CN111024634B - 基于普鲁士蓝的纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于普鲁士蓝的纳米探针、制备方法及其在过氧亚硝酸根离子的检测和成像中的应用，属于生物传感器技术领域，该纳米探针采用PB纳米探针、CuS@PB纳米探针中的任意一种，这两种纳米探针通过ONOO‑的氧化作用下改变铁离子的价态和PB的结构来实现PAI和MRI双模成像，实现了对ONOO‑灵敏度高、特异性好、无穿透深度限制的检测和成像，极大改善了以往探针存在的穿透深度差、特异性低的问题；本发明通过简单方法制备了PB纳米探针和CuS@PB纳米探针，制备流程短、操作简单、成本低。

Description

基于普鲁士蓝的纳米探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及基于普鲁士蓝的纳米探针及其制备方法和应用，具体涉及基于普鲁士蓝(PB)纳米探针在生物标志物过氧亚硝酸根离子(ONOO-)的检测和成像中的应用。
背景技术
过氧亚硝酸根离子(ONOO-)是一种典型的活性氧(ROS)，由一氧化氮(NO)和超氧阴离子自由基(O2 -·)的扩散控制耦合形成，在生理和病理过程中起着至关重要的作用。ONOO-的高反应活性和大量靶标的存在导致其较短的生物学半衰期(<10ms)，尽管ONOO-在信号转导和抗菌活性中起着至关重要的作用，但是过量的ONOO-会损害细胞的关键成分，包括脂质，DNA，蛋白质，硫醇和铁硫簇，细胞损伤的积累最终导致细胞凋亡和坏死。越来越多的证据表明，ONOO-与各种病理情况(如心血管疾病，神经退行性疾病，慢性炎症，局部缺血再灌注损伤和糖尿病)之间有着密切的相关性。因此，开发用于检测和监测ONOO-的技术对于理解ONOO-相关疾病的病理生理学和早期诊断非常重要。
目前检测ONOO-技术主要包括蛋白质染色，安培检测和光学检测。在这些技术中，硝化酪氨酸残基的蛋白质染色是一种间接技术，并且与活生物标本缺乏兼容性。安培检测需要一个刺激环境不适合体内使用。荧光检测由于具有高灵敏度，采集时间短，技术简单和高时间分辨率的优势被广泛用于检测生物系统中的生物活性分子，但是，荧光成像的发射范围是400至700nm，由于组织对光的广泛吸收和散射而限制了其组织穿透深度。另外，荧光成像通常依赖于荧光作为信号读出，而组织可能产生强烈的自发荧光，从而阻碍了体内检测的敏感度。生物发光目前也已经开发用于内源性ONOO-的成像，由于没有外部的激发光，它显示出高信噪比和相对较低的自发荧光，而且，该方法仅应用于表达荧光素酶的细胞或动物。除此之外，虽然化学发光检测ONOO-具有高灵敏度，但是强度低，半衰期短和发射波长短，这阻碍了在体内成像的应用。因此，设计穿透深度更深的方法来有效检测体内ONOO-的水平仍然是一个挑战。
光声成像(PAI)作为一种新兴的检测技术已被广泛应用于临床前研究。与其他成像方法相比，PAI是一种非侵入性和非电离成像，具有对比度更高，分辨率更高和组织穿透更深的优点。迄今为止，仅报道了少数几种光声(PA)探针可检测ONOO-的浓度。例如，Pu和他的同事们已经开发出了半导体聚合物纳米粒子(SPN)，用于体内对ONOO-进行实时比率型PAI。尽管它们的光声探针具有很高的灵敏度和相对较深的组织穿透力，但光学器件固有的穿透性所引起的限制尚未得到根本解决。因此，仍然有必要设计具有无穿透深度限制的探针，以弥补ONOO-单一的PAI的缺点。
目前，磁共振成像(MRI)广泛用于临床成像，可以补充有关深部组织的更多信息。磁共振探针能够影响探针周围的水质子弛豫，以产生MRI对比度。但是，在先前的MRI报道中，大多数策略都是“always on”磁共振(MR)信号，无论它们与癌症生物标记物接近或相互作用，这都会导致目标信号与背景信号之差，并且难以突出我们感兴趣的生物学现象。而对于MRI传感，MRI造影剂与分析物之间的相互作用会导致MR信号的变化(作为指示剂)，可以通过MRI的高空间分辨率和组织穿透性进行检测。最近，Qu和他的同事报道了通过MRI在体内检测ROS的方法，但是这种MRI探针缺乏对ONOO-的选择性。因此，响应特定生物标记物的可激活MRI探针的开发可以提高对目标分析物的敏感性和特异性。
所以，亟待开发一种纳米探针可以在灵敏度和穿透深度上实现对ONOO-特异性的检测和成像。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供基于普鲁士蓝的纳米探针及其制备方法和应用，基于普鲁士蓝(PB)的纳米探针首次发现可以被用于对ONOO-检测和成像，此过程的吸光度、光声信号和磁共振信号的变化可以实现对ONOO-的PAI和MRI双模成像，具有灵敏度高、特异性好、无穿透深度限制的优势。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明所述基于普鲁士蓝(PB)的纳米探针，所述纳米探针为单纯PB纳米探针或者基于PB修饰的纳米探针，这些纳米探针以含有混合铁离子价态的PB为主体，通过ONOO-的氧化作用改变铁离子的价态和PB的结构，导致吸光度、光声信号和磁共振信号的变化来实现PAI和MRI双模成像。
作为优选，所述单纯PB纳米探针的粒径为1～500nm，形态包含中空、介孔、中空介孔中的任意一种；所述基于PB修饰的纳米探针的粒径为1～1000nm。
更优选的，所述PB纳米探针的粒径为20～60nm；所述基于PB修饰的纳米探针的粒径为50～150nm。
作为优选，所述基于PB修饰的纳米探针为CuS@PB纳米探针，以CuS为核心，PB为壳的核壳结构。
本发明还提供所述单纯PB纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(a)配制合成PB的A和B液；
(b)室温搅拌下，在反应容器中预先加入B液，再缓慢滴入A液，搅拌处理0.5～2小时，得到深蓝色物质；
(c)离心处理，用去离子水洗涤沉淀，最后将得到的沉淀分散在去离子水中保存。
优选的方案，步骤(a)中，所述合成PB的A液为5mL含K4[Fe(CN)6](0.5～2mM)的柠檬酸溶液(10～50mM)；B液为5mL含FeCl3(0.5～2mM)的HCl溶液(10～50mM)。
优选的方案，步骤(c)中，将沉淀分散在水中，置于4℃的环境下保存。
本发明还提供所述CuS@PB纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制合成PB的A和B液；
(2)配制合成CuS的C液和D液；
(3)在室温搅拌下；将D液快速注入C液中，获得一种黄棕色的溶液，搅拌后将反应液加热处理，最终获得暗绿色溶液；
(4)反应液快速冷却，离心处理，用去离子水洗涤沉淀，最后分散在去离子水中保存，得到CuS基体；
(5)室温搅拌下，在步骤(4)制备的CuS基体中预先加入B液，再缓慢滴入A液，搅拌处理0.5～2小时，得到蓝绿色物质；
(6)离心处理，用去离子水洗涤沉淀，最后分散在去离子水中保存，即得。
优选的方案，步骤(2)中，所述合成CuS的C液为100mL包含CuCl2·2H2O(0.5～2mM)和柠檬酸钠(0.3～0.9mM)的水溶液；D液为1mL硫化钠溶液(50～200mM)。
优选的方案，步骤(3)中，将D液快速注入C液中，获得一种黄棕色的溶液，搅拌处理2～8分钟，然后反应液加热到80～100℃维持10～30分钟，最终获得暗绿色溶液。
优选的方案，步骤(4)中，反应液用冰水冷却，将沉淀分散在水中，置于4℃的环境下保存。
优选的方案，步骤(5)中，所述CuS为0.5～2mM，10mL；A液为5mL含K4[Fe(CN)6](0.5～2mM)的柠檬酸溶液(10～50mM)；B液为5mL含FeCl3(0.5～2mM)的HCl溶液(10～50mM)。
本发明还提供了所述基于普鲁士蓝的纳米探针在过氧亚硝酸根离子的检测和成像中的应用。
进一步，检测和成像方法包括了用吸光度、光声信号和磁共振信号的变化来对过氧亚硝酸根离子进行检测和成像。
本发明具有以下有益技术效果：
本发明制备了两种用于ONOO-检测和成像的探针：PB纳米探针、CuS@PB纳米探针，这两种纳米探针分别由含有混合铁离子价态的PB和对ONOO-惰性的CuS为主体，通过ONOO-的氧化作用改变铁离子的价态和PB的结构来实现PAI和MRI双模成像，实现了对ONOO-的灵敏度高、特异性好、无穿透深度限制的检测和成像，极大改善了以往探针存在的穿透深度差、特异性低的问题。
本发明所述PB纳米探针和CuS@PB纳米探针是基于我们团队首次发现了PB能对ONOO-响应这一现象，该响应被用于通过PA和MRI成像进行ONOO-的检测和成像；由于ONOO-的强氧化性，PB中的Fe2+被氧化成Fe3+，从而导致电子转移减弱，并伴随着近红外吸收的显着降低和PA710信号的降低，重要的是，这种响应性PA信号首次通过PA成像技术开发用于ONOO-的传感和成像。
为了提高PA成像的精确度，我们团队设计了以CuS为核心，PB为壳的核壳结构纳米探针，由于CuS对ONOO-的光学稳定性，PA970的信号不会发生明显变化，所以被用作PA成像的内参；使用PA970/PA710的比值，可以更容易和准确地检测体内ONOO-的水平，这可以克服探针局部浓度，孵育时间和注射剂量的影响；此外PB对ONOO-的响应使PB的结构被破坏，尺寸的减小导致旋转相关时间(τR)减少，从而弛豫率(r)减小，因此，PB的可激活MRI信号可以特异性检测ONOO-并提供更精确的深部组织成像，这种双模成像方法可以使本发明所述基于普鲁士蓝的纳米探针具有更好的准确性，特异性，敏感性和穿透深度，可用于ONOO-的检测，成像和可视化(作用过程如图1所示)。
本发明通过简单的方法制备了PB纳米探针和CuS@PB纳米探针，制备流程短、操作简单、成本低。
本发明还提供了所述PB纳米探针和CuS@PB纳米探针在ONOO-的氧化作用下改变铁离子的价态和PB的结构来实现PAI和MRI双模成像，实现了对ONOO-灵敏度高、特异性好、无穿透深度限制的检测和成像，极大改善了以往探针存在的穿透深度差、特异性低的问题，并且成功实现在LPS诱导的炎症和APAP造成的肝损伤中对ONOO-成像，对于理解ONOO-相关疾病的病理生理学和早期诊断具有非常重要的指导意义。
附图说明
图1为基于PB结构来实现对ONOO-进行PAI和MRI双模成像过程示意图。
图2为PB的透射电镜图。
图3为PB检测ONOO-后DLS粒径的变化。
图4为PB检测ONOO-吸收谱图。
图5为验证PB对ONOO-响应的吸收谱图。
图6为PB光声检测ONOO-的谱图。
图7为PB光声检测ONOO-时710nm处的光声信号变化。
图8为PB磁共振检测ONOO-时的1/T1变化。
图9为PB磁共振检测ONOO-时的1/T2变化。
图10为PB通过光声成像来检测APAP诱导肝损伤而产生的ONOO-。
图11为PB通过磁共振成像来检测APAP诱导肝损伤而产生的ONOO-。
图12为图11所示区域T2信号在注射APAP前后的比值。
图13为CuS@PB的透射电镜图。
图14为CuS@PB的DLS粒径图。
图15为CuS@PB检测ONOO-的吸收光谱图。
图16为CuS@PB检测ONOO-时，A970/A970变化图。
图17为CuS@PB对不同分析物响应的特异性探究。
图18为CuS@PB光声检测ONOO-时，PA970/PA970变化图。
图19为CuS@PB比率型光声检测LPS诱导炎症产生的ONOO-。
图20为图19中所示区域的PA970/PA970比值。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1单纯PB纳米探针的制备：
将5mL含K4[Fe(CN)6](1mM)的柠檬酸溶液(30mM)缓慢加入5mL含FeCl3(1mM)的HCl溶液(25mM)中；在室温下，然后再剧烈搅拌60分钟；然后，将获得的PB纳米颗粒离心并用超纯水洗涤3次，以去除过量的未反应离子，并保存在4℃。
图2为实施例1所得PB的透射电镜图，从图2可以看出合成的PB粒径为35nm左右。
实施例2PB检测ONOO-的能力验证
采用实施例1所得PB，快速将10μL不同浓度的ONOO-溶液(例如0、40、80、120、160和200μM)加入到含有PB溶液的190μL PBS(pH＝7.4)中；
PB的最终浓度为3.8μg/mL，10分钟后通过紫外-可见光谱吸收进行测试；并选取ONOO-浓度为0和200μM的两个样品用DLS去测试粒径变化。
此外，使用ONOO-供体5-氨基-3-(4-吗啉基)-1,2,3-恶二唑盐酸盐(SIN-1)确认PB的响应确实是由ONOO-引起的，而不是反应体系中其它物质导致的。将PB与SIN-1在PBS(0.1mg/mL，pH＝7.4)中孵育5小时后，与未处理的PB相比，PB经SIN-1处理后的吸收(3μg/mL)大大降低。
图3为PB检测ONOO-后DLS粒径的变化，从图3可以看出PB的尺寸在对ONOO-响应后减小了。
图4为PB检测ONOO-的能力验证，从图4可以看出PB具有良好的检测ONOO-的性能。
图5为验证PB吸收的减少是由ONOO-引起的，从图5可以看出PB确实能对ONOO-响应并且伴随着吸收的下降。
分析：PB在近红外处(710nm)处具有很强的吸收是因为Fe2+与Fe3+之间的电子转移所致。由于ONOO-的强氧化性，PB中的Fe2+被氧化成Fe3+，从而导致电子转移减弱，并伴随着近红外吸收的显着降低。
实施例3PB通过光声成像检测ONOO-的能力验证
采用实施例1所得PB，快速将20μL不同浓度的ONOO-溶液(例如0、40、80、120、160和200μM)加入到含有PB溶液的380μL PBS(pH＝7.4)中。PB的最终浓度为9.5μg/mL，10分钟后进行光声成像。
图6为PB光声检测ONOO-的能力验证，从图6可以看出PB在近红外区域的光声信号随着ONOO-浓度的增加而减弱。
图7为PB光声检测ONOO-时710nm处的光声信号与ONOO-浓度之间的关系，从图7可以看出PB检测ONOO-时，710nm处的光声信号与ONOO-浓度存在负相关关系。
分析：由于ONOO-使PB得近红外吸收的显着降低，所以体系获得的能量减少，相应的非辐射跃迁也减少，热膨胀减少，所以光声信号减弱。
实施例4PB通过磁共振成像检测ONOO-的能力验证
采用实施例1所得PB，快速将10μL不同浓度的ONOO-溶液(例如0、1.5、3、4.5、6和7.5mM)加入到含有PB溶液的190μL PBS(pH＝7.4)中。PB的最终浓度为207.5μg/mL，10分钟后进行磁共振成像。
图8和图9为PB磁共振检测ONOO-的能力验证，从图8和图9可以看出随着ONOO-浓度的增加，1/T1和1/T2均逐渐降低，驰豫率(r)减小，并且1/T1或1/T2与ONOO-浓度之间具有良好的线性关系。
分析：当响应ONOO-时，PB的结构被破坏并且尺寸减小。这种变化可能会导致旋转相关时间(τR)减少，从而导致驰豫率(r)减小。
实施例5PB通过光声成像来检测APAP诱导肝损伤而产生的ONOO-
采用实施例1所得PB，首先小鼠尾静脉注射含PB(200μL，172μg/mL)的PBS，11小时后腹膜内分别注射APAP(200μL，30mg/mL)和生理盐水(200μL)。在APAP注射之前和之后3小时，用含异氟烷的氧气将小鼠麻醉，使用710nm的激发波长用于光声成像。
图10为PB通过光声成像来检测APAP诱导肝损伤而产生的ONOO-的光声图片，从图10可以看出APAP组在经APAP处理后710nm处的光声信号明显弱于生理盐水组，这说明APAP刺激后肝脏中的ONOO-氧化了PB，导致其光声信号下降。这表明PB可以监测APAP刺激后肝脏中的ONOO-波动。
实施例6PB通过磁共振成像来检测APAP诱导肝损伤而产生的ONOO-
采用实施例1所得PB，首先小鼠尾静脉注射含PB(200μL，516μg/mL)的PBS，5小时后腹膜内分别注射APAP(200μL，30mg/mL)和生理盐水(200μL)。在APAP注射之前和之后3小时，用含异氟烷的氧气将小鼠麻醉，以进行7T磁共振成像扫描。
图11为PB通过磁共振成像来检测APAP诱导肝损伤而产生的ONOO-的磁共振图片，从图11可以看出APAP组在经APAP处理后T2信号强度强于生理盐水组，这说明APAP刺激后肝脏中的ONOO-使PB的结构发生变化，尺寸减小导致旋转相关时间减小，所以弛豫率下降，T2信号强度增强。这表明PB可以通过磁共振成像来检测APAP刺激后肝脏中的ONOO-的浓度。
图12为图11所示区域内的T2信号强度注射APAP前后的比值，图12可以更直观的看出APAP组在经APAP处理后T2信号强度强于生理盐水组。
实施例7CuS@PB纳米探针的制备
首先在室温下搅拌下，将1mL硫化钠溶液(0.0078g，0.1mmol)添加到100mL包含CuCl2·2H2O(0.017g，0.1mmol)和柠檬酸钠(0.02g，0.068mmol)的水溶液中。5分钟后，将反应混合物加热至90℃并搅拌15分钟，直到获得深绿色溶液。然后，将混合物在冰浴中迅速冷却至室温，离心洗涤获得柠檬酸盐包覆的CuS纳米粒子。在室温下，将5mL含K4[Fe(CN)6](1mM)的柠檬酸溶液(30mM)与10mL柠檬酸改性的CuS悬浮液(1mM)缓慢混合。然后，将5mL含有FeCl 3(1mM)的HCl溶液(25mM)滴加到上述混合溶液中。在室温下再剧烈搅拌60分钟后，将获得的CuS@PB纳米颗粒通过离心纯化，并保存在4℃。
图13和图14为实施例5所得CuS@PB的透射电镜图和DLS粒径图，从图13可以看出合成了CuS@PB核壳结构，图14显示粒径为105nm左右。
实施例8CuS@PB比率型检测ONOO-的能力验证
采用实施例5所得CuS@PB，快速将10μL不同浓度的ONOO-溶液(例如0、40、80、120、160、200、400和600μM)加入到含有CuS@PB溶液的190μLPBS(pH＝7.4)中。CuS@PB的最终浓度为9.5μg/mL，10分钟后通过紫外-可见光谱吸收进行测试。
图15为CuS@PB检测ONOO-的吸收光谱图，从图15可以看出CuS@PB的吸收在710nm附近的下降比较明显，而970nm处几乎不变，说明CuS@PB这种核壳结构的纳米探针能作为比率型探针检测ONOO-。
图16为CuS@PB检测ONOO-时，970nm和710nm处的吸收比值(A970/A970)变化图，从图16可以看出CuS@PB中的A970/A970的比值可以用来检测ONOO-的浓度。
分析：因为CuS对ONOO-时光学惰性的，所以其在970nm处的吸收几乎不受ONOO-的影响，而PB在710nm处的吸收会降低。因此A970/A970的比值只收到单一变量(ONOO-)的影响，就可以用来在活体内更加精确的检测ONOO-。
实施例9CuS@PB特异性检测ONOO-的能力验证
采用实施例5所得CuS@PB，快速将10μL 500μM的不同分析物溶液，例如过氧亚硝酸根离子(ONOO-)，羟基自由基(·OH)，超氧阴离子自由基(O2 ·-)，谷胱甘肽(GSH)，次氯酸根离子(ClO-)，亚硫酸根离子(SO3 2-)，过氧化氢(H2O2)，半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)，加入到含有CuS@PB溶液的190μL PBS(pH＝7.4)中，CuS@PB的最终浓度为9.5μg/mL，10分钟后通过酶标仪对710nm和970nm处的吸收进行测试。
图17为CuS@PB对不同分析物响应时，970nm和710nm处的吸收比值(A970/A970)变化图，从图17可以看出CuS@PB中的A970/A970的比值可以用来特异性检测ONOO-。
实施例10CuS@PB比率型光声检测ONOO-的能力验证
采用实施例5所得CuS@PB，快速将20μL不同浓度的ONOO-溶液(例如0、40、80、120、160和200μM)加入到含有CuS@PB溶液的380μL PBS(pH＝7.4)中。CuS@PB的最终浓度为12.6μg/mL，10分钟后收集970nm和710nm的光声信号。
图18为CuS@PB比率型光声检测ONOO-的能力验证，从图18可以看出CuS@PB在970nm和710nm的光声信号的比值(PA970/PA970)随着ONOO-浓度的增加而增加，并且还存在很好的线性关系。
实施例11CuS@PB比率型光声检测LPS诱导炎症产生ONOO-的能力验证
首先分别用25μL脂多糖(LPS)(8mg/mL)或生理盐水预处理小鼠的右后背或左后背4小时。然后，对预处理区域进行皮下注射含CuS@PB(25μL，16μg/mL，pH＝7.4)的PBS或含CuS@PB(2 5μL，16μg/mL，pH＝7.4)+GSH的PBS(25μM)；一小时后用含异氟烷的氧气将小鼠麻醉，用激发波长分别为710nm和970nm进行光声成像。
图19为CuS@PB比率型光声检测LPS诱导炎症产生ONOO-的光声图片，从图19可以看出，在970nm处光声图片亮度差不多的情况下，LPS刺激组在710nm处的光声图片亮于生理盐水和GSH处理组，这说明我们的CuS@PB比率型探针可以用于检测LPS诱导炎症产生ONOO-。
图20为图16中所示区域的PA970/PA970比值，从图20也可以看出CuS@PB可以通过PA970/PA970比值灵敏地监测体内LPS诱导炎症产生ONOO产生情况。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种基于普鲁士蓝(PB)的纳米探针，其特征在于，所述纳米探针为基于普鲁士蓝PB修饰的纳米探针，基于普鲁士蓝PB修饰的纳米探针为CuS@PB纳米探针，以CuS为核心，普鲁士蓝PB为壳的核壳结构；纳米探针以含有混合铁离子价态的普鲁士蓝PB为主体，通过ONOO-的氧化作用改变铁离子的价态和普鲁士蓝PB的结构，导致吸光度、光声信号和磁共振信号的变化来实现PAI和MRI双模成像。
2.根据权利要求1所述基于普鲁士蓝的纳米探针，其特征在于，单纯普鲁士蓝PB的粒径为1~500nm，形态包含中空、介孔、中空介孔中的任意一种；所述基于普鲁士蓝PB修饰的纳米探针的粒径为1~1000nm。
3.一种根据权利要求1所述基于普鲁士蓝(PB)的纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
(1) 配制合成普鲁士蓝PB的A和B液；
(2) 配制合成CuS的C液和D液；
(3) 在室温搅拌下；将D液快速注入C液中，获得一种黄棕色的溶液，搅拌后将反应液加热处理，最终获得暗绿色溶液；
(4) 反应液快速冷却，离心处理，用去离子水洗涤沉淀，最后分散在去离子水中保存，得到CuS基体；
(5) 室温搅拌下，在步骤(4)制备的CuS基体中预先加入B液，再缓慢滴入A液，搅拌处理0.5~2小时，得到蓝绿色物质；
(6) 离心处理，用去离子水洗涤沉淀，最后分散在去离子水中保存，即得。
4.根据权利要求3所述基于普鲁士蓝(PB)的纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述合成CuS的C液为100 mL包含CuCl2•2H2O和柠檬酸钠的水溶液，CuCl2•2H2O的摩尔浓度为0.5~ 2 mM，柠檬酸钠的摩尔浓度为0.3~ 0.9 mM；
D液为1 mL硫化钠溶液，硫化钠的摩尔浓度为50~ 200 mM。
5.根据权利要求3所述基于普鲁士蓝(PB)的纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将D液快速注入C液中，获得一种黄棕色的溶液，搅拌处理2~8分钟，然后反应液加热到80~100℃维持10~30分钟，最终获得暗绿色溶液。
6.根据权利要求3所述基于普鲁士蓝(PB)的纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述CuS为0.5~ 2 mM，10 mL；A液为5 mL含K4[Fe(CN)6]的柠檬酸溶液，K4[Fe(CN)6]的摩尔浓度为0.5~ 2 mM，柠檬酸的摩尔浓度为10~ 50 mM；
B液为5 mL含FeCl3的HCl溶液，FeCl3的摩尔浓度为0.5~ 2 mM，HCl溶液的摩尔浓度为10~ 50 mM。
7.根据权利要求1~3中任一项所述基于普鲁士蓝(PB)的纳米探针在过氧亚硝酸根离子的检测和成像中的应用，通过吸光度、光声信号和磁共振信号的变化来对过氧亚硝酸根离子进行检测和成像。
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