80℃至100℃)活化，然后用诸如水、有机溶剂或缓冲溶液等溶液漂洗，然后干燥。当通过添加二茂铁或其衍生物之一的溶液使电极功能化时，则沉积该溶液，然后在40℃干燥5分钟。也可以使用本领域技术人员已知的其他技术，包括无漂洗技术或其他技术例如喷墨、喷涂、电沉积印刷等。
当交联剂被添加到条带层时，它们在沉积时优先被添加到膜层。然而，交联剂也可以与酶层或辅因子层一起施加，或在酶层或辅因子层之间施加。当将酶、辅因子和膜添加到单个层中时，可以同时沉积交联剂。
酶层、辅因子层和膜层的沉积构成了条带的敏感层。在实施本发明的特定方式中，可以将额外的层添加到敏感层，例如额外的酶层、至少一种交联剂和至少一种表面活性剂。上文已经描述了这些层彼此的布置以及在一个层中同时沉积几种组分的可能性，其适用于本制备方法。
在用于制备本发明的条带的方法的优选实施方式中，敏感层的要素的沉积在单个步骤中进行。因此，可以同时添加以下物质：
-酶(甘油激酶和甘油磷酸氧化酶)、辅因子ATP和MgCl2和羟丙基甲基纤维素膜层；
-酶(甘油激酶和甘油磷酸氧化酶)、辅因子ATP和MgCl2和羟丙基甲基纤维素膜层；
-酶(甘油激酶、甘油磷酸氧化酶和过氧化物酶)、辅因子ATP和MgCl2、羟丙基甲基纤维素膜；
-酶(甘油激酶，甘油磷酸氧化酶和过氧化物酶)，辅因子ATP和MgCl2、羟丙基甲基纤维素膜、二茂铁-甲醇。
本发明的第三目的涉及本发明的电化学测试条带用于由生物流体样品评估个体中的脂解的用途。
实际上，本发明的电化学条带含有用于检测和量化血糖中存在的甘油的酶。
本发明的第四目的涉及一种用于评估个体中脂肪降解的方法，该方法包括：
-将条带插入带有电流计的仪表中
-采集血滴
-将所述血滴放置在本发明的电化学条带上
-等待电流计读取器执行电化学测量
-直接从仪表读取或从与仪表连接的装置远程读取显示的结果。
该评估脂肪降解的方法还可包括以下步骤：通过将测得的脂肪降解与所摄取的营养物质和/或进行的体育锻炼类型相关联来优化个体的脂肪损失。因此，使用者可以推断出所摄取的食物和/或进行的体育锻炼对脂肪量降低的影响，并且这使得其可以根据获得的结果来适应其行为。也可以使用适合的应用程序处理此类信息，该应用程序将向用户指导最有益于脂肪降解的饮食行为和/或体育锻炼类型。
这种评估方法还可以监测恶病质，特别是在患有癌症的患者中。
适用于这种类型方法的仪表是一种包括电流计的装置，该仪表能够恢复由条带发出的电化学信号并将其传输以解读至内部系统或仪表或者远程连接的装置。
专利申请WO2016/097615中描述了适用于这种用途的读取器的实例和监测体脂肪量变化的方法。
为了实现本发明的条带，各种实施方式可以彼此组合，特别是优选的实施方式。
通过阅读以下实施例将更好地理解本发明，这些实施例是通过举例的方式提供的，绝不应认为其是对本发明范围的限制。
附图说明
图1：图1是用于量化甘油的酶促反应的示意图，其涉及甘油激酶和甘油磷酸氧化酶以及任选的过氧化物酶。
图2：图2是用于量化甘油的酶促反应的示意图，其涉及甘油脱氢酶和任选的黄递酶。
图3：图3是位于测量室中并适于量化脂解的敏感层堆叠的示意图。
图4：图4是用于检测甘油的电化学测试条带的图示。
图5：图5是取自添加了不同浓度的甘油的血液样品的安培计测量结果的图示(正方形：0μM；圆形：150μM；三角形：300μM；十字形：500μM；菱形：700μM，即从顶部至底部读取)。
图6：图6是从图5所示的测量中获得的电流随添加到样品中的甘油浓度变化的图示。还显示了通过线性回归获得的校准线。
图7：图7显示了可以显示给用户的视觉效果的两个示例。在图7(A)的显示中，显示了立即执行的测量结果以及与此结果相关的注释。在图7(B)的显示上，显示了根据测量结果和/或用户先前进行的测量对不同类型的体育活动的分级。
实施例
实施例1：用于检测甘油的电化学测试条带的制备
a.通过连续沉积敏感层组分的不同层而产生的条带
在臭氧存在下用紫外光预处理15分钟的聚酰亚胺基板层上，用碳墨水丝网印刷第一层，以沉积工作电极和2条电轨道，工作电极与一条电轨道邻接。然后将该条带在120℃的烘箱中干燥10分钟。
然后用银墨水丝网印刷第二层，以沉积参比电极(也充当对电极)，该参比电极与第二电轨道邻接。然后将该条带在120℃的烘箱中干燥10分钟。
然后用绝缘墨水丝网印刷第三层，以部分覆盖电轨道和电极，使电轨道的一部分保持自由状态以便将条带连接到读取器，并使每个电极的一部分保持自由，从而工作电极的未覆盖部分的面积为1.25mm2，而参比电极的未覆盖部分的面积为1mm2。然后将该条带在120℃的烘箱中干燥10分钟。
以下沉积物仅应用于工作电极的未覆盖部分。
首先，将在1μL的乙醇/水混合物(体积比为30/70)中的0.2g/L普鲁士蓝沉积在电极上，然后将条带在100℃烘箱干燥5分钟。
然后进行电化学测试，包括在工作电极和第二电极之间施加-0.2V的电位差30s，并滴入一滴磷酸盐缓冲溶液，使普鲁士蓝被还原为普鲁士白，同时通过30秒后测量的电流值(阈值-200nA)控制条带的质量。
然后将1μL的9mM ATP(三磷酸腺苷)和9mM MgCl2(氯化镁)的混合物沉积在电极上(即每种化合物9nmol)，并将电极在40℃在强制对流温育箱中干燥5分钟。
然后将1μL的1.5U/μL的甘油激酶(GK)和0.5U/μL的甘油磷酸氧化酶(GPO)的混合物沉积在电极上(即1.5U GK+0.5U GPO)，并将电极在40℃在强制对流温育箱中干燥3分30秒。
然后将1μL的0.5％壳聚糖和0.0025％戊二醛的0.5％乙酸溶液的混合物沉积在电极上，并将电极在强制对流温育箱中于40℃干燥4分钟。
普鲁士蓝、辅因子(ATP+MgCl2)、酶(GK+GPO)、膜层(壳聚糖)和交联剂(戊二醛)构成敏感层。
通过压力在整个先前丝网印刷的绝缘层上覆盖一层双面粘合剂(将其完全覆盖)。该层厚0.25mm。该层在电极上未覆盖的空间构成了测量室(因此，其包含两个未被绝缘膜覆盖的电极)。
然后将一层聚对苯二甲酸乙二酯(PET)保护膜压到条带上并用作顶层。其完全覆盖了双面粘合剂层以及由测量室形成的空间(不与电极接触)。
然后将由此制造的条带在4℃暗处存储。
b.通过单层沉积敏感层的不同成分产生的条带
在臭氧存在下用紫外光预处理15分钟的聚酰亚胺基板层上，用碳墨水丝网印刷第一层，以沉积工作电极和2条电轨道，工作电极与一条电轨道邻接。然后将该条带在120℃的烘箱中干燥10分钟。
然后用银墨水丝网印刷第二层，以沉积参比电极(也充当对电极)，该参比电极与第二电轨道邻接。然后将该条带在120℃的烘箱中干燥10分钟。
然后用绝缘墨水丝网印刷第三层，以部分覆盖电轨道和电极，使电轨道的一部分保持自由状态以便将条带连接到读取器，并使每个电极的一部分保持自由，从而工作电极的未覆盖部分的面积为1.25mm2，而参比电极的未覆盖部分的面积为1mm2。然后将该条带在120℃的烘箱中干燥10分钟。
以下沉积物仅应用于工作电极的未覆盖部分。1.5μL的含1.5mM二茂铁甲醇、1U/μL甘油激酶，0.33U/μL甘油磷酸氧化酶，1U/μL过氧化物酶、27mM ATP、27mMMgCl2、0.25％羟丙基甲基纤维素、0.1％Triton X-100和1x PBS的水溶液被沉积在电极上，然后将条带在40℃烘箱中干燥5分钟。
通过压力在整个先前丝网印刷的绝缘层上覆盖一层双面粘合剂(将其完全覆盖)。该层厚0.25mm。该层在电极上未覆盖的空间构成了测量室(因此，其包含两个未被绝缘膜覆盖的电极)。
然后将一层聚对苯二甲酸乙二酯(PET)保护膜压到条带上并用作顶层。其完全覆盖了双面粘合剂层以及由测量室形成的空间(不与电极接触)。
然后将由此制造的条带在4℃暗处存储。
实施例2：通过安培法测量甘油的量
将一滴约3μL的血液滴在顶层上的缺口处。
a.检测血液样品中甘油量的规程
该规程适用于如实施例1a中所述的条带。
将样品在测量室中温育3秒。
然后，在工作电极和参比电极之间施加-0.2V的电势差。
开始电势差施加后30秒测量电流值。
b.利用数据量化脂肪分解
i.使用几种浓度的测量值构建校准线
如图5所示，将已知浓度的甘油添加到从志愿者那里采集的静脉血样品中，以获得添加了不同浓度的甘油的血液样品。使用上述技术分析这些样品，并记下施加电势后30秒钟的电流，然后将其与样品中的甘油浓度相关联以构建校准线。
ii.提取关联电流和浓度的线中的导向系数
然后，通过先前记录的数据的线性回归获得如图6所示的校准线，并确定该校准线起点处的导向系数和坐标对。这两个参数预先记录在应用程序中，该应用程序对用户进行的测量进行解读并允许在测试过程中测得的电流值来测量脂肪量的降解，从而根据脂解产生的甘油浓度来进行解释。
实施例3：用户对数据的使用
用户打开仪表并插入测试条带。然后，使用刺血针装置在指尖产生一滴毛细血管血，并将其沉积在为此目的设置的测试条带的缺口中。
仪表如上所述执行安培测量，并将结果发送到第二连接的装置，该装置可以是用户的智能手机。仪器使用预设的校准数据，并将电流值转换为降解的脂肪量。然后，该量通过第二装置上的屏幕显示给用户。该量也可以由所述装置进行分析，例如与用户之前的测量结果进行比较，或者与用户已输入应用程序的外部因素(即体育锻炼的类型或摄入的营养物质)相关联地对测量结果进行解释。

Claims (15)

1.用于检测体液样品中的甘油的电化学测试条带，所述电化学测试条带包含：
-电绝缘基板层；
-至少两个电极，从而具有碳制工作电极、参比电极和对电极，在两电极条带构造中，所述参比电极和所述对电极的功能由同一个电极执行，并且通过添加二茂铁衍生物溶液来将所述碳制工作电极功能化，所述二茂铁衍生物为还原形式；
-至少与电极数量一样多的电轨道；
-含有甘油激酶和甘油磷酸氧化酶的酶层，所述酶层被设置在所述电极上；
-辅因子层，其包含三磷酸腺苷和MgCl2；
-至少一个膜层；
-处于电极和顶层之间的间隔层，所述间隔层产生限定测量室容积的空间；
-用于接收样品的测量室，所述测量室至少部分地覆盖所述电极和所述酶层；
-顶层。
2.如权利要求1所述的条带，其中，所述体液样品是血液样品。
3.如权利要求1所述的条带，其中，通过添加二茂铁-甲醇溶液来将所述碳制工作电极功能化。
4.如权利要求1所述的条带，其进一步包含过氧化物酶。
5.如权利要求1所述的条带，其中，所述膜由羟丙基甲基纤维素制成。
6.如权利要求1所述的条带，其进一步包含表面活性剂和/或交联剂。
7.如权利要求1所述的条带，其中，所述酶、辅因子和膜被包含在单个层中。
8.制备权利要求1至7中任一项所述的电化学测试条带的方法，其包括沉积以下元件的阶段：
-电绝缘基板层；
-至少两个电极；
-至少与电极数量一样多的电轨道；
-含有甘油激酶和甘油磷酸氧化酶的酶层，所述酶层被沉积在所述电极上；
-辅因子层，其包含三磷酸腺苷和MgCl2；
-至少一个膜层；
-处于电极和顶层之间的间隔层；
-顶层。
9.如权利要求8所述的方法，其进一步包括添加过氧化物酶。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，所述膜由羟丙基甲基纤维素制成。
11.如权利要求8所述的方法，通过添加二茂铁-甲醇溶液将所述工作电极功能化。
12.如权利要求11所述的方法，其中，在沉积之前将所述酶、所述辅因子和所述膜层在相同溶液中混合，使得它们的沉积在单次操作中进行。
13.权利要求1至7中任一项所述的电化学测试条带的用于由生物流体样品评估个体中的脂解的用途。
14.评估个体中的脂肪降解的方法，其包括：
-将条带插入带有电流计的仪表中；
-采集血滴；
-将所述血滴放置在权利要求1至7中任一项所述的电化学测试条带上；
-从所述仪表直接读取或从连接到所述仪表的装置远程读取显示出的结果，以得出已降解的脂肪量。
15.如权利要求14所述的方法，其进一步包括以下步骤：通过将所测定的脂肪降解与所摄入的营养物和/或所进行的体育锻炼的类型关联来优化个体的脂肪损失。
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