CN111013674B - 一种用于致病菌的快速富集及原位检测的细菌传感芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于环境空间中致病菌快速富集及原位检测的细菌传感芯片。所涉及的细菌传感芯片包括带进气/液口的上层壳体，微孔网状电极、带出气/液口和平板对电极的下层壳体、L形流体通道，上下壳体通过垫圈密封，用以实现环境空间中致病菌的快速过滤富集及原位检测。细菌传感芯片的核心部件微孔网状电极为网状金属结构，具有透气效能，通过复合水凝胶对其表面进行修饰和改性，控制微孔尺寸，可实现环境空间中致病菌的高效吸附，同时实现原位电检测。所涉及的细菌传感芯片具有样本无需前处理、无需标记、快速、简便等优点，适用于环境空间中致病菌的快速富集及原位检测。

Description

一种用于致病菌的快速富集及原位检测的细菌传感芯片
技术领域
本发明属于环境监测、生化传感领域，具体涉及细菌传感芯片。
背景技术
环境空间中微生物种类繁多，包括细菌、真菌和病毒等，其极易吸附于空气颗粒物表面并可进入人的肺部，对人体的健康造成严重的危害。空气中致病菌含量是环境空气监测的重要指标之一，尤其是针对医院、畜牧场、养殖场等特殊环境空间。因此，空气中致病菌的研究对环境安全及呼吸道疾病的传播规律研究和控制都有十分重要的意义。目前，对于空气中致病菌的检测主要参照现行标准GB/T 18204.3-2013，以撞击法或自然沉降法采集，通过平板培养和计数的方法测定空气中致病菌，存在步骤繁琐耗时长的问题。因此，寻求空气中致病菌快速富集和检测的新方法和新途径，满足空气中致病菌快速检测与鉴别的需求，成为环境空气检测关注的热点和重点。
环境空间中致病菌的采集法主要有自然沉降法、固体撞击法、液体冲击法、过滤法、静电沉降法以及微流控芯片技术。自然沉降法、固体撞击法及液体冲击法最为常用，但致病菌富集后需通过培养，再辅以分子生物学方法实现检测及鉴定，耗时耗力。静电沉降法虽然富集效率高，但施加电场产生的电荷容易破坏细菌的活性，且使用条件受限。过滤法原理简单、成本低廉，捕获效率高等优势而备受关注。目前已有基于过滤原理的环境空间中致病菌富集装置及方法的相关专利报道，申请号为“200610169705.1”的“一种富集空气微生物的方法与专用装置”专利是基于直接吸入滤过式原理，设计制作富集空气中微生物的装置与方法，对空气中的微生物进行过滤富集。进而，对富集的微生物进一步核酸提取、纯化，再结合分子生物学测试法实现检测及鉴定。微流控芯片技术富集效率高，洗脱液体积小，操作简单，易于集成，也成为空气微生物快速检测的理想工具之一。有研究[1]（Anal. Chem.2013, 85, 5255-5262）采用带有独特的鱼骨结构的微流控芯片，利用鱼骨结构对空气产生扰动, 引起气流混乱, 实现微生物颗粒的吸附, 具有富集速度快、效率高、洗脱体积小的优点。有研究[2]（Sensors and Actuators B, 2018, 258: 1138-1145）结合过滤技术和微流控芯片技术两者的优势，将微过滤器与环介导等温扩增技术（LAMP）集成到一张PDMS芯片上用于对空气微生物进行富集和检测。采样完成后在过滤膜上滴加裂解液，完成DNA的提取，并将提取液人工转移至LAMP腔室，完成后续细菌的检测。可以看到，尽管现有致病菌快速检测的方法，如PCR法、酶联免疫法、荧光标记法、电阻抗法等可满足环境空间中致病菌的检测，但仍处于富集与检测分离的现状。
发明内容
本发明目的是针对环境空间中致病菌富集效率低、检测时间长等不足，提供一种环境空间中致病菌的快速富集及检测的细菌传感芯片，基于过滤富集、微流体控制、电阻抗传感原理，结合电极表面材料改性技术、激光刻蚀和数字雕刻加工技术，实现环境空间中致病菌的高效、原位检测及鉴别。
本发明的技术方案如下：
一种环境空间中致病菌的快速富集及原位检测的细菌传感芯片，该芯片具有至少一个单元结构，所述单元结构包含带进气/液口的上层壳体、带出气/液口的下层壳体以及夹装在两者之间的电极，是一种三维夹心结构。以此为该单元结构，可进一步通过共用一个出液/出气口，实现多个集成，构成阵列式细菌传感芯片。
所述电极包括微孔网状电极和平板对电极，所述微孔网状电极是通过凝胶修饰和改性的，其设置在上层壳体的进气/液口下方，所述平板对电极设置在微孔网状电极下方的下层壳体的凹槽中，与微孔网状电极之间留有空间；所述下层壳体的出气/液口开设在凹槽侧壁；
从所述上层壳体的进气/液口，经过微孔网状电极的微孔，到下层壳体的凹槽，在到下层壳体的出气/液口，连通构成芯片的流体通道，流体通道呈L型。
所述细菌传感芯片当包含两个或以上单元结构时，可以通过共用一个出液/出气口，实现集成，构成阵列细菌传感芯片。
使用时，在出气/液口连通真空泵，施加负压，使空气/水样从进气/液口进入细菌传感芯片，通过微孔网状电极实现空气中致病菌的过滤富集；采样完成后将细菌传感芯片的微孔网状电极与工作电极相连，平板对电极与参比电极相连，从进液口注入电解液，测得电阻抗谱，实现环境空间中致病菌的原位电阻抗检测。
针对致病细菌的捕获和富集需求，所述微孔网状电极采用壳聚糖水凝胶、复合壳聚糖-碳纳米管水凝胶、复合壳聚糖-金纳米颗粒水凝胶等多种凝胶材料进行表面修饰。
所述微孔网状电极选择金、铂、铜、铝等材料，具有10 μm~75 μm孔径的微孔，所述微孔可为三角形、正四边形、菱形、多边形、圆形等。
所述壳体材料优先选择PMMA、特氟龙或不锈钢。
所述上层壳体的进气/液口的半径为2~20mm；所述下层壳体的凹槽的半径为2~20mm，深为1~10mm，用于平板对电极的固定。
所述上层壳体和下层壳体之间通过密封垫圈密封，所述密封垫圈嵌装在上层壳体和下层壳体相对的环槽中。
所述微孔网状电极的边缘通过密封垫圈支撑。
所述密封垫圈优选为带有大孔径的尼龙/锦纶/不锈钢网，孔径为300~1000μm。
采用上述技术方案，本发明主要有以下效果：
1、本发明是针对环境空间中致病菌快速检测的需求，提出将分离富集、微流控芯片分析、电阻抗检测等多种技术结合，构建环境空间中致病菌快速检测的阵列式细菌传感芯片。通过设计和构建微孔网状电极结构、微流体微通道以及微孔电极表面改性等，实现致病菌的高效富集，通过在传感芯片上集成无需标记、快速、简便的致病菌检测途径和方法，实现环境空间中致病菌的高效、原位检测及鉴别。
2、本发明的核心部件微孔网状电极为网状金属结构，具有透气效能，通过复合水凝胶对其表面进行修饰和改性，控制微孔尺寸，凝胶修饰的微孔网状电极可过滤富集环境空间中致病菌，同时实现原位阻抗检测，由此可以有效提高对环境空间中致病菌快速检测的效率。
3、本发明采用的水凝胶修饰微孔网状电极具有良好的致病菌捕获能力。本发明提出采用多种金属或导电材料作为微孔网状电极，采用多种对细菌有响应的水凝胶或复合水凝胶材料作为微孔网状电极的表面修饰膜，这些表面修饰的凝胶材料的引入，可有效改善电极表面的物理性质、化学性质及生物相容性，增强电极与细菌的相互作用力，有利于提高致病菌富集效率，且水凝胶膜材料可保证致病菌的原始形态；同时，其还能有效提高微孔网状电极的导电性能，有利于实现环境空间中致病菌富集后的原位高效检测。
附图说明
图1 是细菌传感芯片的单元结构分解剖面图。
图2 阵列细菌传感芯片的示意图。
图3 以裸铜网为电极的细菌传感芯片富集金葡菌前后的测得电阻抗Bode图。
图4 实施例3以CS-铜网为电极的细菌传感芯片富集金葡菌前后的测得电阻抗Bode图。
图5是实施例4以PDA-CS-铜网为电极的细菌传感芯片富集金葡菌前后的测得电阻抗Bode图。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明的结构和工作方式：
参见图1，本发明提出的环境空间中致病菌的快速富集及原位检测的阵列式细菌传感芯片是一种三维夹心结构，每个单元都包含：带进气/液口的上层壳体1，微孔网状电极3、带出气/液口和平板对电极4的下层壳体2和密封垫圈5。上壳体1和下壳体2通过密封垫圈5密封，四个角以螺丝螺母固定。
所述壳体材料均可选择PMMA、特氟龙、不锈钢等。
所述上层壳体1有半径为2~20mm的开口圆孔a，作为进气/液口；距开口外边缘1~6mm处，有半径差为1~5mm，深为1~10mm的同心环凹槽c，用于密封垫圈的固定。
所述微孔网状电极3可选择金、铂、铜、铝等材料，作为工作电极，有10 μm~75 μm孔径的微孔网状结构，具有透气效能。所述微孔可为三角形、正四边形、菱形、多边形、圆形等。通过恒电位沉积的方法将壳聚糖水凝胶、复合壳聚糖-碳纳米管水凝胶、复合壳聚糖-金纳米颗粒水凝胶或海藻酸钠水凝胶等对微孔网状电极表面进行修饰与改性。
所述下层壳体2有半径为2~20 mm，深为1~10mm的凹槽d，用于平板对电极4的固定.距凹槽外边缘1~6mm处，有半径差为1~5mm，深为1~10mm的同心环凹槽e，用于密封垫圈5的固定。凹槽侧壁有1~5mm的开口圆孔b，作为出气/液口。
所述密封垫圈5可选择硅胶、氟胶等材质，内径1~30 mm，外径为2~35 mm的同心圆环；圆环为带有大孔径的尼龙/锦纶/不锈钢网，用于固定导线，支撑微孔网状电极；孔径为300~1000μm。
本芯片中，流体通道贯穿细菌传感芯片，以上层壳体的中心圆孔为入口（图1中a），通过微孔网状电极，实现环境空间中致病菌的过滤截留，连接下层壳体的凹槽，并以凹槽侧壁圆孔作为出口b，整个流体通道呈竖立的“L”形。
如图2所示，所述传感芯片的单元结构可通过设置共用出气/出液口，实现多个集成，构成阵列式细菌传感芯片，用于环境空间中致病菌的快速富集及检测。
以下以实施例来详细说明本发明的具体制作与使用：
实施例1 微孔铜网电极表面修饰
将0.5%壳聚糖水溶液作为电解质。将铜网（孔径：200目，尺寸：10×10mm）作为工作电极，铂片电极作为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极进行铜网表面的修饰。施加-0.9 V电压，沉积20 min，取出铜网，去离子进行冲洗，得到Chi水凝胶修饰的铜网，将其裁剪为7×7mm。用于和所设计的电阻抗传感器集成。显微镜观测裸铜网和壳聚糖修饰的铜网，可发现壳聚糖成功的修饰到铜网表面。
实施例2 细菌传感芯片制作
细菌传感芯片为三层的夹心结构，包含：PMMA壳体、微孔铜网电极以及L形流体通道。
上层壳体1为4×4cm的PMMA板，中心有一个圆孔用作气体/液体进口a，圆孔直径为8mm。上层壳体下表面有一个同心圆环槽c，用于固定密封垫圈5。圆环槽内直径10mm，外直径19mm，深度为1.5mm。圆孔和同心圆环槽之间有一个1mm宽的柱子，用以固定铜网。
微孔铜网电极3是一个直径为8mm的圆片，孔径为75μm，采用壳聚糖水凝胶进行修饰，如实施例1。
下层壳体2为4.6×4.6 cm的PMMA板，上表面中心刻有直径为8mm，深为3mm的圆形凹槽d，用以固定采用铜片制作的平板对电极4。距凹槽边缘1mm处有一个同心圆环凹槽e，内直径10mm，外直径19mm，深度为1.5mm，用于固定密封垫圈5。圆形凹槽d侧面打有一个直径为2mm的圆孔，用作气体/液体出口b。
密封垫圈5用于上下层PMMA壳体的密封，外直径为19mm，内直径为10mm；垫圈中间有不锈钢网，用于连接微孔网状电极的外接导线，孔径为500μm。
流体通道贯穿细菌传感芯片，以上层PMMA壳体上的圆孔为入口a，通过微孔网状电极3，致病菌的过滤截留，连接下层PMMA壳体的凹槽d，并以下层PMMA壳体侧壁圆孔作为出口b，整个流体通道呈竖立的“L”形。
最终，PMMA壳体四个角以螺丝固定，得到可用于环境空间中致病菌富集及原位检测的细菌传感芯片。
实施例3 含菌气溶胶中金黄色葡萄球菌的捕获和检测
对实施例1和实施例2中构建的细菌传感芯片进行应用测试。采用超声雾化器制备合成金葡菌气溶胶。将细菌传感芯片放入合成金葡菌气溶胶的密闭箱中，细菌传感芯片的出口通过PVC软管连接C30L-43H微型真空泵，开启真空泵，负压下5min实现金葡菌的过滤富集。采样完成后，在流体通道中注入超纯水，将细菌传感芯片的微孔网状电极通过导线与电化学工作站的工作电极相连，平板对电极与电化学工作站的对电极和参比电极相连，从进液口注入电解液，设定EIS测试条件，测得电阻抗谱，实现环境空间中致病菌的原位电阻抗检测。
图3和图4分别显示了用裸铜网作为电极和以实施例1的所示壳聚糖修饰的铜网（CS-铜网）作为电极，细菌传感芯片富集金葡菌前后的测得电阻抗Bode，通过测得的Bode曲线可知，该细菌传感芯片可更好地实现环境空间中金葡菌的富集及原位电阻抗检测。
实施例4 微孔铜网电极表面修饰
将实施例1获得的壳聚糖修饰的铜网浸入2.5%的戊二醛溶液，室温下浸泡2h，将CS-铜网取出，采用超纯水冲洗后，浸入100μmol/mL的盐酸多巴胺溶液中，浸泡2h，取出CS-铜网，采用超纯水冲洗，得到多巴胺-壳聚糖复合水凝胶修饰的铜网（PDA-CS-铜网）。
用该多巴胺-壳聚糖复合水凝胶修饰的铜网（PDA-CS-铜网）作为电极，用实施例2的结构做成细菌传感芯片，用于含菌气溶胶中金黄色葡萄球菌的捕获和检测，测得的Bode曲线如图5所示，该细菌传感芯片也更好地实现了环境空间中金葡菌的富集及原位电阻抗检测。

Claims (6)

1.一种快速富集及原位检测的细菌传感芯片，该芯片包含至少两个单元结构，所述单元结构包含带进气/液口的上层壳体、带出气/液口的下层壳体以及夹装在两者之间的电极；其特征在于：
所述电极包括微孔网状电极和平板对电极，所述微孔网状电极是通过凝胶修饰和改性的，其设置在上层壳体的进气/液口下方，所述平板对电极设置在微孔网状电极下方的下层壳体的凹槽中，与微孔网状电极之间留有空间；所述下层壳体的出气/液口开设在凹槽侧壁；
从所述上层壳体的进气/液口，经过微孔网状电极的微孔，到下层壳体的凹槽，再到下层壳体的出气/液口，连通构成芯片的流体通道；
使用时，从出气/液口连通真空泵，施加负压，使空气/水样从进气/液口进入细菌传感芯片，通过微孔网状电极实现空气中致病菌的过滤富集；采样完成后将细菌传感芯片的微孔网状电极与工作电极相连，平板对电极与参比电极相连，从进气/液口注入电解液，测得电阻抗谱，实现环境空间中致病菌的原位电阻抗检测；
所有单元结构可通过共用一个出气/液口，构成集成式的阵列细菌传感芯片；
所述上层壳体和下层壳体之间通过密封垫圈密封，所述密封垫圈嵌装在上层壳体和下层壳体相对的环槽中，所述微孔网状电极的边缘通过密封垫圈支撑。
2.根据权利要求1所述的快速富集及原位检测的细菌传感芯片，其特征在于，所述微孔网状电极采用壳聚糖水凝胶、复合壳聚糖-碳纳米管水凝胶或复合壳聚糖-金纳米颗粒水凝胶材料进行表面修饰。
3.根据权利要求1所述的快速富集及原位检测的细菌传感芯片，其特征在于，所述微孔网状电极选择金、铂、铜或铝材料，具有10 μm ~ 75 μm孔径的微孔，所述微孔可为三角形、菱形或圆形。
4.根据权利要求1所述的快速富集及原位检测的细菌传感芯片，其特征在于，所述壳体材料选择PMMA、特氟龙或不锈钢。
5.根据权利要求3所述的快速富集及原位检测的细菌传感芯片，其特征在于，所述上层壳体的进气/液口的半径为2 ~ 20mm；所述下层壳体的凹槽的半径为2 ~ 20 mm，深为1 ~10mm，用于平板对电极的固定。
6.根据权利要求1所述的快速富集及原位检测的细菌传感芯片，其特征在于，所述密封垫圈为带有大孔径的尼龙/锦纶/不锈钢网，孔径为300 ~ 1000μm。
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