CN111032027B - 使用烟酰胺核糖核苷治疗和预防运动神经元疾病 - Google Patents

使用烟酰胺核糖核苷治疗和预防运动神经元疾病 Download PDF

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Abstract

本文提供涉及通过向受试者施用(例如，口服施用于所述受试者)包含烟酰胺核糖核苷和/或紫檀芪的组合物来治疗所述受试者中诸如ALS的运动神经元疾病的方法和组合物。

Description

使用烟酰胺核糖核苷治疗和预防运动神经元疾病
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月17日提交的美国临时申请号62/507585和2018年1月5日提交的美国临时申请号62/614003的权益，所述申请的全部内容通过引用整体并入本文。
背景
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种随意运动系统的进行性退化病，特征为肌僵直、肌颤搐和因肌肉尺寸减小所致的逐渐恶化的无力。疾病进展导致讲话、吞咽和呼吸困难，最终导致大多数受影响患者呼吸衰竭和死亡。发作到死亡的平均生存期为二至四年。迄今为止，对于ALS尚未开发出治愈法且治疗法很少。因此，非常需要用于治疗ALS和其他运动神经元疾病的新组合物和方法。
发明内容
根据某些方面，本文提供涉及通过向受试者施用(例如，口服施用于受试者)包含具有式I或式II的化合物(例如，烟酰胺核糖核苷)和/或具有式III的化合物(例如，紫檀芪)的组合物，在受试者中治疗运动神经元疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化症或ALS)的方法和组合物。在某些实施方案中，运动神经元疾病是ALS，遗传性痉挛性截瘫(HSP)，原发性侧索硬化症(PLS)，进行性肌萎缩(PMA)，进行性延髓麻痹(PBP)，假性延髓麻痹，或脊髓性肌萎缩。
在某些方面中，本文提供的方法和组合物涉及通过向受试者施用(例如，口服施用于受试者)包含具有式I或式II的化合物(例如，烟酰胺核糖核苷)和/或具有式III的化合物(例如，紫檀芪)的组合物，在受试者中延缓或逆转运动神经元退化的进展。在一些实施方案中，受试者患有运动神经元疾病(例如，ALS，HSP，PLS，PMA，PBP，假性延髓麻痹或脊髓性肌萎缩)。
在某些实施方案中，组合物包含具有式I或式II的化合物(例如，至少100mg、至少200mg、至少300mg、至少400mg、至少500mg、至少600mg、至少700mg、至少800mg、至少900mg、至少1000mg、至少1100mg、至少1200mg、至少1300mg、至少1400mg、至少1500mg、至少1600mg、至少1700mg、至少1800mg、至少1900mg、至少2000mg、至少2100mg、至少2200mg、至少2300mg或至少2400mg的具有式I或式II的化合物)。在一些实施方案中，组合物包含具有式III的化合物(例如，至少40mg、至少50mg、至少60mg、至少80mg、至少100mg、至少120mg、至少140mg、至少160mg、至少180mg、至少200mg、至少220mg、至少240mg、至少260mg、至少280mg、至少300mg、至少320mg、至少340mg、至少360mg、至少380mg、至少400mg、至少500mg或至少600mg的具有式III的化合物)。在某些实施方案中，组合物包含具有式I或式II的化合物(例如，至少100mg、至少200mg、至少300mg、至少400mg、至少500mg、至少600mg、至少700mg、至少800mg、至少900mg、至少1000mg、至少1100mg、至少1200mg、至少1300mg、至少1400mg、至少1500mg、至少1600mg、至少1700mg、至少1800mg、至少1900mg、至少2000mg、至少2100mg、至少2200mg、至少2300mg或至少2400mg的具有式I或式II的化合物)和具有式III的化合物(例如，至少40mg、至少50mg、至少60mg、至少80mg、至少100mg、至少120mg、至少140mg、至少160mg、至少180mg、至少200mg、至少220mg、至少240mg、至少260mg、至少280mg、至少300mg、至少320mg、至少340mg、至少360mg、至少380mg、至少400mg、至少500mg或至少600mg的具有式III的化合物)两者。
在某些实施方案中，所述方法包括施用多剂组合物。在一些实施方案中，施用至少7剂组合物。在一些实施方案中，施用至少30剂组合物。在一些实施方案中，施用至少60剂或更多剂组合物。在一些实施方案中，每剂包含至少100mg、至少200mg、至少300mg、至少400mg、至少500mg、至少600mg、至少700mg、至少800mg、至少900mg、至少1000mg、至少1100mg、至少1200mg、至少1300mg、至少1400mg、至少1500mg、至少1600mg、至少1700mg、至少1800mg、至少1900mg、至少2000mg、至少2100mg、至少2200mg、至少2300mg或至少2400mg的具有式I或式II的化合物(例如，烟酰胺核糖核苷)。在一些实施方案中，每剂包含至少40mg、至少50mg、至少60mg、至少80mg、至少100mg、至少120mg、至少140mg、至少160mg、至少180mg、至少200mg、至少220mg、至少240mg、至少260mg、至少280mg、至少300mg、至少320mg、至少340mg、至少360mg、至少380mg、至少400mg、至少500mg或至少600mg的具有式III的化合物(例如，紫檀芪)。
在某些实施方案中，每剂包含至少100mg、至少200mg、至少300mg、至少400mg、至少500mg、至少600mg、至少700mg、至少800mg、至少900mg、至少1000mg、至少1100mg、至少1200mg、至少1300mg、至少1400mg、至少1500mg、至少1600mg、至少1700mg、至少1800mg、至少1900mg、至少2000mg、至少2100mg、至少2200mg、至少2300mg或至少2400mg的具有式I或式II的化合物(例如，烟酰胺核糖核苷)和至少40mg、至少50mg、至少60mg、至少80mg、至少100mg、至少120mg、至少140mg、至少160mg、至少180mg、至少200mg、至少220mg、至少240mg、至少260mg、至少280mg、至少300mg、至少320mg、至少340mg、至少360mg、至少380mg、至少400mg、至少500mg或至少600mg的具有式III的化合物(例如，紫檀芪)。
在某些实施方案中，在一段时间内以有规律的间隔施用一剂组合物。在一些实施方案中，每周至少一次施用一剂组合物。在一些实施方案中，每周至少两次施用一剂组合物。在某些实施方案中，每周至少三次施用一剂组合物。在一些实施方案中，每天至少一次施用一剂组合物。在一些实施方案中，每天至少两次施用一剂组合物。在一些实施方案中，至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年施用多剂组合物。
在一些实施方案中，给予受试者运动功能测试和/或认知和行为功能测试。运动功能测试可为修订版肌萎缩性侧索硬化症功能评定量表(ALSFRS-R)。认知和行为测试可为康普顿斯(Complutense)言语学习测试(TAVEC)，符号数字模态测试(SDMT)，言语流畅性测试，数字广度(韦克斯勒(Wechsler)记忆量表III)，D2注意力测试，针对字母和数字的韦克斯勒记忆量表III，伦敦塔测试，斯特鲁(Stroop)测试，额叶系统行为量表(FrSBe)，或简易测试(主观行为)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括测量受试者中的特征(例如，与炎症相关的特征)。可测试的特征的实例是细胞因子的含量，淀粉样A蛋白的含量，巨噬细胞活化标志物新蝶呤的含量，肌酸磷酸激酶(CPK)的含量，红细胞沉降率的水平，C反应蛋白的含量，血浆粘度和/或白血细胞数。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用脂肪酸补充物(例如，椰子油)。
在某些实施方案中，组合物被配制用于口服递送。在一些实施方案中，组合物被配制为丸剂、片剂或胶囊。在一些实施方案中，口服施用组合物。在某些实施方案中，组合物被自我施用。
附图简述
图1示出比较小鼠组间存活时间的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线。WT为野生型B6SJLF1/J小鼠；SOD1为转基因SOD1 G93A小鼠；NR为用烟酰胺核糖核苷治疗的小鼠；PT为用紫檀芪治疗的小鼠；R为用白藜芦醇治疗的小鼠。
图2示出每周不同小鼠治疗组的存活小鼠数。
图3示出每周不同小鼠治疗组的神经学评分。
图4示出每周不同小鼠治疗组的尾巴升高试验的结果。
图5示出每周不同小鼠治疗组的旋转棒(rotarod)试验的结果。
图6示出每周不同小鼠治疗组的悬挂金属丝试验的结果。
图7示出每周不同小鼠治疗组的斜面试验的结果。
图8示出每个时段不同小鼠治疗组的运动活动性的自动评价的结果。
图9示出第8周和第18周不同小鼠治疗组的电生理测量的结果。
详述
总的
本文提供涉及通过向受试者(例如，患有ALS的受试者)施用包含具有式I或式II的化合物(例如，烟酰胺核糖核苷)和/或具有式III的化合物(例如，紫檀芪)的组合物，治疗和/或预防运动神经元疾病和病症(例如，ALS)和/或延缓或逆转运动神经元退化的方法和组合物。
定义
为方便起见，在此集中在说明书、实施例和随附权利要求书中采用的某些术语。
冠词“一个/一种(a/an)”在本文中用来指代一个/一种或多于一个/一种(即，至少一个/一种)的该冠词的语法上的宾语。以举例方式，“元素(an element)”意指一种元素或多于一种元素。
本文中所使用的术语“施用”意指向受试者提供药物药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。向受试者施用物质、化合物或药剂可使用本领域技术人员已知的各种方法中的一种来进行。例如，化合物或药剂可被静脉内、动脉、皮内、肌内、腹膜内、皮下、经眼、舌下、口服(通过摄入)、鼻内(通过吸入)、椎管内、脑内、和经皮肤(通过吸收，例如，经过皮肤导管)施用。化合物或药剂还可适当地通过可再装载的(rechargeable)或生物可降解的聚合物装置或其他装置例如贴剂和泵或者制剂来引入，所述装置或制剂提供化合物或药剂的延长、缓慢或受控的释放。施用还可进行例如一次、多次和/或在一个或更多个延长时段内进行。
向受试者施用物质、化合物或药剂的合适方法还将取决于例如受试者的年龄和/或身体状况，以及化合物或药剂的化学和生物学性质(例如，可溶性、可消化性、生物可利用性、稳定性和毒性)。在一些实施方案中，化合物或药剂通过摄入例如口服施用于受试者。在一些实施方案中，口服施用的化合物或药剂处于延长释放或缓慢释放的制剂中，或者使用实现这种缓慢或延长释放的装置来施用。
本文中所使用的短语“药用可接受的载体”意指药用可接受的材料、组合物或载剂，诸如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂或溶剂封装材料。
本文中所使用的术语“受试者”意指针对治疗或疗法所选择的人或非人动物。
本文中所使用的短语“治疗有效量”和“有效量”意指在可适用于任何医学治疗的合理收益/风险比率下，对在受试者中的至少一个细胞亚群中产生所需疗效有效的药剂的量。
“治疗”受试者中的疾病或“治疗”患有疾病的受试者指的是使受试者经受药物治疗、例如施用药物，以使得疾病的至少一种症状得以减少或阻止恶化。
组合物
本文提供包含具有式I或式II的化合物(例如，烟酰胺核糖核苷)和/或具有式III的化合物(例如，紫檀芪)的药物组合物。
烟酰胺核糖核苷是一种烟酸(即，维生素B3)的吡啶核苷形式，其充当烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体。本文中所使用的“烟酰胺核糖核苷”还包括烟酰胺核糖核苷盐，诸如氯化烟酰胺核糖核苷。烟酰胺核糖核苷的化学结构在下方提供：
Figure BDA0002369996270000061
在一些实施方案中，本文提供包含由式(I)表示的化合物或其药用可接受的盐的药物组合物：
Figure BDA0002369996270000062
其中，对每次出现独立地：
R1、R2和R3选自氢、卤素、-CN、-NO2、-OR14、-N(R14)m、-R13、取代或未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
R4和R5选自氢、卤素、-CN、-NO2、-OR14、-N(R14)m、取代或未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
R6、R8、R11和R12选自氢、(C1-C6)烷基、-((C1-C6)亚烷基)N(R14)m、-C(O)((C1-C6)亚烷基)N(R14)m、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-OR14和-N(R14)m；
R7、R9和R10选自-((C1-C6)亚烷基)N(R14)m、-OR14和-N(R14)m；
R13选自-OR14、-N(R14)m、-C(O)(R14)、-C(O)(OR14)、-C(O)N(R14)m、-S(O)2(OR14)、-S(O)OR14和-S(O)2N(R14)m；
R14选自氢、(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；并且
X为O、S或N(R14)；
m为2或3；
条件是R1、R2和R3中的至少一者为R13。
在一些实施方案中，R1为R13。在一些实施方案中，R2为R13。在一些实施方案中，R3为R13。
在一些实施方案中，R13选自-OR14、-N(R14)m、-C(O)(R14)、-C(O)(OR14)和-C(O)N(R14)m。在一些实施方案中，R13选自-C(O)(R14)、-C(O)(OR14)和-C(O)N(R14)m。在一些实施方案中，R13为-C(O)N(R14)m。
在一些实施方案中，R7、R9和R10各自独立地为-OR14或-N(R14)m。在一些实施方案中，R7、R9和R10为-OR14。
在一些实施方案中，具有式(I)的化合物由式(II)表示或为其药用可接受的盐：
Figure BDA0002369996270000071
其中，对每次出现独立地：
R2和R3选自氢、卤素、-CN、-NO2、-OR14、-N(R14)m、-R13、取代或未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
R4和R5选自氢、卤素、-CN、-NO2、-OR14、-N(R14)m、取代或未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
R6、R8、R11和R12选自氢、-OR14、-N(R14)m、取代或未取代的(C1-C6)烷基、-((C1-C6)亚烷基)N(R14)m、-C(O)((C1-C6)亚烷基)N(R14)m、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
R13选自-OR14、-N(R14)m、-C(O)(R14)、-C(O)(OR14)、-C(O)N(R14)m、-S(O)2(OR14)、-S(O)OR14和-S(O)2N(R14)m；
R14选自氢、(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；并且
m为2或3。
在具有式(I)或(II)的化合物的一些实施方案中，如果存在的话，R1、R2和R3各自独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-OR14、-N(R14)m、-R13和取代或未取代的(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，如果存在的话，R1、R2和R3各自独立地选自氢、-OR14、-N(R14)m和未取代的(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，如果存在的话，R1、R2和R3各自独立地选自取代或未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。在一些实施方案中，如果存在的话，R1、R2和R3各自独立地为氢。
在具有式(I)或(II)的化合物的一些实施方案中，R4和R5各自独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-OR14、-N(R14)m和取代或未取代的(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，R4和R5各自独立地选自氢、-OR14、-N(R14)m和未取代的(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，R4和R5各自独立地选自取代或未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。在一些实施方案中，R4和R5各自为氢。
在具有式(I)或(II)的化合物的一些实施方案中，R6、R8、R11和R12选自氢、-OR14、-N(R14)m、未取代的(C1-C6)烷基、-((C1-C6)亚烷基)N(R14)m、-C(O)((C1-C6)亚烷基)N(R14)m、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。在一些实施方案中，R6、R8、R11和R12各自独立地选自氢、-OR14、-N(R14)m、未取代的(C1-C6)烷基、-((C1-C6)亚烷基)N(R14)m和-C(O)((C1-C6)亚烷基)N(R14)m。在一些实施方案中，R6、R8、R11和R12各自独立地选自氢、-OR14和-N(R14)m。在一些实施方案中，R6、R8、R11和R12各自独立地选自未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。在一些实施方案中，R6、R8、R11和R12各自为氢。
在一些实施方案中，R7、R9和R10各自独立地为-OR14或-N(R14)m。在一些实施方案中，R7、R9和R10各自为-OR14。在一些实施方案中，R7、R9和R10各自为-OH。
在具有式(I)或(II)的化合物的一些实施方案中，R14为氢或(C1-C6)烷基。
在具有式(I)或(II)的化合物的一些实施方案中，X为O或N(R14)。在一些实施方案中，X为O。
在具有式(I)或(II)的化合物的一些实施方案中，化合物为：
Figure BDA0002369996270000081
紫檀芪是一种芪类化合物，并且是多酚白藜芦醇的类似物，因存在两个甲氧基而允许其具有增强的亲脂和口服吸收性，从而具有更好的生物可利用性，以及因氧化减少而具有更长的半衰期。紫檀芪的化学结构在下方提供：
Figure BDA0002369996270000091
在一些实施方案中，本文提供包含由式(III)表示的化合物或其药用可接受的盐的药物组合物：
Figure BDA0002369996270000092
其中，对每次出现独立地：
R15选自卤素、-CN、-NO2、-OR16、-N(R16)p、-S(O)2(OR16)、-S(O)OR16、取代或未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
R16选自氢、(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基；
n为0至5的整数；并且
p为2或3；
条件是至少一个n为1；并且至少一个R15为-OR16；
条件是式(III)的化合物不为：
Figure BDA0002369996270000093
在式(III)的化合物的一些实施方案中，R15选自卤素、-CN、-NO2、-OR16、-N(R16)p和取代或未取代的(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，R15选自-OR16、-N(R16)p和未取代的(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，R15选自取代或未取代的(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。在一些实施方案中，R15为-OR16。在一些实施方案中，R15为-OR16；并且R16为氢或(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，R15为-OR16；并且R16为(C1-C6)烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基。在一些实施方案中，R15为-OR16；并且R16为氢或(C1-C6)烷基。在一些实施方案中，R15为-OR16；并且R16为(C1-C6)烷基、环烷基或杂环烷基。
在一些实施方案中，n为1、2或3。在一些实施方案中，n为1或2。
在一些实施方案中，p为2。在一些实施方案中，p为3。
在一个方面中，本文提供药用可接受的组合物，所述组合物包含治疗有效量的本文所述的化合物(即，烟酰胺核糖核苷和/或紫檀芪)中的一种或更多种，与一种或更多种药用可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。在另一个方面中，本文所述的药剂可照原样施用，或在与药用可接受的载体的混合物中施用，并且还可结合其他药剂施用。因此，结合疗法包括顺序、同时和分开或共同施用本发明的一种或更多种化合物，其中在施用后续化合物时首先被施用的化合物的疗效尚未完全消失。
如下文详细描述的，本文所述的药物组合物可被特别地配制成以固体或液体形式施用，包括适于如下的那些：(1)口服施用，例如灌服药(水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂、例如靶向于口腔、舌下和全身吸收的那些，大丸剂，散剂，粒剂，施加于舌的糊剂；(2)胃肠外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放制剂通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；或(3)舌下给药。
在一些实施方案中，组合物包含另外的药剂。例如，组合物可包含营养剂，诸如抗氧化剂。药用可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚，等；以及(3)金属鳌合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本文所述的化合物的制剂可以单位剂型呈现，并且可通过药学领域众所周知的任何方法来制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将视受治疗的宿主和特定施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生疗效的药剂的量。
在某些实施方案中，本文所述的制剂包含赋形剂，包括但不限于环糊精，脂质体，胶束形成剂、例如胆汁酸，和聚合物载体、例如聚酯和聚酐；以及本发明的药剂。在一些实施方案中，上述制剂使本发明的药剂为口服生物可利用的。制备这些制剂或组合物的方法可包括将本发明的化合物与载体以及任选的一种或更多种辅助成分结合起来的步骤。
用于口服施用本文提供的制剂的液体剂型包括药用可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分以外，液体剂型可含有在本领域常用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂，诸如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，油(具体而言，棉籽油，花生油，玉米油，胚芽油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢糠醇，聚乙二醇和山梨糖醇酐的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
除了惰性稀释剂以外，口服组合物还可包括辅药，诸如润湿剂、乳化和悬浮剂，增甜、增香、着色、芳香和防腐剂。
除活性化合物以外，悬浮液可含有悬浮剂，如例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨醇酐酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、膨润土、琼脂和黄芪胶，以及它们的混合物。
适合于口服施用的本文提供的制剂可呈以下形式：胶囊，扁囊剂，丸剂，片剂，糖锭(使用香味基料，通常为蔗糖和金合欢胶或黄芪胶)，散剂，粒剂，或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或者作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为软锭剂(使用惰性基材，诸如明胶和甘油、或蔗糖和金合欢胶)和/或作为漱口剂等，各自含有预定量的本发明的化合物作为活性成分。本发明的化合物还可作为大丸剂、药糖剂或糊剂来施用。
在用于口服施用的本发明的固体剂型(例如，胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、粒剂等)中，活性成分与诸如柠檬酸钠或磷酸二钙的一种或更多种药用可接受的载体和/或以下中的任何者混合：(1)填料或补充剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或金合欢胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻溶剂，诸如石蜡；(6)促吸收剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如像鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子型表面活性剂；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和它们的混合物；以及(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物还可被用作软壳和硬壳明胶胶囊中的填料，使用诸如乳糖或奶糖之类的赋形剂，以及高分子量聚乙二醇等。
片剂可通过压缩或模制来制作，任选地具有一种或更多种辅助成分。压缩片剂可使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟乙酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制作。
片剂和本文所述的药物组合物的其他固体剂型，诸如糖衣丸、胶囊、丸剂和粒剂，可任选地用包衣和壳、诸如肠溶包衣和药物制剂领域中众所周知的其他包衣来压痕或制备。它们还可被配制以便提供其中的活性成分的缓慢或受控释放，使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线，其他聚合物基质、脂质体和/或微珠。本文所述的组合物还可被配制用于快速释放，例如冻干。它们可通过例如经过阻留细菌的过滤器的过滤来灭菌，或通过在使用前即刻掺入可溶解于无菌水或一些其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌。这些组合物还可任选地含有乳浊剂，并且可具有使得它们仅或优选在胃肠道的某一部分、任选以延迟方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。在适当时，活性成分还可呈微囊包封的形式，具有上述赋形剂中的一种或更多种。
适合于胃肠外施用的本文提供的药物组合物包含本发明的一种或更多种化合物，其组合有一种或更多种药用可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，或可就在使用前复原成无菌可注射溶液或分散体的无菌散剂，它们可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期受体的血液等渗的溶质、或悬浮或增稠剂。
可在本发明的药物组合物中采用的合适的水性和非水性载体的实例包括水，乙醇，多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和它们的合适的混合物，椰子油，植物油诸如橄榄油，和可注射的有机酯、诸如油酸乙酯。可通过使用诸如卵磷脂的包衣材料、在分散体的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
治疗方法
本文提供通过向受试者(例如，有其需要的受试者)施用本文所公开的组合物(例如，包含具有式I或式II的化合物、诸如烟酰胺核糖核苷和/或具有式III的化合物、诸如紫檀芪的组合物)，在受试者中治疗运动神经元疾病或病症的方法。在一些方面中，本文提供在受试者中延缓或逆转运动神经元退化的进展的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的组合物(例如，包含具有式I或式II的化合物、诸如烟酰胺核糖核苷和/或具有式III的化合物、诸如紫檀芪的组合物)。在一些实施方案中，运动神经元退化指的是神经元的死亡和/或神经元功能的丧失。
在一些实施方案中，受试者可患有或易患运动神经元疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，诸如髓ALS或脑干ALS)。运动神经元疾病或病症可为影响运动神经元的功能或结构的任何疾病或病症。本文中所使用的运动神经元疾病包括导致脑和脊髓中运动神经元或神经功能丧失的进行性疾病。运动神经元疾病的实例包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，遗传性痉挛性截瘫(HSP)，原发性侧索硬化症(PLS)，进行性肌萎缩(PMA)，进行性延髓性麻痹(PBP)，假性延髓麻痹，或脊髓性肌萎缩。运动神经元疾病可影响上运动神经元或下运动神经元。
本文所公开的组合物的实际剂量水平和施用方案可变化以便获得对特定患者、组合物和施用模式有效实现所需治疗响应且对患者无毒的量的具有式I或式II的化合物(例如，烟酰胺核糖核苷)和/或具有式III的化合物(例如，紫檀芪)。
在一些实施方案中，施用组合物包括施用一剂或更多剂的组合物。在一些实施方案中，施用组合物包括施用一剂或更多剂、五剂或更多剂、十剂或更多剂、二十剂或更多剂、三十剂或更多剂、四十剂或更多剂、五十剂或更多剂、一百剂或更多剂或者一千或更多剂的组合物。在一些实施方案中，一剂包含至少100mg、至少200mg、至少300mg、至少400mg、至少500mg、至少600mg、至少700mg、至少800mg、至少900mg、至少1000mg、至少1100mg、至少1200mg、至少1300mg、至少1400mg、至少1500mg、至少1600mg、至少1700mg、至少1800mg、至少1900mg、至少2000mg、至少2100mg、至少2200mg、至少2300mg、至少2400mg、至少2500mg、至少2600mg、至少2700mg、至少2800mg、至少2900mg或至少3000mg的具有式I或式II的化合物(例如，烟酰胺核糖核苷)。在一些实施方案中，一剂包含至少5mg、至少10、至少20mg、至少30mg、至少40mg、至少50mg、至少60mg、至少80mg、至少100mg、至少120mg、至少140mg、至少160mg、至少180mg、至少200mg、至少220mg、至少240mg、至少260mg、至少280mg、至少300mg、至少320mg、至少340mg、至少360mg、至少380mg、至少400mg、至少500mg、至少600mg、至少700mg、至少800mg、至少900mg或至少1000mg的具有式III的化合物(例如，紫檀芪)。
本文所公开的组合物可在有效实现对特定患者、组合物和施用模式的所需治疗响应且对患者无毒的任何时间段内施用。该时间段可为至少1天，至少10天，至少20天，至少30天，至少60天，至少三个月，至少六个月，至少一年，至少三年，至少五年，或至少十年。该剂量可在需要时、不时或有规律间隔地施用。例如，该剂量可每月一次、每周一次、每周两次、每周三次、每天一次或每天两次地施用。
在一些实施方案中，给予受试者测试以度量运动神经元疾病的总体进展或症状进展。在一些实施方案中，给予受试者运动功能测试和/或认知和行为功能测试。运动功能测试可为修订版肌萎缩性侧索硬化症功能评定量表(ALSFRS-R)。认知和行为测试可为康普顿斯言语学习测试(TAVEC)，符号数字模态测试(SDMT)，言语流畅性测试，数字广度(韦克斯勒记忆量表III)，D2注意力测试，针对字母和数字的韦克斯勒记忆量表III，伦敦塔测试，斯特鲁测试，额叶系统行为量表(FrSBe)，和/或简易测试(主观行为)。在一些实施方案中，给予受试者运动功能和认知功能测试两者。可给予受试者一次或多次运动功能或认知功能测试。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括测量受试者中的特征(例如，与炎症相关的特征)。在一些实施方案中，在血试验中测量所述特征。可测试的特征的实例是细胞因子的含量，淀粉样A蛋白的含量，巨噬细胞活化标志物新蝶呤的含量，肌酸磷酸激酶(CPK)的含量，红细胞沉降率的水平，C反应蛋白的含量，血浆粘度和/或白血细胞数。在一些实施方案中，细胞因子是促炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是抗炎细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于TNFα、IFNγ、IL-1、IL-6、IL-8或TGFβ。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向受试者施用脂肪酸补充物。在一些实施方案中，脂肪酸补充物包含油。该油可被加工(例如，精制、脱色或除臭)。在其他实施方案中，该油是未加工的油或直馏油。在一些实施方案中，脂肪酸补充物衍生自或分馏自一来源以产生分离的脂肪酸。在一些实施方案中，油是椰子油。本文中所使用的椰子油可包括由椰子树的坚果产生的任何油。见于本文所公开的补充物中的脂肪酸可为短链脂肪酸、中链脂肪酸或长链脂肪酸。可见于补充物中的示例性脂肪酸包括但不限于己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，棕榈油酸，硬脂酸，油酸，亚油酸和/或亚麻酸。本文所公开的脂肪酸补充物可包含饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和/或多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，脂肪酸补充物可包含氢化油。脂肪酸补充物可包含一种或更多种脂肪酸。本文所公开的脂肪酸补充物的实际剂量水平和施用方案可变化以便获得对特定患者、组合物和施用模式有效实现所需治疗响应且对患者无毒的量的脂肪酸补充物。
范例
实施例1：ALS患者中的先导研究
ALS患者在身体的一个或更多个部位中发展功能的隐袭丧失或逐渐、缓慢进行性、无痛的无力，而无感觉能力的变化且无立即明显的其他原因。在下运动神经元(LMN，脊髓)受累中，肌纤维自发性收缩可在疾病早期、特别是在舌和肢出现。上运动神经元(UMN，脑)受累的患者通常是反射亢进和僵直的。反射可能因LMN受累而减少。UMN症状可包括痉挛和突然不受控的下肢矫直运动。随着ALS进展，肌肉萎缩变得更明显，并且痉挛状态可损害步态和手灵巧度。不动性若伴随痉挛状态可导致患上疼痛的关节挛缩。肌肉痉挛是常见的。在一些患者中，肌肉的持久僵直或痉挛可能压迫相关关节和背。一些人经受了运动、吞咽(咽下困难)和讲话或组织语言(构音不良)困难增加。UMN受累的症状包括肌肉紧张和僵直(痉挛状态)和过度反射(反射亢进)。
参与研究的患者患有进展程度不同的ALS，但大多数表现出可变/持续的肌肉自发性收缩、麻木、痉挛、僵直和/或关节挛缩。
患有ALS的六十位患者将被分成5个组。第1组为对照(无治疗)，第2组施用安慰剂，第3组被提供脂肪酸补充物(椰子油)，第4组被提供主药(BASIS，烟酰胺核糖核苷和紫檀芪)，并且第5组被提供与脂肪酸补充物组合的主药。可给予患者运动功能和认知功能测试以确定受试者中疾病症状的进展。可在研究期间测量患者中的炎症相关参数，包括细胞因子(例如，TNFa、IFNg、IL-1、IL-6、IL-8或TGFb)、淀粉样A蛋白(低分子量急性期蛋白，其主要由肝响应于促炎细胞因子而产生)、巨噬细胞活化标志物新蝶呤、CPK、红细胞沉降率、C反应蛋白、血浆粘度和白血细胞数。
在研究十六天之后，接受主药的患者经历了涉及轴突功能退化的复合症状减少。另外，患者报告为由于肌肉相关的复合症状而不能良好地睡眠。然而，在施用主药之后，患者报告为睡眠能力的提高。
实施例2：案例研究
一位诊断患有ALS、表现运动功能进行性丧失的受试者被施用主药四周。在施用前，受试者不能走动并且受试者的肌肉对运动功能测试没有响应。在用主药治疗四周后，受试者表现出改进的运动功能化。
实施例3：烟酰胺核糖核苷和紫檀芪在肌萎缩性侧索硬化症中的效力：随机化安慰 剂作对照的先导研究
该实施例的目的
为了评价烟酰胺核糖核苷(维生素B3的一种形式)和紫檀芪(一种天然多酚)的组合(NR+Pter)在患有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的患者中的效力和耐受性。
方法
这是一个单中心、前瞻性、双盲、随机化的安慰剂作对照先导研究。患有ALS的患者被随机选择以接受NR+Pter或安慰剂，并且经历活动评价达4个月。
结果
总体来说，27位患者被随机选择。与安慰剂相比，用NR+Pter治疗的患者表现出对骨骼肌/脂肪重量比率、ALS功能评定量表-修订版(ALSFRS-R)评分、用力肺活量(FVC)和医学研究委员会(Medical Research Council，MRC)的肌肉强度量表的显著改进。
证据分类
该研究提供了对于患有ALS的患者而言结合NR和Pter明显好于安慰剂的II类证据。
词汇表
ALS＝肌萎缩性侧索硬化症；NR＝烟酰胺核糖核苷；Pter＝紫檀芪；ALSFRS-R＝ALS功能评定量表-修订版；FVC＝用力肺活量；MRC＝医学研究委员会；SARM1＝不育α和TIR基序限制1；ULN＝正常值上限；BIM＝体重指数；EMG＝肌电图；mtMP＝线粒体膜电位；mtPTP＝线粒体通透性转换孔复合体；Nrf2＝核红细胞相关因子2；GSH＝谷胱甘肽。
方法研究设计概述和资格
该研究是对NR+Pter治疗对比安慰剂治疗的患有ALS的患者的单中心、随机化、双盲、安慰剂对照的平行组先导试验。主要目的是基于标准临床规范评估组合的效力。符合条件的参与者是年龄为18岁或更年长者，女性(未正在泌乳，妊娠测试阴性并且同意使用有效的节育方法)和男性，经El Escorial标准(Brooks 2000)诊断很可能或确定患有(散发性或家族性)ALS，并且复合症状的发作多于6个月。所有患者还根据标准剂量接受利鲁唑治疗。淘汰标准是：气管造口术，有创通气，或无创正压通气；胃造口术；重精神障碍或临床明显痴呆的证据；诊断有除ALS以外的神经变性疾病；具有除利鲁唑之外的当前药物治疗；具有酒精或药物滥用的近期史(在过去6个月内)或当前证据；具有涉及任何系统的并发不稳定疾病，例如除基底细胞癌外的癌，任何心律失常，心肌梗塞，心肌缺血的临床或ECG征象，心机能不全，心绞痛症状，冠状动脉疾病的当前症状；基线QTc(Bazett)对男性>450毫秒，对女性>470毫秒；患者患有已知乙型/丙型肝炎或HIV阳性血清特征；具有定义为血液肌酸酐>2×ULN(正常值上限)的肾损伤；具有肝损伤和/或肝酶(ALAT或ASAT)>3×ULN；止血障碍或当前用口服抗凝血剂治疗；在过去3个月内参与任何其他具有未批准药物治疗的调查研究性药物或疗法研究；患者没有医疗保险。
样本大小，随机化和盲法
随机分配患者。每组被评价的患者数为：安慰剂(基线和2个月时n＝14，4个月时n＝10)，NR+Pter(基线和2个月时n＝13，4个月时n＝10)。研究是除主管(J.E.R.，J.M.E.)外包括患者和卫生工作人员双盲的。
饮食
所有患者进食地中海型饮食(每天大约2,300Kcal)(参见例如Davis 2015)。安慰剂组中的患者接受含有红糖的胶囊。NR+Pter的组合以大约15mg NR和2.5mg t-Pter/Kg×天的剂量施用。安慰剂和NR+Pter组的饮食为55％碳水化合物+30％脂肪+15％蛋白质。饮食中的碳水化合物对应于缓释碳水化合物食品。两组的饮食中的维生素和微量元素根据EFSA(European Food Safety Authority(欧洲食品安全局))作出的推荐膳食许可量调整。
随访，结果和数据收集
在治疗的基线(0时)、2和4个月时安排随访。在这3个时间点进行神经学检查，并且记录以下项目：人体测量分析，ALSFRS-R总评分，FVC，如由MRC分级量表分级的肌肉强度，评价骨骼肌产生的电活动性的肌电描记法。在研究的整个持续时间内，患者与医疗队持久沟通，并且每周通知他们的进展。
人体测量术
根据标准人体测量程序(Wang 2000)计算脂肪和骨骼肌重量。脂肪和骨骼肌重量数据涉及比较2或4个月对比基线所观察到的变化。
ALSFRS-R评分
这一用于监测患有ALS的患者的残疾进展的已验证评定手段(Kollewe 2008)是基于12个项目，项目中每一者基于0-4点量表进行评定。因此，全功能残疾的等级为0(最大残疾)至48(正常)点。
FVC
这一对ALS患者的生存和疾病进展的有临床意义的预测值(Czaplinski 2006)使用来自Sibelmed(西班牙巴塞罗那)的Datospir触摸式肺活量计来测量，并且表示为取决于性别、体重和年龄参数)的对应于成年人的标准值的％(Garcia-Rio 2013)。
MRC量表
基于11步改良的MRC分级量表(www.medscape.com)来评价肌肉强度(5，正常力量；5-，不明确、几乎不可检测的无力；4+，确定但轻微的无力；4，能够对抗重力和一些阻力的组合运动关节；4-，能够最低限度的抵抗；3+，能够瞬间抵抗但突然崩溃；3，对抗重力主动运动；3-，能够对抗重力运动但不贯穿整个范围；2，能够在重力消除时运动；1，微量收缩；0，无收缩)。对每位患者的8块不同的肌肉[右(R)和左(L)二头肌、三头肌、四头肌和胫骨肌]获得MRC评分。为了计算总MRC指数，对每个步骤和每块肌肉给出从0(量表中0)至10(量表中5)的逐渐增大的数字。每位患者的总MRC指数对应于对全部8块肌肉给出的数字之和。
肌电描记法
使用表面肌电图(EMG)测量装置(BTS FreeEMG 300，BTS S.p.A.，意大利米兰)来测量上文针对MRC指数所指示的相同肌肉中的肌肉活动性。每块肌肉的EMG信号通过反映在收缩期间运动单位中生理活动性的均方根(RMS)法来分析。RMS表示给定时间段的EMG信号的平均功率的平方根(例如Boe 2008)。
统计方法
数据呈现为针对若干不同实验的平均值±SD。使用学生(Student)氏t检验进行统计分析。*P<0.05和**P<0.01比较所有组中的2或4个月对比基线；+P<0.05和++P<0.01比较NR+Pter对比安慰剂。
结果
满足入选标准的三十二位ALS患者被随机分配于17位(安慰剂)和15位(NR+Pter)患者的两个组中。在2017年2月末开始该研究。随着研究进行一些患者因不同原因而退出。在0与2个月之间的初始时段内，清除了安慰剂组的3位患者(1例是由于泌尿系感染，1例肺炎，并且1位因呼吸麻痹而造成死亡)和NR+Pter组的2位患者(1例是由于胃肠炎，1位因肺炎而造成死亡)。在2与4个月之间的时段内，还另外脱离了安慰剂组的另外4位患者(2位是创伤相关事件，1位胃肠炎，和1位支气管炎)和NR+Pter组的3位患者(1位是创伤相关事件，1位肝炎，和1位深度精神抑郁)。如表1中所示，其中展示出患者的人口统计和临床特征，两组中平均年龄为55-56岁。在随着研究进行比较两个组和疗法的患者时，体重和BIM(体重指数)值无显著差异。然而，NR+Pter治疗引起脂肪(减少)和骨骼肌(增加)重量的明显变化(表1)。这些变化与4个月时NR+Pter组(与基线相比)明显提高的ALSFRS-R评分和FVC表现相关(表1)。这些改善还与肌肉强度和活动性数据相关。如表2中所示，比较基线和4个月以及比较NR+Pter对比安慰剂值，NR+Pter治疗组中总MRC量表指数提高；而在同一时间段内安慰剂治疗患者的该相同指数降低。4个月时比较NR+Pter对比安慰剂，仅发现对于1种肌肉(三头肌)EMG值的变化是明显的(表2)。
表1.基线(BL)和治疗2-4个月(2M-4M)后随机分配的ALS患者的人口统计特性和临床特征
Figure BDA0002369996270000201
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Figure BDA0002369996270000211
表2.治疗引发的ALS患者中肌肉强度的变化
Figure BDA0002369996270000221
数据呈现为针对所述若干不同实验的平均值+SD。使用学生氏t检验进行统计分析。*P<0.05和**P<0.01比较所有组中的2M对比BL；+P<0.05和++P<0.01比较主药或主药+椰子油对比安慰剂。
结论
1.与安慰剂治疗相比，被施用主药的患者经历了脂肪重量明显减少和骨骼肌重量增加。
2.与安慰剂治疗相比，被施用主药的患者经历了ALSFRS-R评分和肺活量提高。
3.与安慰剂治疗相比，被施用主药的患者经历了MRC量表指数的明显提高。在比较4M对比BL的EMG时，被施用主药的患者维持或提高了肌肉活动性，而被施用安慰剂对照的患者表现出肌肉活动性降低。
实施例4：对肌萎缩性侧索硬化症的啮齿动物模型的运动协调性和平衡性进行评 估
方法：小鼠
野生型和转基因FUS R521C。品系名：B6；SJL-Tg(Prnp-FUS*R521C)3313Ejh/J。遗传背景：转基因注射入B6SJL卵母细胞。维持在C57BL/6上，因此后代具有更高的C57BL/6百分比。Jackson实验室：保存(stock)号026406。幼龄时，这种转基因小鼠发展严重的运动损伤和其他ALS相关表型。值得注意地，其发展了脊髓中稳固的神经元损失，神经肌肉接点去神经和肌萎缩。表型发展迅速-在出生数周内即可检测到-并且小鼠快速衰退。原始N1F1代中大多数小鼠在三个月内达到末期(Qiu等人，2014)。在一月龄时，小鼠在脑和脊髓中以大致等同于内源FUS的水平表达突变的FUS。在这些小鼠中大多数的转基因FUS-R521C蛋白在细胞核。偶尔检测到细胞质蛋白；然而，少于10％的脊髓运动神经元含有细胞质FUS内含物。内源FUS蛋白而非转基因蛋白在树突中以点状模式出现。类似于内源FUS，在星形胶质细胞和少突神经胶质细胞、而非小神经胶质中检测到FUS-R521C蛋白。
小鼠在脊髓中发展突出的神经元损失。出生时，脊髓运动神经元的数量正常。然而，到第16天时脊髓前角中ChAT阳性神经元的数量减少20％。退化继续，并且到末期仅约一半的神经元保留下来。存活的运动神经元具有降低的树突复杂性，突触缺陷和DNA损伤。皮质神经元无可检测的损失；但感觉运动皮质中的神经元具有降低的树突复杂性和降低的突触密度。
尽管转基因表达适度，但FUS-R521C小鼠从幼龄起就展现各种运动损伤，包括痉挛性截瘫和由尾巴提起时异常的后肢抱握。它们还具有步态异常，包括在行走过程中其后爪间距离减小。旋转棒上的表现差。
原始N1F1代中大多数小鼠到出生后100天时达到末期。具有更高C57BL/6贡献的后代(例如，N2F2、N2F3)中的小鼠活得更久；到出生后200天时约40％达到末期。雄性和雌性小鼠表现出类似的疾病表型。半合子雄性可为不育的，或至少具有大大降低的配种能力(EricHuang，personal communication(个人通信)，2016年3月)。
特定表型表征
皮质神经元损失。皮质神经元无可检测到的损失；但感觉运动皮质中的神经元表现出降低的树突复杂性和降低的突触密度。
下运动神经元损失。P0时脊髓运动神经元无可检测到的差异。P16时，颈部脊髓前角中ChAT阳性神经元损失约20％。P30-P60时，前角神经元损失约50％。保留的运动神经元表现出降低的树突复杂性和突触密度。
神经胶质增生
到末期时脊髓前角中小神经胶质细胞增生和星形神经胶质增生突出增加。
肌肉萎缩
到末期时大多数小鼠的后肢具有严重的骨骼肌萎缩。
运动损伤
出生后早期运动损伤包括由尾巴提起时异常的后肢抱握、步态异常和受损的旋转棒表现。
体重
出生后早期发育迟缓，并且小鼠经历体重的进行性损失。
过早死亡
N1F1代中大多数的小鼠到出生后100天时达到末期并被处死。后代中的小鼠活得更久，到出生后200天时约40％达到末期。
治疗
口服施用烟酰胺核糖核苷和紫檀芪：185mg的烟酰胺核糖核苷和30mg的紫檀芪/Kg×天
神经学评分
通过视觉检查，在出生后第20天(P20)开始每周对小鼠进行神经学评分。神经学评分将基于Weydt等人的量表(2003)。“0”至“5”的评分被如下定义：“0”指示不具有ALS的典型征兆的健康小鼠；“1”指示存在疾病早期阶段中出现的后腿震颤；“2”指示在由其尾巴悬挂时难以分开其后腿的小鼠，这指示了肌无力；在小鼠展现绊倒或摇摆的行走困难时给出“3”；在小鼠不能以全部四条腿行走并且拖曳其后腿时给出“4”；在小鼠不能在30秒后使自己直立时给出“5”。在动物达到评分“4”时，通过将食物小球放在笼底上帮助所有转基因小鼠获取食物和水。达到评分“5”时，出于伦理原因对动物进行安乐死。发作被定义为小鼠表现症状(评分<4)≥2个连续周的最早时间。
旋转棒，悬挂线和倾斜面
在P20时开始，使用旋转棒装置(触摸屏旋转棒，Panlab)分析运动功能。将给每只动物进行三次试验，并且测量其可保持在旋转轴(直径3.5cm；旋转速度15rpm)上而不掉落的最大时段(秒)。试验将在180秒的任意极限后停止。在前2周，将在开始记录之前进行三次试验的适应期。
悬挂线试验在P20时开始并且每周在旋转棒试验前24小时进行。动物将被放在常规饲养笼的线盖上。在高于软表面(为了避免损伤)50cm处，将盖子轻轻地颠倒转动。对掉落的等待时间进行计时。每只小鼠被提供在最大180秒内至多三次尝试，并且记录最长时段。
倾斜面设备由被设定成0°角的铰接木制板组成。P20的动物将被头朝上地放在板上，并且以恒定速度抬升板子直至小鼠滑出板子。记录在不滑出的情况下达到的最大角度。
尾巴升高
在神经学评分的评估期间，从P20开始使用尾巴评分通过视觉检查每周测定尾巴升高。尾巴评分基于SHIRPA尾巴量表，是由英国MRC的Rogers等人开发的程序(Niimi和Takahashi 2009；Rogers等人，1997)。评分“0”至“3”被如下定义：“0”指示尾巴的垂直位置(最大升高)；“1”指示水平伸展的尾巴；“2”指示拖曳尾巴多于20秒；在尾巴展示近端挛缩和远端松弛时将给出“3”(具有该评分的小鼠将处于疾病的末期)。
红外运动传感活动系统的自动评价
如先前所描述的(Andrade等人，2010)，使用红外运动传感监测器(CoulbournInstruments，美国)，在旷场中通过自动记录基于运动时间的运动活动性，没有任何研究者介入地评价运动行为。实验室将为散射照明并保持恒温恒湿。小鼠将被单独放在聚乙烯笼子(37×17×30cm)中，笼子在壁顶上具有红外运动传感器，并且在30分钟的过程中以2分钟观测时间的区段进行记录。从所得数据中，计算以下因变量度参数：无运动时间，其被定义为在观测时间内动物不运动或运动少于0.01秒的时间的平均值(秒)；无运动事件是在观测时间内每一无运动时间记录的事件平均数；小运动时间，其被定义为在观测时间内动物在大于0.01秒但小于0.1秒的时间间隔内运动的时间的平均值(秒)；小运动事件是在观测时间内每一小运动时间记录的事件平均数；大运动时间，其被定义为动物在大于1.0秒的时间间隔内运动的时间的平均值(秒)；大运动事件是在观测时间内每一大运动时间记录的事件平均数。数据将被传输至计算机并通过特定软件分析。仅无运动、小运动和大运动事件数被用于评价。按对应如下的时段绘图：疾病的第一时段(P40-60)、第二时段(P70-80)、第三时段(P90-100)和第四时段或末期(P110-120)。
神经传导的潜伏期、速度和幅度输入坐骨神经(Alves等人，2011)。在P20、P40、P60、P80、P100和P120时记录小鼠电生理学测量结果，该小鼠被氯胺酮盐酸盐(盐酸氯胺酮)和地西泮(安定)(1ml/kg的含有11.25mg盐酸氯胺酮和0.375mg安定的溶液，IP)麻醉。
使用加热器保持正常体温。暴露坐骨神经并且使动物经受由测量复合运动动作电位(CMAP)组成的电生理学评价。这种评价的目的是检查神经电生理学完整性并且测量用于计算幅度之间的平均值、潜伏期之间的平均值和每个电位的传导速度之间的平均值中的参数。为了降低可能的干扰，在外科神经暴露后安装2个接地电极，电极中的一个是放在邻近神经的肌肉内的单极直针电极(26G)；另一个接地电极由316L不锈钢丝制造，并且其末端具有螺旋构造以便环绕神经并增大接触面积。用于CMAP刺激的双极电极由0.5mm直径的316L不锈钢丝制造，具有1mm的阳极-阴极间距离。在2通道肌电描记系统(Keypoint便携式；美敦力，丹麦，司考弗兰德(Skovlunde))上进行记录，高频滤波器设定在5kHz且低频滤波器设定在2Hz。电刺激产生假象；为了减少它们，使用具有0.04ms脉冲宽度的矩形单相电脉冲。对于CMAP测量，将刺激电极放在离记录电极1cm的距离的神经上，记录电极经过用同轴针在与外科手术同侧的爪的远端三分之一处经皮穿刺放在腓肠肌上。初始负偏转和二相波形指示运动点处的记录。诱发电位的潜伏期以毫秒度量。从这种记录的电位中，使用1cm的距离除以潜伏期来计算传导速度。
病理学
用于分离、制备和分析CNS的方法学遵循由Jordan WH、Young JK、Hyten MJ、HallDG，Preparation and analysis of the central nervous system，Toxicol Pathol，2011年1月，39(1)：58-65中详细描述的程序，该文献以其全文通过引用并入本文。
实施例5：评估烟酰胺核糖核苷和紫檀芪对肌萎缩性侧索硬化症的啮齿动物模型 中的运动协调性和平衡性的效果
该实施例的目的：
为了评价烟酰胺核糖核苷和紫檀芪的结合对ALS的小鼠模型中运动功能改进的效果，特别是与烟酰胺核糖核苷和白藜芦醇的效果进行比较。
方法
小鼠
1.B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J(https://www.jax.org/strain/004435)
伴随转基因表达人SOD1的G93A突变体形式，该SOD1-G93A(也被称为G93A-SOD1)转基因的小鼠半合子是能活的和能育的。该创始系(通常被称为G1H)被报告具有高转基因拷贝数。半合子展现类似于人肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的表型，一肢或更多肢变得麻痹，麻痹是因脊髓损失运动神经元。运动神经元退化与星形细胞(神经系统的主要神经胶质细胞类型)的功能和/或退化相关。转基因小鼠寿命缩短：在157.1+/-9.3天时50％存活(与混合B6SJL背景形成对比，其中在128.9+/-9.1天时观察到50％的存活)。雌性半合子产仔力差，在疾病发作前很少产下多于一窝仔。与LPS诱导的小神经胶质细胞和激活的M1/M2巨噬细胞形成对比，被疾病进展激活的脊髓小神经胶质细胞不上调展示对M1(神经中毒)表型或M2(保护)表型偏好的基因。SOD1G93A激活的小神经胶质细胞中基因表达的模式代表独特的ALS特异性特征。这些SOD1-G93A(也被称为G93A-SOD1)转基因小鼠用于研究包括肌萎缩性侧索硬化症的神经肌肉障碍。
SOD1-G93A转基因被设计为具有由其内源人SOD1启动子驱动的突变型人SOD1基因(在93位密码子处包含甘氨酸变丙氨酸的单氨基酸置换)。该转基因被注射入受精的B6SJLF1小鼠卵并且获得创始动物。混合的B6SJL遗传背景上的转基因小鼠被送至Jackson实验室(作为保存号002726)。到达后一些小鼠与C57BL/6J回交至少10代以产生该同类品系(保存号004435)。
2.对照/非载体
B6SJLF1/J(https://www.jax.org/strain/100012)小鼠通过C57BL/6J(B6)雌性小鼠与SJL/J(SJL)雄性小鼠之间杂交产生。B6SJLF1/J小鼠在其基因组中所有基因座处的B6和SJL等位基因均为杂合的。该品系通常用于产生转基因小鼠。
神经病理学
虽然SOD1 G93A转基因广泛表达，但在该模型中病理主要限制于脊髓(尤其是腰索)、脑干、下行脊髓束和神经肌肉接点。在临床症状发作前脊髓中产生多个病理标志，包括线粒体空泡化(Dal Canto和Gurney，Brain Res.1995；676(1)：25-40)，高尔基体片段化(Mourelatos等人，Proc Natl Acad Sci USA.1996；93(11)：5472-7)，神经丝阳性内含物(Tu等人，Proc Natl Acad Sci USA.1996；93(7)：3155-60)，类路易小体内含物(Dal Canto和Gurney，Brain Res.1995；676(1)：25-40)和细胞质SOD1聚集体(Johnston等人，ProcNatl Acad Sci USA 2000；97(23)：12571-6)。神经肌肉接点在大约47日龄退化；首先影响快疲劳运动神经元(Frey等人，JCell Biol.2000；149(7)：1443-54；Pun等人，NatNeurosci.2006；9(3)：408-19)。然后脊髓运动神经元相继死亡，到末期时颈段和腰段中约减少50％(Chiu等人，Mol Cell Neurosci.1995；6(4)：349-62)。
神经病理学不限于下运动神经元。在上运动神经元中，退化征兆包括膨胀的神经突、Gallyas银阳性聚集体、空泡和神经炎球状体。这些变化在约五月龄时出现，在脊髓中退化正在进行之后，并且通常不进展为彻底的神经元损失(Leichsenring等人，BrainRes.2006；1096(1)：180-95)。已观测到诸如三叉神经、面神经和舌下神经的颅细胞核的退化(Angenstein等人，Neuroreport.2004；15(14)：2271-4；Zang等人，Eur JNeurosci.2004；20(7)：1745-51)，并且存在年龄依赖性的下行皮质脊髓束、延髓束和红核脊髓束的退行(Zang和Cheema，Neurosci Lett.2002；332(2)：99-102)。
包括反应性小神经胶质细胞和星形细胞增生的神经胶质增生与脊髓中的运动神经元退化同时发展。GFAP和MAC1免疫反应性指示到117日龄时反应性神经胶质的增加(Hall等人，Glia.1998；23(3)：249-56)。
使用
这些小鼠多年来已被广泛研究，并且该研究奠定了关于ALS临床前研究的最新指南的基础(Ludolph等人，Amyotroph Lateral Scler.2010；11(1-2)：38-45)。对实验设计的建议包括使用足够的小鼠以充分驱动实验，使用性别和同窝仔均衡的实验组群，并且在所有原稿中报告该信息。考虑到拷贝数的重要性，应使用定量基因分型来确保所有实验动物具有预期拷贝数(Alexander等人，Brain Res Mol Brain Res.2004；130(1-2)：7-15)。
修改细节
这些转基因小鼠表达随机整合入小鼠的12号染色体的带有错义突变G93A的多拷贝人SOD1。
表型概要
皮质神经元损失：在运动皮层中已显示退化的证据(例如，膨胀的神经突、Gallyas阳性聚集体、空泡和神经炎球状体)。少见彻底的上运动神经元损失。
下运动神经元损失：观测到末期时脊髓的颈段和腰段中至多50％的运动神经元损失。
细胞质内含物：从82日龄起内含物在脊髓运动神经元中积累。内含物表现为球状体或类路易小体内含物的形式，并且通常包括各种神经元中间丝蛋白。TDP-43阳性内含物少见。
神经胶质增生：神经胶质增生与脊髓中的运动神经元退化同时发展。
神经肌肉接点异常：NM接点在大约47日龄退化。快疲劳运动神经元首先受影响。
肌肉萎缩：纵向MRI已显示从8周龄起肌肉体积减少。萎缩是进行性的。骨骼肌，包括肢和隔膜被影响。
运动损伤：运动损伤的征兆开始于3个月，具有导致麻痹的摇晃震颤。
体重：异常体重是疾病的最早征兆中的一种；观测到发育减缓和体重处于停滞。
过早死亡：小鼠到5月龄时达到末期。雌性通常存活地更久(多4-7天)。
治疗
口服施用烟酰胺核糖核苷、紫檀芪和白藜芦醇：向小鼠施用185mg烟酰胺核糖核苷和/或30mg紫檀芪或白藜芦醇每Kg每天。
结果
存活时间
图1示出比较小鼠组间存活时间的卡普兰-迈耶曲线。每周不同治疗组的存活小鼠数示于图2中。
神经学评分
该评分是基于Weydt等人的量表(Neuroreport 14：1051-1054，2003)。“0”至“5”的评分被如下定义：“0”指示不具有ALS的典型征兆的健康小鼠；“1”指示存在疾病早期阶段中出现的后腿震颤；“2”指示在由其尾巴悬挂时小鼠难以分开其后腿，这指示了肌无力；在小鼠展现绊倒或摇摆的行走困难时给出“3”；在小鼠不能以全部四条腿行走并且拖曳其后腿时给出“4”；在小鼠不能在30秒后使自己直立时给出“5”。在动物达到评分“4”时，通过将食物小球放在笼底上帮助所有转基因小鼠获取食物和水。达到评分“5”时，出于伦理原因对动物进行安乐死。发作被定义为小鼠表现症状(评分<4)时的最早时间。从第8周(P50)至第20周(P140)每周监测不同组中随时间的变化。每周测试动物数与图1中针对每组展示的相同。不同组的神经学评分示于图3中。
尾巴升高评分
该评分是基于SHIRPA尾巴量表，由英国MRC的Rogers等人开发的程序(Mamm.Genome 8：711-713，1997)。评分“0”至“3”被如下定义：“0”指示尾巴的垂直位置(最大升高)；“1”指示水平伸展的尾巴；“2”指示拖曳尾巴多于20秒；在尾巴展示近端挛缩和远端松弛时给出“3”(具有该评分的小鼠处于疾病的末期)。每周监测不同组中随时间的变化。每周测试动物数与图1中针对每组展示的相同。不同组的尾巴升高评分示于图4中。
旋转棒试验
该试验的功能包括评价受试者的平衡性、握力和运动协调性，尤其是在测试实验药物的效果上。对于该试验(旋转棒，Harvard Apparatus，马萨诸塞州，霍利斯顿)，给每只动物进行三次试验，并且测量其可保持在旋转轴(3.5cm直径；旋转速度：15rpm)上而不掉落的最大时段(秒)。每只小鼠被提供在1200秒的任意极限内至多三次尝试，并且记录最长时段。每周监测不同组中随时间的变化。每周测试动物数与图1中针对每组展示的相同。不同组的旋转棒试验结果示于图5中。
悬挂线试验
评价了CNS障碍的啮齿动物模型中运动功能和不足。对于该试验，动物被放在常规饲养笼的线盖上。在高于软表面(以便避免损伤)50cm处，将盖子轻轻地颠倒转动。对掉落的等待时间进行计时。每只小鼠被提供在最大180秒内至多三次尝试，并且记录最长时段。每周监测不同组中随时间的变化。每周测试动物数与图1中针对每组展示的相同。不同组悬挂线试验的结果示于图6中。
倾斜面试验
对于该运动评定试验，使用平坦滚动带(跑台，Harvard Apparatus)并且将其设定在5°角。动物被头朝上放在恒速(15cm/s)的板上。系统在跑台背面并入电击网格以在小鼠掉下板时产生轻度电击(0.2mA，持续最多3秒)。给每只小鼠进行两次试验，并且记录最大跑动距离和在试验期间接受电刺激数(不超过3秒)。在600秒的任意极限后或如果动物接受了>3秒的电刺激时停止试验。每周监测不同组中表现(performance)随时间的变化。表现表示为跑动距离(m)与接受电刺激数(不超过3秒)之间的比率。每周监测不同组中随时间的变化。每周测试的动物数与图1中针对每组展示的相同。不同组的倾斜面试验结果示于图7中。
自动评价运动活动性
借助红外运动传感活动监测器(IR Actimeter，Harvard Apparatus)测量图1中所指示的不同组中自发活动性(移动)随时间的变化。IR Actimeter由二维(X和Y轴)方框、框支架和控制单元组成。每个框由16×16红外光束组成以实现最佳对象检测。活动性表示为缓慢运动的时间(以秒计)(MS，在这期间受试者速度在静息与快速阈值之间的时间，2-5cm/s)或快速运动的时间(以秒计)(MF，在这期间受试者的速度高于快速阈值，>5cm/s)。静息时段被认为是在这期间受试者的速度低于静息阈值(<2cm/s)的时间段。在观测时段(30min)内以2min的区段进行记录。每周监测不同组中随时间的变化。数据被汇集成4个不同时段(第8-11周、第12-15周、第16-18周、第19-20周)并且显示于图8中。使用在指示的时段内每只小鼠表现的最大缓慢和快速运动数来计算平均值。每周测试的动物数与图1中针对每组展示的相同。
电生理学测量
在P50(第8周)和P126(第18周)监测在刺激坐骨神经后腓肠肌中诱发复合运动动作电位(CMAP)随时间的变化。在2通道肌电描记系统(Keypoint便携式；美敦力，丹麦，司考弗兰德)上进行记录，高频滤波器设定在5kHz且低频滤波器设定在2Hz。电刺激产生假象；为了减少它们，使用具有0.04ms脉冲宽度的矩形单相电脉冲。对于CMAP测量，将刺激电极放在离记录电极1cm距离的神经上，记录电极经过用同轴针在与外科手术同侧的爪远端三分之一处经皮穿刺而放在腓肠肌上。电生理学测量结果示于图9中。CMAP幅度的数据以毫伏表示，潜伏期的数据以毫秒表示，并且神经传导速度的数据以米每秒(m/s)表示。每个时间点和每组测试的动物数为n＝4。
病理学
用于分离、制备和分析CNS的方法学遵循由Jordan WH、Young JK、Hyten MJ、HallDG，Preparation and analysis of the central nervous system，Toxicol Pathol，(2011年)1月，39(1)：58-65中详细描述的程序，该文献以其全文通过引用并入本文。
统计学
数据呈现为针对若干不同实验的平均值±SD。使用学生氏t检验进行统计分析。
*P<0.05和**P<0.01比较所有SOD1组对比WT。
+P<0.05和++P<0.01比较用NR、PT、R或它们的组合治疗的所有SOD1组对比SOD1未治疗的对照。
aP<0.05和aaP<0.01比较SOD1+NR+PT组对比SOD1+NR。
SOD1与SOD1+R组之间或SOD1+NR与SOD1+NR+R组之间的比较未显示出显著差异。
结论
1.EH301(NR+PT)提高了SOD1小鼠存活率(图1和图2)。组合的效果好于NR(图1和图2)。仅PT不改进存活率(图1和图2)。
2.尽管有早期运动系统功能障碍的细胞和生化证据，但常规行为测试未在SOD1小鼠模型中检测到早期运动损伤。使用以下标准试验评价ALS小鼠的运动行为和表现的变化：神经学评分(图3)，尾巴升高(图4)，旋转棒(图5)，悬挂线(图6)，倾斜面/跑台(图7)，借助红外运动传感活动系统对运动活动性的自动记录(图8)，以及电生理学测量结果(在刺激坐骨神经后与腓肠肌中运动动作电位相关联的幅度、潜伏期和神经传导速度；图9)。结论是NR和EH301(NR+PT)而非单独的PT改进了运动功能(图3-图9)。在这点上，EH301(NR+PT)优于单独的NR(参见图3、图5、图6、图7和图8)。但益处仅在实验的最后数周观测到。因此，尽管有潜在的早期运动系统功能障碍的生化和分子证据，但运动表现和协调性的改变在时间上较晚发展。这一事实表明，生理适应的激活保持了运动神经元依赖性功能。在实践中明显的是该功能的进行性衰弱(并非突然丧失)。
3.观测到NR在保持运动动作电位中的效果(图9)。
4.白藜芦醇未表现出益处(图1和图2-图9)。
5.与NR和R的组合相比，NR和PT的组合表现出改进的效果。例如，如图2中所见，NR+PT组的存活率明显高于NR+R组的。如图4中所见，NR+PT组的神经学评分明显好于对照组(SOD1)和NR+R组(其基本上与NR组相同)。如图5中所见，NR+PT组在旋转棒实验中明显好于对照组(SOD1)和NR+R组。值得注意地，在该实验中NR+R组的结果甚至比NR组所显示的结果更差。从图6、7和8中可得到类似结论。
以引用方式并入
本文中提及的所有出版物、专利和专利申请以其全文通过引用并入本文，仿佛每一个单独的出版物、专利或专利申请被特定且单独地指示为通过引用并入。在冲突的情况下，将以本申请，包括本文中的任何定义为准。
等价物
本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规的实验法来确定对本文所述发明的特定实施方案的许多等价物。这类等价物意图由以下的权利要求书所涵盖。

Claims (23)

1.包含作为仅有的活性药物成分的紫檀芪和烟酰胺核糖核苷的组合物在制备治疗或预防受试者中的肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物中的用途。
2.包含作为仅有的活性药物成分的紫檀芪和烟酰胺核糖核苷的组合物在制备延缓或逆转受试者中的肌萎缩性侧索硬化症(ALS)进展的药物中的用途。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少40mg紫檀芪。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少50mg紫檀芪。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少60mg紫檀芪。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少100mg紫檀芪。
7.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少200mg紫檀芪。
8.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少300mg紫檀芪。
9.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少400mg紫檀芪。
10.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少500mg紫檀芪。
11.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少600mg紫檀芪。
12.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少200mg烟酰胺核糖核苷。
13.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少400mg烟酰胺核糖核苷。
14.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少600mg烟酰胺核糖核苷。
15.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少800mg烟酰胺核糖核苷。
16.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少1000mg烟酰胺核糖核苷。
17.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少1200mg烟酰胺核糖核苷。
18.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少1400mg烟酰胺核糖核苷。
19.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少1600mg烟酰胺核糖核苷。
20.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少1800mg烟酰胺核糖核苷。
21.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少2000mg烟酰胺核糖核苷。
22.如权利要求1或2所述的用途，其中每剂所述组合物包含至少2200mg烟酰胺核糖核苷。
23.如权利要求1或2所述的用途，其中所述组合物被配制为丸剂、片剂或胶囊。
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