CN110997012A - 用于余辉分子成像的聚合物纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本文公开了式I的半导体聚合物和包含所述聚合物的聚合物复合材料，其中，所述聚合物表现出近红外余辉发光。式I的聚合物具有以下结构：其中，n、m、o、p、A和R1至R7如本文所定义，并且r用于表示重复单元的随机顺序。
Figure DDA0002358183890000011

Description

用于余辉分子成像的聚合物纳米颗粒
技术领域
本发明涉及特别适用于余辉分子成像技术的聚合物和聚合物纳米颗粒。
背景技术
在本说明书中对先前公开的文件的列出或讨论不应该一定被认为是承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
光学成像在生物学和医学中起着至关重要的作用[例如，参见Ntziachristos,V.,et al.,Nat Biotechnol23,313-320(2005)]。然而，在成像期间对实时光激发的需求会产生组织自发荧光(autofluorescence)，这会损害活体受试者中的成像灵敏度和特异性[例如，参见Smith,A.M.,et al.,Nat Nanotechnol4,710-711(2009)]。诸如生物发光(bioluminescence)和切伦科夫发光(Cerenkov luminescence)的光学成像策略消除了对同时光激发的需要，在分子成像中引起了极大兴趣[例如，参见Chu,J.,et al.,NatBiotechnol34,760-767(2016)；Thorek,D.L.,et al.,Nat Med19,1345-1350(2013)]。然而，生物发光探针需要酶/底物才能产生光发射，并因此它们的信号通常受到活体动物体内酶微环境和底物生物分布的影响[例如，参见So,M.K.,et al.,J.Nat Biotechnol24,339-343(2006)]。相比之下，切伦科夫探针依赖于从放射性同位素中释放带电粒子，这涉及复杂的合成程序，并且表现为短的发光寿命[例如，参见Liu,H.,et al.,J.Nucl.Med.53,1579-1584(2012)]。
余辉发光(afterglow luminescence)是在光激发结束之后发生的内在发光过程[例如，参见de Chermont,Q.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104,9266-9271(2007)]。余辉发光通常是由所研究的材料经过热模拟后，光子从能量陷阱中缓慢释放而引起的。尽管余辉成像由于无需实时激发而在体内成像中具有广阔的前景，但在生物学相关条件下仅有少数无机纳米颗粒被证明能产生余辉发光[例如，参见Maldiney,T.,et al.,J Am ChemSoc133,11810-11815(2011)；Maldiney,T.,et al.,Nat Mater13,418-426(2014)；Li,Z.J.,et al.,J Am Chem Soc137,5304-5307(2015)]。这些文章涉及含有稀土重金属离子(诸如，铕、镨和铬)的材料[例如，参见Maldiney,T.,et al.,Opt Mater Express2,261-268(2012)；Abdukayum,A.,et al.,J Am Chem Soc135,14125-14133(2013)；Liu,F.,etal.Sci Rep-Uk3(2013)；Maldiney,T.,et al.,Opt Mater35,1852-1858(2013)；Sharma,S.K.,et al.,Opt Mater36,1901-1906(2014)；Shi,J.P.,et al.,Biomaterials37,260-270(2015)]。因此，由于毒性问题，当前一代的余辉探针受到严重阻碍[例如，参见Toppari,J.et al.,Environ.Health Perspect.104Suppl 4,741-803(1996)]。
由于难以修饰这样的蛋白质的表面，无机余辉纳米颗粒目前用作积聚探针并且具有有限的靶向应用[例如，参见de Chermont,Q.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104,9266-9271(2007)；Maldiney,T.,et al.,J Am Chem Soc133,11810-11815(2011)；Maldiney,T.,et al.,Nat Mater13,418-426(2014)]。因此，对比度是由靶组织和相邻正常组织之间的探针浓度的差异确定的。与浓度差异相比，在检测分子靶标时经历信号强度变化的智能可激活探针可提供分子水平上病理状况的高对比度和实时信息[例如，参见Kobayashi,H.&Choyke,P.L.,Chem.Res.44,83-90(2011)；Lovell,J.F.,et al.,ChemRev110,2839-2857(2010)]。
发明内容
令人惊讶地发现，一组聚合物材料可以以适用于生物应用的方式表现出余辉发光。因此，在本发明的第一方面，提供了发射近红外余辉发光的聚合物复合纳米颗粒，该纳米颗粒包括：
(a)式I的半导体聚合物：
Figure BDA0002358183870000031
(b)任选地，两亲性共聚物；以及
(c)任选地，具有近红外发射的小分子染料，其中：
两亲性共聚物(当存在时)包封式I的半导体聚合物和小分子染料(当存在时)；以及
在式I的聚合物中：
R1至R3和R5独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中，1≤q≤50，
R4代表式Ia或式Ib的部分：
Figure BDA0002358183870000032
其中，1≤s≤50且10≤t≤500；
Figure BDA0002358183870000033
其中，1≤u≤50且10≤v≤500；
R6代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中，q、s、t、u和v如上所定义；
R7代表单线态氧敏化部分；
n、m和o中的每个均大于或等于0，并且p为0或1，其中，n、m、o和p中的至少一个大于0；
A代表式Ic或Id的部分：
Figure BDA0002358183870000041
其中，R8和R11独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中：1≤q≤50；
R9和R12独立地代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中，q、s、t、u和v如上所定义；
R10和R13独立地代表单线态氧敏化部分；
当p为1时，则w、x、y和z(当存在时)独立地大于或等于0；以及
当o和p为0时存在小分子染料，并且当为以下情况时任选地存在小分子染料：
o大于或等于20；
p为1且x或z大于或等于20；
o和x的总和大于或等于20；
o和z的总和大于或等于20；
(o+x)/(n+m+o+w+x)>0.05；或者
(o+z)/(n+m+o+y+z)>0.05；
当m、o和p为0时存在两亲性共聚物，并且当为以下情况时任选地存在两亲性共聚物：
(m+o+w)/(n+m+o+w+x)>0.1；或者
(m+o+y)/(n+m+o+y+z)>0.1；以及
前提为当n大于0时，则m、o和p中的一个或多个也大于0。
在本发明的第一方面的某些实施方式中，p可以为0。在其中p为0的实施方式中，则当为以下情况时两亲性共聚物可以任选地存在：
m大于或等于20，且m/(n+m+o)大于0.1，且R6为CqH2q+1，其中1≤q≤50；
m大于或等于20，且(m+o)/(x+y+z)大于0.1，且R6为式Ia的部分或式Ib的部分；或者
o大于或等于20，且(m+o)/(x+y+z)大于0.1，且R6为式Ia的部分或式Ib的部分。
在本发明的第一方面的某些实施方式中：
(a)n为0；
(b)存在两亲性共聚物；
(c)当存在时，n、m、o、w、x、y和z中的每个可以独立地具有5至1000的值；
(d)式I的聚合物的数均分子量可以为1,000至300,000道尔顿，诸如1,000至100,000道尔顿；
(e)当存在时，单线态氧敏化部分R7、R10和R13可以独立地选自由以下组成的组中的一种或多种：金属卟啉、金属酞菁、萘酞菁、金属萘酞菁、二氢卟吩、若丹明、花青、类胡萝卜素、花青素、孟加拉玫瑰红(rose bengal)、亚甲基蓝，以及更特别地，2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)和基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂；
(f)两亲性共聚物与式I聚合物的重量与重量比可以为1:1至200:1，诸如1.5:1至100:1，诸如2:1至80:1；
(g)当存在时，具有近红外辐射的小分子染料可以是单线态氧敏化化合物，选自由以下组成的组中的一种或多种：金属卟啉、金属酞菁、萘酞菁、金属-萘酞菁、二氢卟吩、若丹明、花青、类胡萝卜素、花青素、孟加拉玫瑰红、亚甲基蓝，以及更特别地，2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)和基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂；
(h)当存在时，两亲性共聚物可以选自由以下组成的组中的一种或多种：烷基取代的壳聚糖，以及更特别地，聚(烷基)-b-聚(乙二醇)、聚(乙二醇)-b-聚(丙二醇)-b-聚(乙二醇)、聚(乙二醇)甲醚-嵌段-聚(丙交酯-co-乙交酯)(PEG-PLGA)、聚(苯乙烯)-嵌段-聚(丙烯酸)(PS-PAA)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(PSMA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)，任选地，其中两亲性共聚物可以具有1,000至50,000道尔顿的数均分子量；和/或当存在时，两亲性共聚物可以选自聚(乙二醇)-b-聚(丙二醇)-b-聚(乙二醇)(例如，(PEG)100-b-(PPG)65-b-(PEG)100)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)、
Figure BDA0002358183870000071
Figure BDA0002358183870000072
以及更特别地
Figure BDA0002358183870000073
中的一种或多种。
在本发明的某些实施方式中，两亲性共聚物(当存在时)还可以包括在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分。合适的淬灭部分可以选自由以下组成的组中的一种或多种：
硫醇敏感部分，诸如2,4-二硝基苯磺酰基(DNBS)部分和
Figure BDA0002358183870000074
活性氧物类敏感部分
Figure BDA0002358183870000075
pH敏感部分，诸如
Figure BDA0002358183870000076
Figure BDA0002358183870000077
肽淬灭剂部分，诸如弗林蛋白酶(furin)敏感的Arg-Arg-Val-Arg-淬灭剂、Caspase-3敏感的Asp-Val-Glu-Asp-淬灭剂、成纤维细胞激活蛋白-α(FAPα)敏感的Gly-Pro-淬灭剂、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)敏感的Gly-Arg-Val-Gly-Leu-Pro-淬灭剂、MMP-7敏感的Gly-Met-Trp-Ser-Leu-Pro-Val-淬灭剂、MMP-13敏感的Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Leu-Pro-淬灭剂、组织蛋白酶B敏感的Lys-lys-淬灭剂、组织蛋白酶D敏感的Leu-Arg-Phe-Phe-Cys-Ile-Pro-淬灭剂、组织蛋白酶S敏感的Arg-Leu-淬灭剂、尿激酶敏感的Arg-Gly-淬灭剂和Legumain敏感的Asn-Ala-Ala-淬灭剂，
其中，淬灭剂是暗淬灭剂。合适的暗淬灭剂可以选自黑洞淬灭剂(BHQ)-1、BHQ-2、BHQ-3和QSY-7。
在本发明的某些实施方式中，包含淬灭部分的两亲性共聚物可以是：
Figure BDA0002358183870000081
Figure BDA0002358183870000082
以及更特别地
Figure BDA0002358183870000083
(C18PEG12-DNBS)。
在本发明的某些实施方式中，式I的聚合物可以选自以下列出的聚合物：
(i)
Figure BDA0002358183870000091
其中，n和m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中n和m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为25,000至200,000道尔顿，诸如45,000至150,000道尔顿，诸如50,000至100,000道尔顿，诸如约59,781道尔顿，和/或聚合物中n个重复单元的摩尔比为约88％，且聚合物中m个重复单元的摩尔比为约11％(例如，聚合物中n个重复单元的摩尔比为88.0至89.0％，且聚合物中m个重复单元的摩尔比为11.0至12.0％)；
(ii)
Figure BDA0002358183870000092
其中，m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为15,000至100,000道尔顿，诸如20,000至75,000道尔顿，诸如20,000至50,000道尔顿，诸如约26,565道尔顿；
(iii)
Figure BDA0002358183870000101
其中，p为1，并且y和z个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为5,000至20,000道尔顿，诸如7,000至18,000道尔顿，诸如8,900至15,000道尔顿，诸如约13,000道尔顿，和/或聚合物中y个重复单元的摩尔比为85至99％，且聚合物中z个重复单元的摩尔比为1至15％(例如，聚合物中y个重复单元的摩尔比为90.0至95.0％，且聚合物中z个重复单元的摩尔比为5.0至10.0％)。
在本发明的第二方面，提供了式I的半导体聚合物：
在式I的聚合物中：
R1至R3和R5独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中1≤q≤50，
R4代表式Ia或式Ib的部分：
Figure BDA0002358183870000112
其中，1≤s≤50且10≤t≤500；
Figure BDA0002358183870000113
其中，1≤u≤50且10≤v≤500；
R6代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中，q、s、t、u和v如上所定义；
R7代表单线态氧敏化部分；
n、m和o中的每个大于或等于0；
p为0或1；
A代表式Ic或Id的部分：
Figure BDA0002358183870000121
其中，R8和R11独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中：1≤q≤50；
R9和R12独立地代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中，q、s、t、u和v如上所定义；
R10和R11独立地代表单线态氧敏化部分；
当p为1时，则w、x、y和z(当存在时)独立地大于或等于0；
前提为：
当n大于0时，m、o和p中的一个或多个也大于0；以及
n、m、o和p中的至少一个大于0。
本发明的第二方面的实施方式包括其中为以下情况的那些：
(i)n可以为0；
(ii)p可以为0；
(iii)式I的聚合物的数均分子量可以为1,000至100,000道尔顿，诸如1,000至100,000道尔顿；
(iv)当存在时，n、m、o、w、x、y和z中的每个可以独立地具有5至1000的值；
(v)当存在时，单线态氧敏化部分R7、R10和R13可以独立地选自由以下组成的组中的一种或多种：金属卟啉、金属酞菁、萘酞菁、金属-萘酞菁、二氢卟吩、若丹明、花青、类胡萝卜素、花青素、孟加拉玫瑰红、亚甲基蓝，以及更特别地，2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)以及基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂。
在本发明的第二方面的实施方式中，式I的聚合物可以选自以下列出的聚合物：
(i)
Figure BDA0002358183870000131
其中，n和m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中n和m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为25,000道尔顿至200,000道尔顿，诸如45,000道尔顿至150,000道尔顿，诸如50,000道尔顿至100,000道尔顿，诸如约59,781道尔顿，和/或聚合物中n个重复单元的摩尔比为约88％，且聚合物中m个重复单元的摩尔比为约12％(例如，聚合物中n个重复单元的摩尔比为88.0至89.0％，且聚合物中m个重复单元的摩尔比为11.0至12.0％)；
(ii)
Figure BDA0002358183870000141
其中，m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为15,000道尔顿至100,000道尔顿，诸如20,000道尔顿至75,000道尔顿，诸如20,000道尔顿至50,000道尔顿，诸如约26,565道尔顿；以及
(iii)
Figure BDA0002358183870000151
其中，p为1，并且y和z个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为5,000至20,000道尔顿，诸如7,000道尔顿至18,000道尔顿，诸如8,900道尔顿至15,000道尔顿，诸如约13,000道尔顿，和/或聚合物中y个重复单元的摩尔比为85至99％，且聚合物中z个重复单元的摩尔比为1至15％(例如，聚合物中y个重复单元的摩尔比为90.0至95.0％，且聚合物中z个重复单元的摩尔比为5.0至10.0％)。
在本发明的第三方面，提供了如在本发明的第一方面中所定义的聚合物复合纳米颗粒及其实施方式的任何技术上合理的组合在制备成像剂中的用途，该成像剂用于使用余辉发光来诊断深部组织和/或器官中的病症或疾病。成像可以是体外的，或更特别地是体内的。
在本发明的第四方面，提供了使用在本发明的第一方面中定义的聚合物复合纳米颗粒及其实施方式的任何技术上合理的组合在深部组织和/或器官中进行体内成像的方法，该方法包括在将聚合物复合纳米颗粒提供给活生物体(例如，将聚合物复合纳米颗粒皮下、皮内或静脉内注射到活生物体中)之前或之后，用NIR激光照射聚合物复合纳米颗粒，并使用成像系统/装置检测余辉发光。在本发明的各种实施方式中，可以通过使被皮下、皮内或静脉内注射了聚合物复合纳米颗粒的活生物体或活生物体的一部分经受NIR激光照射，从而在体内重新激活所注射的聚合物纳米颗粒的余辉发光。
在本发明的第五方面，提供了如在本发明的第一方面中定义的聚合物复合纳米颗粒及其实施方式的任何技术上合理的组合，用作成像剂用于使用余辉发光来诊断深部组织和/或器官中的病症或疾病。成像可以是体外的，或更特别地是体内的。
在第三至第五方面的实施方式中：
(ai)体内成像可以在活生物体(优选动物或人)上进行；
(aii)体内成像可以用于定位淋巴结和/或可视化肿瘤(例如乳腺、肺或肝肿瘤)的目的；
(aiii)成像剂可以用于体内成像以用于图像引导的手术。例如，聚合物复合纳米颗粒可以是在其中两亲性共聚物还包括淬灭部分的一种，该淬灭部分在如上文所定义的体外或体内测试部位可被反应性部分切断。
在本发明的第六方面，提供了如上文本发明的第一方面所定义的聚合物复合纳米颗粒在制备用于对受试者肝脏中的氧化应激进行体内成像的方法中的成像剂的用途，在该聚合物复合纳米颗粒中两亲性共聚物还包括如上定义的在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分(例如，两亲性共聚物可以是C18-PEG12-DNBS)，该方法包括以下步骤：将聚合物复合纳米颗粒供应到活生物体中，然后用NIR激光照射聚合物复合纳米颗粒，并然后使用成像系统/装置检测肝脏中的余辉发光。
在本发明的第七方面，提供了使用如上文本发明的第一方面所定义的聚合物复合纳米颗粒对受试者肝脏中的氧化应激进行体内成像的方法，在该聚合物复合纳米颗粒中两亲性共聚物还包括如上定义的在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分(例如，两亲性共聚物可以是C18-PEG12-DNBS)，该方法包括以下步骤：将聚合物复合纳米颗粒静脉内注射到活生物体中，然后用NIR激光照射聚合物复合纳米颗粒，并然后使用成像系统/装置检测肝脏中的余辉发光。在本发明的各种实施方式中，可以通过使被皮下、皮内或静脉内注射了聚合物复合纳米颗粒的活生物体或活生物体的一部分经受NIR激光照射，从而在体内重新激活所注射的聚合物纳米颗粒的余辉发光。
在本发明的第八方面，提供了如上述在本发明的第一方面中所定义的聚合物复合纳米颗粒用作成像剂用于使用余辉发光来确定受试者肝脏中的氧化应激，在该聚合物复合纳米颗粒中两亲性共聚物还包括如上定义的在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分(例如，两亲性共聚物可以是C18-PEG12-DNBS)。在小鼠中进行的这样的测试的实例在实施例部分提供。
在第六至第八方面的实施方式中，肝脏中的氧化应激可以用于确定药物诱导的肝毒性。
附图说明
图1a至1h示出了SPN的合成和表征。(图1a)用于合成SPN的SP(MEHPP、POPPV、PFBT、MEHCPV、BOPPV、MDMOPPV和MEHPPV)和两亲性三嵌段共聚物(PEG-b-PPG-b-PEG)的化学结构。(图1b)通过纳米沉淀法制备SPN的示意图。(图1c)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPN的平均流体动力学直径。(图1d)SPN-MEHPPV的代表性TEM图像。(图1e)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPN-MEHPP、SPN-POPPV、SPN-PFBT、SPN-MEHCPV、SPN-BOPPV、SPN-MDMOPPV和SPN-MEHPPV的白光(上部图组)、余辉发光(中部图组)和荧光(下部图组)图像。SPN的荧光图像和余辉图像以相同的吸收强度在其各自最大值处拍摄(溶液稀释10倍后吸光度为0.5)。除SPN-MEHPP和SPN-POPPV(430nm)外，所有SPN均在465nm处激发后采集荧光图像。将SPN在功率密度为0.1W/cm2的白光下预照射1min后，采集余辉图像30s。(图1f)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPN的归一化荧光光谱。(图1g)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPN-BOPPV、SPN-MDMOPPV和SPN-MEHPPV的归一化余辉发光光谱。(图1h)图1e中SPN的荧光强度和余辉强度的定量。
图2a至2f示出了SPN的余辉的机理研究。(图2a)MEHPPV(10μg/mL)在CHCl3中照射4h(功率：0.1W/cm2)前后的UV-Vis吸收光谱。(图2b)MEHPPV在CHCl3中光照射24h(功率：0.1W/cm2)前后的FTIR光谱。(图2c)在528nm处不存在或存在SPN-MEHPPV(1.25μg/mL)的情况下，SOSG(1μM)的荧光增强(F/F0)随光照射时间的变化。(图2d)室温下SPN-MEHPPV(62.5μg/mL)的余辉发光的衰减。在收集余辉信号之前，将纳米颗粒溶液在功率密度为0.1W/cm2的白光下预照射1min。(图2e)在通过N2、O2吹扫或存在50w/w％NaN3下进行处理后，在不同温度(室温和60℃)下采集的SPN-MEHPPV(62.5μg/mL)的余辉图像和强度。(图2f)基于PPV的SP的余辉发光的拟定机理。
图3a至3f示出了1O2敏化剂放大的NIR余辉。(图3a)用于1O2敏化剂放大的NIR余辉的拟定机理的示意图。(图3b)与514nm激光相比，为了余辉增强用808nm激光预照射的SPN-NCBS的示意图。(图3c)在514(左)或808nm(右)预照射的12.5μg/mL SPN-NCBS(基于MEHPPV的质量)的余辉发光图像。在生物发光模型下采集余辉图像，采集时间为30s。将纳米颗粒溶液通过808或514nm激光(1W/cm2)预照射1min，并然后在去除激光源后收集图像5s。在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPN-MEHPPV和SPN-NCBS5的荧光(图3d)和NIR诱导的余辉发光光谱(图3e)。(图3f)在不同的NCBS掺杂量下SPN-MEHPPV的绝对荧光和余辉发光强度的定量。误差棒代表标准差(n＝3)。
图4a至4e示出了NIR余辉发光的组织穿透研究。(图4a)穿过不同厚度的鸡组织的SPN-NCBS5溶液的余辉发光成像(上图组)和荧光成像(下图组)。(图4b)SPN-NCBS5的余辉发光和荧光的SBR随组织深度的变化。*在4cm处穿过鸡组织的SBR具有统计学显著差异(n＝3，P<0.01)。(图4c)穿过活体小鼠的余辉发光成像的示意图，其中SPN-NCBS5溶液位于小鼠下方，深度为1.7cm。(图4d)穿过活体小鼠的SPN-NCBS5溶液的余辉发光图像和荧光图像。用808或514nm激光(1W/cm2)预照射SPN-NCBS5溶液(62.5μg/mL，50μL)1min，并然后在去除激光后在5s内收集图像。在710nm处激发后，在780nm处采集荧光图像。(图4e)图4d中余辉发光和荧光成像的SBR。
图5a至5f示出了淋巴结和肿瘤的体内余辉成像。(图5a)淋巴结的余辉发光成像的示意图。将SPN-NCBS5用808nm激光(1W/cm2)预照射1min，然后在-20℃下储存一天，然后直接用于淋巴结成像。(图5b)在将SPN-NCBS5(0.25mg/mL，0.05mL)皮内注射到小鼠前爪中之后，在t＝65min时活体小鼠中淋巴结的荧光成像(左)和余辉发光成像(右)。(图5c)活体小鼠中淋巴结的余辉发光和荧光成像的SBR随注射后时间的变化。通过在808nm(1W/cm2)照射1min，在注射后t＝65min时进行SPN-NCBS5的原位再生余辉。*活体小鼠中在SPN-NCBS5注射后t＝130min时，荧光和余辉发光之间的SBR具有统计学显著差异(n＝3，P<0.01)。(图5d)小鼠模型中异种移植HeLa肿瘤的余辉发光成像的示意图。(图5e)通过尾静脉注射系统性给药SPN-NCBS5(0.25mg/mL，0.2mL)之后，在代表性时间点活体小鼠中肿瘤的余辉发光图像(上图组)和荧光图像(下图组)。如白色虚线圆圈和箭头所示，肿瘤在右肩上。(图5f)活体小鼠中肿瘤的余辉发光和NIR荧光成像的SBR随时间的变化。强度值为n＝3只小鼠的平均值±s.d.。误差棒基于标准差(小鼠n＝3)。在808nm(0.5W/cm2)照射1min之后，采集余辉发光图像180s。在710nm处激发后，在780nm处采集荧光图像0.1s。
图6a至6h示出了药物诱导的肝毒性的体内余辉发光成像。(图6a)生物硫醇可激活的余辉探针(SPN-硫醇)的设计和开启机理的示意图。(图6b)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中不存在或存在Cys(1mM)的情况下，SPN-硫醇(12.5μg/mL)的余辉发光光谱。(图6c)在37℃下，在1×PBS(pH＝7.4)中存在Cys、Hcy、GSH和其他氨基酸(1mM)的情况下，SPN-硫醇(12.5μg/mL)的余辉发光图像。(图6d)在37℃下，在1×PBS(pH＝7.4)中存在Cys、Hcy、GSH和其他氨基酸(1mM)的情况下，SPN-硫醇的余辉发光强度。1：空白，2:Arg，3:Asn，4:Gln，5:Gly，6:His，7:Leu，8:Lys，9:Met，10:Pro，11:Ser，12:Val，13:GSH，14:Hcy，15:Cys。(图6e)SPN-硫醇的余辉发光强度随Cys浓度变化的拟合校正曲线。(图6f)APAP诱导的毒性机理的示意图，其中，GSH耗尽的影响导致余辉失活，而NAC修复该耗尽来激活余辉。(图6g)用APAP(300mg/kg)、盐水或NAC(200mg/kg)与APAP(300mg/kg)进行腹膜内处理，然后在t＝20min后静脉注射SPN-硫醇(0.25mg/mL，0.2mL)的小鼠的代表性余辉发光图像。通过在808nm(1W/cm2)照射1min进行原位再生后，采集余辉发光图像180s。(图6h)活体小鼠中肝脏的余辉发光和NIR荧光成像的SBR随时间的变化。强度值为n＝3只小鼠的平均值±s.d.。*在SPN-硫醇注射后t＝2h，盐水和APAP处理的组之间的余辉发光强度具有统计学显著差异(n＝3，P<0.01)；**在SPN-硫醇注射后t＝2h，盐水和APAP/NAC处理的组之间无统计学显著差异(n＝3，P＞0.05)。
图7示出了SPN-MEHPPV(10μg/mL)在1×PBS(pH＝7.4)中在黑暗中储存60天的时间后的稳定性。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图8示出了SPN-MEHPP、SPN-POPPV、SPN-PFBT、SPN-MEHCPV、SPN-BOPPV、SPN-MDMOPPV和SPN-MEHPPV在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中的UV-Vis吸收光谱。
图9a至9c示出了(图9a)在相同的光密度下，THF溶液中各种SP在其各自最大吸收波长下的荧光图像(上)和余辉发光图像(下)(溶液稀释10倍后吸光度为0.5)。采集所有SP的荧光图像0.1s，除了MEHCPV和POPPV在430nm处激发并在520±10nm处采集之外，其余均在465±10nm处激发并在580±10nm处发射。对于余辉发光图像，所有SP均通过功率为0.1W/cm2的白光照射1min，并用开放式过滤器采集信号30s。(图9b)THF溶液中SP的归一化荧光光谱，包括BOPPV、MDMOPPV和MEHPPV的SP在455nm处激发；PFBT、MEHCPV、POPPV和MEHPP分别在440、420、360和320nm处激发。(图9c)THF中SP的荧光强度和余辉发光强度的定量分析。误差棒代表三个独立测量的标准差。与MEHPPV相比，在亚乙烯基骨架上带有吸电子氰基的MEHCPV具有低5.1倍的余辉发光。这是因为吸电子取代基可以减慢1O2氧化，并从而降低余辉发光。类似地，POPPV的取代基具有比BOPPV、MDMOPPV和MEHPPV更弱的供电子基团[例如，参见Abdukayum,A.,et al.,J Am Chem Soc135,14125-14133(2013)]；它们显示出更弱的余辉发光强度。
图10a至10f示出了MDMOPPV(图10a)和BOPPV(10μg/mL)(图10d)在CHCl3中光照射(功率：0.1W/cm2)4小时前后的UV-Vis吸收光谱；MDMOPPV(图10b)和BOPPV(图10e)在CDCl3中光照射(功率：0.1W/cm2)过夜前后的部分1H NMR光谱，以及MDMOPPV(图10c)和BOPPV(图10f)在CHCl3中光照射(功率：0.1W/cm2)过夜前后的傅立叶变换红外(FT-IR)光谱。
图11a至11d示出了MEHPP(图11a)、POPPV(图11b)、PFBT(图11c)和MEHCPV(图11d)(10μg/mL)在CHCl3中光照射(功率：0.1W/cm2)4小时前后的UV-Vis吸收光谱。
图12示出了通过IVIS光谱成像系统用开放式过滤器采集30s的SPN-BOPPV(上，180μg/mL)、SPN-MDMOPPV(中，83.3μg/mL)、SPN-MEHPPV(下，62.5μg/mL)响应于温度的余辉发光图像。
图13a和13b示出了(图13a)PBS缓冲液(pH＝7.4)中，在各种NCBS掺杂量下的SPN-MEHPPV和仅NCBS的UV-Vis吸收，以及(图13b)1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPN-NCBS5的荧光光谱。激发：710nm。
图14a和14b示出了(图14a)SPN-NCBS5的代表性TEM图像，以及(图14b)1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPN-NCBS的DLS。
图15a至15c(图15a)浓度为12.5μg/mL(基于MEHPPV的质量)的在各种NCBS掺杂量(即0％、1％、2.5％、5％和10％)下的SPN-MEHPPV的荧光图像，其在465±10nm处激发并且在580±10nm或780±10nm处发射，采集0.1s；(图15b)1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中，在各种NCBS掺杂量(即0％、1％、2.5％、5％和10％)下的SPN-MEHPPV的归一化荧光光谱。激发：465nm，以及(图15c)浓度为0.625μg/mL(基于NCBS的质量)的NCBS纳米颗粒(沉淀有PEG-b-PPG-b-PEG的NCBS)的余辉发光图像(左)和荧光图像(右)。在465±10nm处激发后，在580±10或780±10nm处采集荧光图像。在生物发光模型下采集余辉图像，采集时间为30s。将纳米颗粒溶液用808nm激光(1W/cm2)预照射1min，并然后在去除激光后收集图像5s。
图16a和16b示出了(图16a)在不同功率密度下通过808nm激光照射后SPN-NCBS5(12.5μg/mL)的余辉发光，以及(图16b)通过功率密度为1W/cm2的808nm激光在不同光照射时间下SPN-NCBS5(12.5μg/mL)的余辉发光。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图17a和17b示出了(图17a)通过808nm或514nm(1W/cm2)激光照射后SPN-NCBS5的余辉发光强度随浓度变化的拟合校正曲线，以及(图17b)在528nm处不存在或存在SPN-NCBS5(1.25μg/mL)的情况下，SOSG(1μM)的荧光增强(F/F0)随通过808nm或514nm激光照射时间的变化。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图18a至18f示出了(图18a)meso-四苯基卟啉(TPP)的化学结构；(图18b)在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，各种TPP掺杂量下的SPN-MEHPPV的UV-Vis吸收；(图18c)在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，各种TPP掺杂量下的SPN-MEHPPV的荧光图像(左)和余辉发光图像(右)。荧光图像采集了0.1s，在465±10nm处激发并且在580±10nm和660±10nm处发射。生物发光图像在580±10nm和660±10nm处采集了30s；在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，各种TPP掺杂量下的SPN-MEHPPV的荧光光谱(图18d)和余辉发光光谱(图18e)。余辉发光光谱在每个过滤器上从540±10nm到840±10nm采集了30s，并通过感兴趣区域(ROI)分析进行分析；(图18f)各种TPP掺杂量下SPN-MEHPPV的荧光强度和余辉发光强度的定量。误差棒代表三个独立测量的标准差。总荧光是通过用Origin 9.0对荧光光谱的面积进行积分获得的。总余辉发光是用开放式过滤器和感兴趣区域(ROI)分析获得的。对于荧光光谱，基于MEHPPV组分，[SPN]＝2.5μg/mL，并且激发波长为465nm。对于余辉发光光谱，荧光和余辉发光图像，基于MEHPPV组分，[SPN]＝62.5μg/mL。在采集余辉发光之前，所有SPN均通过白光照射1min(功率：0.1W/cm2)。
图19a至19h示出了在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，各种NCBS掺杂量下的SPN-MDMOPPV的(图19a)UV-Vis吸收光谱、(图19b)荧光光谱和(图19c)余辉发光光谱；(图19d)各种NCBS掺杂量下的SPN-MDMOPPV的荧光强度和余辉发光强度的定量；在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，各种TPP掺杂量下的SPN-MDMOPPV的(图19e)UV-Vis吸收光谱、(图19f)荧光光谱和(图19g)余辉发光光谱，以及(图19h)具有各种TPP掺杂量的SPN-MDMOPPV的荧光强度和余辉发光强度的定量。误差棒代表三个独立测量的标准差。总荧光是通过用Origin 9.0对荧光光谱的面积进行积分获得的。余辉发光光谱在每个过滤器上从540±10nm到840±10nm采集了30s，并然后通过感兴趣区域(ROI)分析进行定量。总余辉发光是用开放式过滤器持续30s和ROI分析获得的。对于荧光光谱，基于MDMOPPV组分，[SPN]＝3.3μg/mL，激发波长为465nm。对于余辉发光光谱，基于MDMOPPV组分，[SPN]＝83.3μg/mL。在采集余辉发光之前，所有SPN均用白光照射1min(功率：0.1W/cm2)。
图20示出了SPN-MEHPPV和SPN-NCBS5的细胞毒性研究。用浓度为5、10、20和30μg/mL的SPN-MEHPPV和SPN-NCBS5溶液处理24h的HeLa细胞的体外存活率。相对于用相同体积的盐水处理的细胞(将存活率任意定义为100％)，计算SPN处理后的活细胞的百分比。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图21a和21b示出了(图21a)通过808nm(上)或514nm(下)进行原位预照射的SPN-NCBS5溶液穿过不同厚度的鸡组织的余辉发光成像，和(图21b)余辉发光的SBR随鸡组织深度的变化。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图22a至22e示出了(图22a)在通过808nm(1W/cm2)(左)或514nm(中)进行原位预照射之后SPN-NCBS5穿过活体小鼠的余辉发光图像，以及(图22b)在465nm处激发的荧光图像(右)；(图22c)图22a&b中余辉发光和荧光的SBR。(图22d)在通过808nm(1W/cm2)预照射之后SPN-NCBS5穿过活体小鼠的体内余辉发光强度随纳米颗粒浓度(LOD：40ng/mL)变化的拟合校正曲线，以及(图22e)穿过活体小鼠的SPN-NCBS5的体内荧光强度随纳米颗粒浓度变化的拟合校正曲线(激发：710nm，LOD：8550ng/mL)。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图23a至23d示出了(图23a)由具有SPN-NCBS5(12.5μg/mL，50μL)皮下包含物的小鼠的体内余辉发光图像计算SBR；(图23b)SPN-NCBS5(12.5μg/mL，50μL)皮下包含物的余辉发光和荧光的SBR。SBR＝[(余辉信号，ROI 1)-(背景2，ROI 3)]/[(背景1，ROI 2)-(背景2，ROI3)]；纳米颗粒皮下包含物的体内余辉发光强度(图23c)和荧光强度(图23d)随SPN-NCBS5浓度的变化。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图24示出了在通过808nm(功率：1W/cm2)照射1min之后，在0℃或-20℃下存储时SPN-NCBS(62.5μg/mL)的余辉发光强度随时间的变化。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图25示出了在将SPN-NCBS5(0.25mg/mL，0.05mL)皮内注射至小鼠前爪中之后，在t＝30min时，活体小鼠中淋巴结的荧光图像(左)和余辉发光图像(右)。在465±10nm处激发后，在780±10nm处采集荧光图像0.1s。在没有光重新照射的情况下用开放式过滤器采集余辉发光图像180s。
图26a和26b示出了(图26a)在通过808nm(功率：1W/cm2)光照射1min之后记录的SPN-NCBS5的体内余辉衰减，以及(图26b)皮下包含物SPN-NCBS5的余辉发光强度随光激活的循环数的变化。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图27示出了通过尾静脉注射系统性给药SPN-NCBS5(0.25mg/mL，0.2mL)之后48h，小鼠主要器官的离体余辉发光定量。值是n＝3只小鼠的平均值±s.d.。
图28a和28b示出了(图28a)SPN-硫醇的TEM图像，以及(图28b)SPN-硫醇在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中的DLS。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图29a至29d示出了(图29a)在存在不同浓度的Cys(pH＝7.4)的情况下，在1×PBS缓冲液中SPN-硫醇的荧光光谱；(图29b)在780nm处SPN-硫醇的荧光强度随Cys浓度的变化；(图29c)在37℃下在存在Cys、Hcy、GSH和其他氨基酸(1mM)的情况下，在1×PBS中在780nm处SPN-硫醇的荧光强度，以及(图29d)在37℃下在存在Cys、Hcy、GSH和其他氨基酸(1mM)的情况下SPN-硫醇(12.5μg/mL)的荧光图像。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图30a和30b示出了(图30a)经腹腔注射APAP(300mg/kg)、盐水或NAC(200mg/kg)与APAP(300mg/kg)处理，然后在t＝20min后静脉注射SPN-硫醇(0.25mg/mL，0.2mL)的小鼠的代表性荧光图像，以及(图30b)所有组(APAP处理、未经APAP处理、NAC/APAP处理)的荧光强度和余辉发光强度与未经APAP处理组的荧光强度和余辉发光强度的比值。值是n＝3只小鼠的平均值±s.d.。*未经APAP处理组和APAP处理组之间的荧光和余辉发光具有统计学显著差异(n＝3，P<0.05)；**未经APAP处理组和具有NAC修复的APAP组之间无统计学显著差异(n＝3，P>0.05)。
图31示出了系统性给药SPN-硫醇之后3.5h小鼠主要器官的离体余辉发光定量。*未经APAP处理组和APAP处理组之间的余辉发光强度具有统计学显著差异(n＝3，P<0.05)；**未经APAP处理组和具有NAC修复的APAP组之间无统计学显著差异(n＝3，P>0.05)。
图32示出了用APAP(300mg/kg)处理后t＝3.5h时小鼠肝脏的代表性组织学(H&E)。比例尺代表50μm。
图33a至33e示出了(图33a)SPN-MEHPPV被髓过氧化物酶(MPO)降解的示意图；(图33b)在含有NaCl(150mM)的磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.0)中，在处理前(空白，左)和仅用300μM H2O2(H2O2，中)或用300μM H2O2和50μg/mL MPO(H2O2+MPO，右)在37℃下处理4次持续8h之后，SPN-NCBS5(25μg/mL)溶液的UV-Vis吸收光谱；(图33c)在含有NaCl(150mM)的磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.0)中，未经处理(空白，左)或仅用300μM H2O2(H2O2，中)或用300μM H2O2和50μg/mL MPO(H2O2+MPO，右)在37℃下处理8h的SPN-NCBS5(25μg/mL)的白光图像(上图组)、荧光图像(中图组)和余辉发光图像(下图组)。在收集余辉信号之前，将纳米颗粒溶液通过808nm激光(1W/cm2)预照射1min。在生物发光模型下采集余辉图像，采集时间为30s。在465nm处激发后，在780nm处采集荧光图像0.1s；(图33d)c中余辉发光强度的定量。误差棒基于标准差(n＝3)以及；(图33e)纳米颗粒包含物的凝胶渗透色谱(GPC)痕迹。将冷冻干燥的样品溶解于THF溶液中进行GPC测试。波长：500nm。
图34a和34b示出了(图34a)通过尾静脉注射系统性给药SPN-NCBS5(0.25mg/mL，0.2mL)之后，在代表性时间点的活体小鼠肝脏的荧光图像。在710nm处激发后在780nm处采集荧光图像0.1s，以及(图34b)活体小鼠肝脏的NIR荧光随时间变化的定量。强度值为n＝3只小鼠的平均值±s.d.。误差棒基于标准差(小鼠n＝3)。
图35示出了通过尾静脉注射系统性给药SPN-NCBS5(0.25mg/mL，0.2mL)或盐水之后3天小鼠器官的代表性组织学(H&E)。比例尺代表50μm。
图36示出了PPV-PEG1和PPV-PEGL的合成路线。试剂和条件：(i)1,10-二溴癸烷、甲醇钠、乙醇，回流2h。(ii)2-乙基己基溴、甲醇钠、乙醇，回流2h。(iii)多聚甲醛，HBr(在乙酸中33wt％)、乙酸，70℃，4h。(iv)叔丁醇钾、四氢呋喃(THF)，25℃，过夜。(v)叠氮化钠、THF/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，40℃，过夜。(vi)CuBr、N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)、PEG-炔、THF，25℃，48h。
图37a至图37f示出了SPPVN和PPVP之间的几个属性比较。制备(图37a)SPPVN和(图37b)PPVP的示意图；(图37c)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPPVN和PPVP的DLS，插图：SPPVN和PPVP的代表性TEM图像。比例尺代表100nm；在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPPVN和PPVP的(图37d)吸收光谱和(图37e)荧光光谱。(图37f)在相同质量浓度(130μg/mL)下SPPVN和PPVP的余辉发光光谱。在收集余辉发光信号之前，通过514nm光预照射SPPVN和PPVP溶液1min。实验中使用的激光功率为1W/cm2。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图38a至38f示出了体内组织穿透研究和淋巴结成像。(图38a)穿过活体小鼠的SPPVN溶液的荧光图像和余辉发光图像。荧光图像是在710nm处激发在780nm处采集的。在收集余辉发光图像之前，将SPPVN溶液(130μg/mL，50μL)在514或808nm(1W/cm2)下预照射1min。(图38b)图38a中的荧光和余辉发光成像的SBR。(图38c)在将SPPVN(450μg/mL，50μL)皮内注射到小鼠前爪中之后60min时，活体小鼠中淋巴结的荧光图像和余辉发光图像。在808nm(0.3W/cm2)下激光照射1min后采集余辉发光图像30s。(图38d)图38c中淋巴结的荧光和余辉发光成像的SBR。(图38e)在局部注射SPPVN(130μg/mL，50μL)之后，肿瘤和皮肤的荧光图像和余辉发光图像。(图38f)在局部注射SPPVN(130μg/mL，50μL)之后，肿瘤和皮肤的荧光强度和余辉强度。误差棒代表三个独立测量的标准差(n＝3)。n.s.：不显著，**具有统计学显著差异(p<0.01，n＝3)。
图39a至39e示出了体内肿瘤成像。在静脉注射(图39a)SPPVN或(图39b)PPVP(450μg/mL，200μL)之后，在不同时间点活体小鼠的荧光图像和余辉发光图像。(图39c)用SPPVN或PPVP处理后活体小鼠中肿瘤的荧光成像和余辉成像的SBR随注射后时间的变化。(图39d)在SPPVN或PPVP注射后48h时，来自小鼠的主要器官的离体荧光定量。(图39e)在SPPVN或PPVP注射后48h时，小鼠主要器官的离体荧光图像。在808nm(0.3W/cm2)下激光照射1min之后采集余辉发光图像30s。荧光图像是在710nm处激发在780nm处采集的。误差棒代表三个独立测量的标准差(n＝3)。*具有统计学显著差异(p<0.05，n＝3)。
图40a至40e示出了体内腹膜转移性肿瘤成像。(图40a)建立转移性4T1肿瘤模型和成像程序的示意图。(图40b)注射了SPPVN或PPVP的小鼠的下象限区域的余辉发光强度随注射后时间的变化。SPPVN和PPVP的注射剂量为450μg/mL，200μL。*在t＝1.5h时具有统计学显著差异(p<0.01，n＝3)。(图40c)在SPPVN或PPVP注射后1.5h时进行皮肤切除以暴露腹腔之后的小鼠的荧光图像和余辉发光图像。肿瘤区域由白色圆圈标记。(图40d)图(c)中标记的注射了SPPVN和PPVP的小鼠的肿瘤区域和背景的余辉强度。n.s.：不显著，**具有统计学显著差异(p<0.01，n＝3)。(图40e)获得自注射了SPPVN或PPVP的小鼠的腹膜转移性肿瘤的H&E染色切片和切片的共聚焦图像。肿瘤区域通过白色框标记。误差棒代表三个独立测量的标准差(n＝3)。
图41a至41d示出了生物降解性和清除率研究。(图41a)在存在髓过氧化物酶(MPO)和H2O2的情况下，PPV-PEGL的降解的示意图。(图41b)在用MPO(40μg/mL)和H2O2(100μM)处理不同时间后PPV-PEGL溶液(10μg/mL)的吸收光谱。(图41c)用PPV-PEGL(30μg/mL)温育并用LPS刺激不同时间的巨噬细胞的共聚焦荧光图像。用Hoechst 33342对巨噬细胞进行共染色。(图41d)注射有SPPVN(450μg/mL，200μL)的活体小鼠中肝脏的荧光强度随时间变化的定量。荧光信号是在710nm处激发在780nm处采集的。误差棒代表三个独立测量的标准差(n＝3)。
图42a至42f示出了PPV-PEG1的余辉的机理研究。(图42a)PPVPEG1的代表性DLS。插图：PPV-PEG1的代表性TEM图像，比例尺代表50nm。(图42b)PPV-PEG1的荧光和余辉发光的示意图。(图42c)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中PPV-PEG1的归一化的吸收、荧光和余辉发光光谱。(图42d)在528nm处不存在或存在PPV-PEG1(0.6μg/mL)的情况下，SOSG(1μM)的荧光增强(F/F0)随514nm光照射时间的变化。(图42e)通过O2吹扫之后或在NaN3(50w/w％)存在下，在室温下采集的PPV-PEG1(40μg/mL)的余辉发光强度和图像。**具有统计学显著差异(P<0.01，n＝3，相对于对照计算的统计学显著性)。(图42f)PPV-PEG1的余辉发光的拟定机理。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图43a至43f示出了(图43a)PPV-Br1在CDCl3中514nm光照射12h前后的1H NMR光谱。(图43b)PPV-Br1在THF中514nm光照射12h前后的FTIR光谱。PPV-Br1(12μg/mL)在THF中514nm光照射12h前后的吸收光谱(图43c)和荧光光谱(图43d)。PPV-PEG1(12μg/mL)在水中514nm光照射12h前后的吸收光谱(图43e)和荧光光谱(图43f)。
图44a至44c示出了(图44a)在1×PBS(pH＝7.4)中在各种NCBS掺杂量(w/w％)下PPV-PEG1的吸收谱；(图44b)在1×PBS(pH＝7.4)中在各种NCBS掺杂量下PPV-PEG1的荧光光谱，以及(图44c)在1×PBS(pH＝7.4)中在各种NCBS掺杂量下PPV-PEG1的DLS。误差棒代表三个单独测量的标准差。
图45a至45f示出了掺杂光敏剂对纳米颗粒的物理和光学性质的影响。(图45a)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中，具有不同NCBS掺杂量的NCBS掺杂的PPV-PEGL的DLS。在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中，具有不同NCBS掺杂量的NCBS掺杂的PPV-PEGL的吸收光谱(图45b)、荧光光谱(图45c)和余辉发光光谱(图45d)。(图45e)具有不同NCBS掺杂量的NCBS掺杂的PPV-PEGL(70μg/mL)的绝对荧光和余辉发光强度的定量。(图45f)室温下NCBS掺杂的PPV-PEGL(130μg/mL)的余辉发光的衰减。在收集余辉发光信号之前，通过514nm光对SPPVN溶液预照射1min。实验中使用的光功率为1W/cm2。误差棒代表三个独立测量的标准差。
图46a至46d示出了光敏剂放大的NIR余辉。(图46a)通过514或808nm进行预照射的NCBS掺杂的PPV-PEGL(130μg/mL)的余辉发光图像。(图46b)具有不同NCBS掺杂量下，通过808nm预照射的NCBS掺杂的PPV-PEGL的余辉发光强度与通过514nm预照射的NCBS掺杂的PPV-PEGL的余辉发光强度的比值(I808/I514)。(图46c)在528nm处存在SPPVN的情况下，SOSG的荧光增强(F/F0)随通过808或514nm激光照射时间的变化。(图46d)通过514或808nm激光预照射的NCBS掺杂的PPV-PEGL的余辉发光的拟定机理的示意图。实验中使用的激光功率为1W/cm2。
图47a至47c示出了(图47a)在1×PBS(pH＝7.4)中SPPVT和SPPVN的平均直径；具有的TPP掺杂量为0和2％(w/w％)的SPPVT(200μg/mL)的吸收光谱(图47b)、荧光光谱(图47c)和余辉发光光谱(图47d)。误差棒代表三个单独测量的标准差。
图48a和48b示出了(图48a)PPV-PEG1和SPPVN的DLS随与1×PBS(pH＝7.4)一起温育的时间的变化。(图48b)与各种浓度的SPPVN一起温育后Hela细胞的细胞存活率。误差棒代表三个单独测量的标准差。
图49a至49c示出了(图49a)在通过808nm激光光照射1min之后记录的SPPVN(130μg/mL，50μL)的体内余辉衰减；(图49b)皮下注射SPPVN(130μg/mL，50μL)的余辉发光强度随光照射循环次数的变化。实验中使用的激光功率为0.3W/cm2，以及(图49c)由具有SPPVN(130μg/mL，50μL)皮下包含物的小鼠的体内余辉发光图像计算SBR。误差棒代表三个独立测量的标准差(n＝3)。
图50a至50c示出了尺寸为1mm3的肿瘤的体内成像。(图50a)静脉注射SPPVN(450μg/mL，200μL)之后，在不同时间点活体小鼠中肿瘤的荧光图像和余辉发光图像。(图50b)活体小鼠中肿瘤的荧光和余辉发光成像的SBR随注射后时间的变化。(图50c)静脉注射SPPVN之后48h小鼠中主要器官的荧光离体定量。误差棒代表三个独立测量的标准差(n＝3)。在808nm激光(0.3W/cm2)下照射1min之后，采集余辉发光图像30s。荧光图像是在710nm处激发在780nm处采集的。
图51a和51b示出了用SPPVN(450μg/mL，200μL)处理的携带5和1mm3肿瘤的小鼠的肝脏的(图51a)荧光强度和(图51b)余辉强度随注射后时间的变化。
图52示出了在系统性给药SPPVN或PPVP之后48h，具有5或1mm3肿瘤的小鼠的主要器官的离体荧光图像。
图53a和53b示出了(图53a)与SPPVN或PPVP一起温育12h的多细胞肿瘤球体(MCTS)的共聚焦荧光图像。温育前将SPPVN和PPVP的荧光调节为相同。(图53b)SPPVN和PPVP温育的多细胞肿瘤球体的荧光强度的定量。**具有统计学显著差异(p<0.01，n＝3)。
图54示出了从注射了SPPVN或PPVP的腹膜转移性肿瘤荷瘤小鼠切除的肠，用于H&E染色和共聚焦成像。
图55示出了系统性给药SPPVN(450μg/mL，200μL)之后不同时间点处活体小鼠的荧光图像。
图56a至56e示出了SPN-PPV-TPP的合成和表征。(图56a)PPV、PPV-TPP2.5％和PPV-TPP5％的合成路线。试剂和条件：i)三(二亚苄基丙酮)二钯(0)[Pd2(dba)3]、三(对甲苯基)膦(TP)、氯苯，100℃，24h。(图56b)制备SPN-PPV-TPP的示意图。(图56c)在1×PBS缓冲液(pH＝7.4)中SPN2.5的DLS。(图56d)SPN2.5的TEM图像。比例尺代表100nm。(图56e)在与各种浓度的SPN2.5溶液一起温育之后4T1细胞的细胞存活率。
图57a至57f示出了SPN-PPV-TPP的光学特性。(图57a)SPN-PPV-TPP的归一化UV-可见吸收光谱。(图57b)SPN-PPV-TPP的荧光光谱。在1×PBS(pH＝7.4)中，两种SP的PPV组分的浓度均为30μg/mL。(图57c)SPN-PPV-TPP(100μg/mL)的余辉发光光谱。在收集余辉发光信号之前，通过白光将SPN-PPV-TPP溶液预照射1min。误差棒代表三个独立测量的标准差。(图57d)在1×PBS(pH＝7.4)中SPN-PPV-TPP的荧光图像(上)和余辉发光图像(下)。荧光图像是在430nm处激发在720nm处发射后采集的。在白光下以1W/cm2的功率密度对SPN-PPV-TPP进行预照射1min之后，采集余辉图像30s。(图57e)SPN-PPV-TPP的荧光和余辉强度的定量。误差棒代表三个独立测量的标准差。(图57f)在室温下SPN-PPV-TPP(100μg/mL)的归一化余辉发光衰减。在收集余辉发光信号之前，通过白光将SPN-PPV-TPP溶液预照射1min。实验中使用的光功率为1W/cm2。
图58a和58b示出了肿瘤缺氧的体内成像。(图58a)在局部注射SPN2.5(100μg/mL，50μL)之后，肿瘤和皮肤的荧光和余辉发光图像。(图58b)在局部注射SPPVN(130μg/mL，50μL)之后，肿瘤和皮肤的荧光和余辉强度。误差棒代表三个独立测量的标准差(n＝3)。n.s.：不显著，**具有统计学显著差异(p<0.01，n＝3)。
图59a至59e示出了体内腹膜转移性肿瘤成像。(图59a)静脉注射SPN2.5(400μg/mL，200μL)之后，在不同时间点活体小鼠中腹膜转移性肿瘤的荧光和余辉发光图像。肝脏部位通过黑色圆圈标记。肿瘤部位通过白色框标记。(图59b)SPN2.5注射后4h，去除皮肤以暴露腹腔的小鼠的荧光和余辉发光图像。肿瘤区域通过白色圆圈标记。(图59c)图4a中注射了SPN2.5(400μg/mL，200μL)的小鼠的白色框区域的余辉发光强度随注射后时间的变化。误差棒代表三个独立测量的标准差(n＝3)。(图59d)从注射了SPN2.5的小鼠获得的腹膜转移性肿瘤的H&E染色切片。肿瘤区域通过黑色虚线标记。
图60示出了与PBS(pH＝7.4)一起温育的SPN0和SPN5的DLS数据。SPN0的PDI为0.31。SPN5的PDI为0.346。
图61示出了SPN2.5的DLS数据随与PBS(pH＝7.4)和FBS一起温育的时间的变化。
图62示出了在528nm处不存在或存在SPN0、SPN2.5和SPN5(0.8μg/mL)的情况下，SOSG(1μM)的荧光增强(F/F0)随白光照射时间的变化。
图63示出了在通过O2、N2吹扫之后或存在NaN3(50w/w％)的情况下，在室温下采集的SPN2.5(50μg/mL)的余辉发光强度和图像。
具体实施方式
本文公开了半导体聚合物纳米颗粒(SPN)作为活体小鼠中分子成像的余辉发光探针的生产和应用。
本文公开的SPN由光学活性的半导体聚合物(SP)构建，并且是光子纳米材料的替代种类。它们完全是有机的，并且含有生物良性成分以克服金属离子引起的毒性。照射基于PPV的SPN会形成不稳定的化学缺陷(二氧杂环丁烷(dioxetane)单元)，其可以自发且缓慢地分解以释放引起余辉发光的光子。尽管控制基于PPV的SPN的余辉发光的机理类似于化学发光，但是它不需要外源性ROS来触发反应。相反，SPN本身可以在光照射下产生单线态氧(1O2)，并随后引起余辉发光。这种余辉机理也不同于稀土掺杂的无机纳米颗粒，在稀土掺杂的无机纳米颗粒中吸收的光子能量存储在固有缺陷晶格中而不是光诱导的化学缺陷中。
因此，本文公开了发射近红外余辉发光的聚合物复合纳米颗粒，该纳米颗粒包括：
(a)式I的半导体聚合物：
Figure BDA0002358183870000351
(b)任选地，两亲性共聚物；以及
(c)任选地，具有近红外发射的小分子染料，其中：
两亲性共聚物(当存在时)包封式I的半导体聚合物和小分子染料(当存在时)；以及
在式I的聚合物中：
R1至R3和R5独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中，1≤q≤50，
R4代表式Ia或式Ib的部分：
Figure BDA0002358183870000352
其中，1≤s≤50且10≤t≤500；
Figure BDA0002358183870000353
其中，1≤u≤50且10≤v≤500；
R6代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中，q、s、t、u和v如上所定义；
R7代表单线态氧敏化部分；
n、m和o中的每个均大于或等于0，并且p为0或1，其中，n、m、o和p中的至少一个大于0；
A代表式Ic或Id的部分：
Figure BDA0002358183870000361
其中，R8和R11独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中：1≤q≤50；
R9和R12独立地代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中，q、s、t、u和v如上所定义；
R10和R13独立地代表单线态氧敏化部分；
当p为1时，则w、x、y和z(当存在时)独立地大于或等于0；以及
当o和p为0时存在小分子染料，并且当为以下情况时任选地存在小分子染料：
o大于或等于20；
p为1且x或z大于或等于20；
o和x的总和大于或等于20；
o和z的总和大于或等于20；
(o+x)/(n+m+o+w+x)>0.05；或(o+z)/(n+m+o+y+z)>0.05；
当m、o和p为0时存在两亲性共聚物，并且当为以下情况时任选地存在两亲性共聚物：
(m+o+w)/(n+m+o+w+x)>0.1；或者
(m+o+y)/(n+m+o+y+z)>0.1；以及
前提为当n大于0时，则m、o和p中的一个或多个也大于0。
应该理解，上述复合纳米颗粒涵盖了以下情况：
(aa)存在所有三种组分(a)、(b)和(c)；
(ab)仅存在组分(a)和(b)；
(ac)仅存在组分(a)和(c)；以及
(ad)仅存在组分(a)。
在存在所有三种组分(a)、(b)和(c)的情况下，两亲性共聚物(组分(b))包封式Ⅰ的半导体聚合物(组分(a))和小分子染料(组分(c))。当在本文中使用时，术语“包封”是指其他材料被完全捕获在包封材料的聚合物基质内。
在仅存在组分(a)和(b)的情况下，两亲性共聚物(组分(b))包封式I的半导体聚合物(组分(a))。如上所述，当为以下情况时可以不需要小分子染料：(o+x)/(n+m+o+w+x)>0.05；或者(o+z)/(n+m+o+y+z)>0.05，或者更特别地，p为1且x或z大于或等于20，或者更特别地，o大于或等于20；o和x的总和大于或等于20；或o和z的总和大于或等于20。应该理解，在上述条件下，可以排除小分子染料的原因是因为式I的半导体聚合物掺入了提供相同官能的等效基团(即，单线态氧敏化部分)。因此，在某些实施方式中，当满足任何前述条件时，则不存在小分子染料。
在仅存在组分(a)和(c)的情况下，式I的半导体聚合物(组分(a))包封小分子染料(组分(c))。如上所述，当：(m+o+w)/(n+m+o+w+x)>0.1或(m+o+y)/(n+m+o+y+z)>0.1时，可以不需要两亲性共聚物。在其他实施方式中，当为以下情况时可以不需要两亲性共聚物：
m大于或等于20且m/(n+m+o)大于0.1且R6为CqH2q+1，其中1≤q≤50；
m大于或等于20，并且(m+o)/(x+y+z)大于0.1，并且R6是式Ia的部分或式Ib的部分；或者
o大于或等于20，并且(m+o)/(x+y+z)大于0.1，并且R6是式Ia的部分或式Ib的部分。在某些实施方式中，当满足任何前述条件时，则不存在两亲性共聚物。
应当理解的是，关于不存在组分(b)和(c)的上述条件也适用于仅存在(a)的情况。也就是说，当关于不存在两亲性共聚物和小分子染料的上述条件的任何技术组合被满足时，可导致这两种组分都不存在。
本发明的优选实施方式包括以上以(ac)、更特别地(ab)和再更特别地(aa)列出的那些。换言之，优选实施方式是其中存在两亲性共聚物的那些。
鉴于上述内容，还应理解的是，本发明还涉及式I的半导体聚合物：
Figure BDA0002358183870000381
在式I的聚合物中：
R1至R3和R5独立地代表式CqH2q+1的烷基链；其中，
1≤q≤50，
R4代表式Ia或式Ib的部分：
其中，1≤s≤50且10≤t≤500；
Figure BDA0002358183870000391
其中，1≤u≤50且10≤v≤500；
Figure BDA0002358183870000392
R6代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中，q、s、t、u和v如上所定义；
R7代表单线态氧敏化部分；
n、m和o中的每个均大于或等于0；
p为0或1；
A代表式Ic或Id的部分：
Figure BDA0002358183870000393
Figure BDA0002358183870000401
其中，R8和R11独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中：1≤q≤50；
R9和R12独立地代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中，q、s、t、u和v如上所定义；
R10和R11独立地代表单线态氧敏化部分；
当p为1时，则w、x、y和z(当存在时)独立地大于或等于0；
前提为：
当n大于0时，m、o和p中的一个或多个也大于0；以及
n、m、o和p中的至少一个大于0。
在本文的实施方式中，词语“包括/包含”可以被解释为需要所提到的特征，但是不限制其他特征的存在。替代地，词语“包括”还可以涉及意为仅存在所列出的组分/特征的情况(例如，词语“包括/包含”可以由短语“由……组成”或“基本上由……组成”代替)。将明确想到，可以将更宽和更窄的解释应用于本发明的所有方面和实施方式。换言之，词语“包括/包含”及其同义词可以由短语“由……组成”或短语“基本上由……组成”或其同义词代替，反之亦然。
除非另有明确说明，否则对式I的半导体聚合物的实施方式的引用可以等同地指聚合物本身或作为包括两亲性共聚物和具有近红外发射的小分子染料的一种或多种的复合材料的一部分的聚合物。
除非另有说明，否则术语“烷基”是指饱和的非支链或支链的无环烃基。烷基基团可以是任何C1-50烷基基团，并且更优选C1-10烷基(诸如，乙基、丙基(例如，正丙基或异丙基)、戊基，或更特别地丁基(例如，支链或非支链丁基)、辛基(例如，非支链或更特别地支链辛基(例如，2-乙基己基))或甲基)。
当在本文中使用时，术语“r”用于指示当n、m、o和p中的两个或更多个大于0时，式I的半导体聚合物是无规共聚物。
在本发明的某些实施方式中，n和/或p可以为0。
在本发明的某些实施方式中，当n、m、o和p中的一个或多个不为零时，则n、m、o、w、x、y和z中的每个可以独立地具有5至1000的值，诸如10至750，诸如15至500，诸如20至250，诸如50至100。当在本文中提供范围的列表时，所提供的端值的任何技术上合理的组合都可以用于提供其他范围。例如，在上述列表中，明确包括在内的其他范围包括：
5至10、5至15、5至20、5至50、5至100、5至250、5至500和5至750；
10至15、10至20、10至50、10至100、10至250、10至500和10至1000；
15至20、15至50、15至100、15至250、15至750和5至1000；
20至50、20至100、20至500、20至750和20至1000；
50至250、50至500、50至750和50至1000；
100至250、100至500、100至750和100至1000；
250至500、250至750和250至1000；
500至750和500至1000；以及
750至1000。
应当理解的是，将明确想到对于其他列出范围的相同类型的组合。
在本发明的实施方式中，式I的聚合物的数均分子量可以为1,000至300,000道尔顿，诸如1,000至100,000道尔顿，诸如1,500至50,000道尔顿，诸如25,000至75,000道尔顿。
当在本文中使用时，术语“单线态氧敏化部分”是指任何合适的有机或有机金属部分，该有机或有机金属部分能够使处于三重态的氧转化成其单线态之一，并且可以掺入到本文公开的有机聚合物类型中。更特别地，单线态氧敏化部分可以是光敏部分。可以作为单线态氧敏化部分掺入式I的聚合物中的合适的光敏化合物公开于DeRosa,M.C.andCrutchley,R.J.Photosensitized singlet oxygen and its applications,Coordination Chemistry Reviews 233/234(2002)351/371，具体地在所述综述文章的第354至359页，其通过引用并入本文。更特别地，R7、R10和R13的单线态氧敏化部分可以独立地选自由以下组成的组中的一种或多种：金属卟啉、金属酞菁、萘酞菁、金属-萘酞菁、二氢卟吩、若丹明、花青、类胡萝卜素、花青素、孟加拉玫瑰红、亚甲基蓝，以及更特别地，2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物))和基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂(例如，该组可以由以下中的一种或多种组成：2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)以及基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂)。
类似地，当在本文中使用时，术语“具有近红外发射的小分子染料”是指能够使处于三重态的氧转变成其单线态之一的任何合适的有机或有机金属分子，其作为与式I的半导体聚合物独立的实体。更特别地，具有近红外发射的小分子染料可以是光敏部分。合适的光敏化合物公开于DeRosa,M.C.and Crutchley,R.J.Photosensitized singlet oxygenand its applications,Coordination Chemistry Reviews 233/234(2002)351/371，具体地在所述综述文章的第354至359页，其通过引用并入本文。更特别地，具有近红外发射的小分子染料可以选自由以下组成的组中的一种或多种：金属卟啉、金属酞菁、萘酞菁、金属-萘酞菁、二氢卟吩、若丹明、花青、类胡萝卜素、花青素、孟加拉玫瑰红、亚甲基蓝，以及更特别地，2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)以及基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂(例如，该组可以由以下中的一种或多种组成：2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)以及基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂)。
在本发明的实施方式中，式I的聚合物可以选自以下列出的聚合物：
(i)
Figure BDA0002358183870000431
其中，n和m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中n和m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为25,000至200,000道尔顿，诸如45,000至150,000道尔顿，诸如50,000至100,000道尔顿，诸如约59,781道尔顿，和/或聚合物中n个重复单元的摩尔比为约88％，且聚合物中m个重复单元的摩尔比为约11％(例如，聚合物中n个重复单元的摩尔比为88.0至89.0％，且聚合物中m个重复单元的摩尔比为11.0至12.0％)；
(ii)
Figure BDA0002358183870000441
其中，m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为15,000至100,000道尔顿，诸如20,000至75,000道尔顿，诸如20,000至50,000道尔顿，诸如约26,565道尔顿；
(iii)
Figure BDA0002358183870000451
其中，p为1，并且y和z个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为5,000至20,000道尔顿，诸如7,000至18,000道尔顿，诸如8,900至15,000道尔顿，诸如约13,000道尔顿，和/或聚合物中y个重复单元的摩尔比为85至99％，且聚合物中z个重复单元的摩尔比为1至15％(例如，聚合物中y个重复单元的摩尔比为90.0至95.0％，且聚合物中z个重复单元的摩尔比为5.0至10.0％)。
当在本文中使用时，术语“两亲性共聚物”是指含有至少两种单体单元的聚合物材料(例如为无规共聚物或更特别地嵌段共聚物)，其中，所得的聚合物具有一个或多个本质上疏水的部分和一个或多个本质上亲水的部分。合适的两亲性共聚物的实例包括但不限于包括以下的组中的一种或多种：烷基取代的壳聚糖，以及更特别地聚(烷基)-b-聚(乙二醇)、聚(乙二醇)-b-聚(丙二醇)-b-聚(乙二醇)、聚(乙二醇)甲基醚-嵌段-聚(丙交酯-co-乙交酯)(PEG-PLGA)、聚(苯乙烯)-嵌段-聚(丙烯酸)(PS-PAA)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(PSMA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)。可以使用任何合适分子量的两亲性共聚物。例如，两亲性共聚物可具有的数均分子量为1,000至50,000道尔顿，诸如1,500至40,000道尔顿，诸如5,000至25,000道尔顿，诸如4,000至20,000道尔顿。
在本发明的某些实施方式中，两亲性共聚物还可以包括在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分。当在本文中使用时，术语“淬灭部分”旨在表示能够吸收激发能并将其作为非光的另一种形式的能量再发射的任何部分。合适的淬灭部分的实例包括暗淬灭剂，其包括但不限于dabsyl(二甲氨基偶氮苯磺酸)、黑洞淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa黑RQ、Iowa黑RQ、IRDye QC-1和2,4-二硝基苯磺酰基部分。合适的暗淬灭剂包括黑洞淬灭剂(BHQ)-1、BHQ-2、BHQ-3和QSY-7，以及2,4-二硝基苯基磺酰基(DNBS)部分。
如上所述，淬灭部分以这样的方式连接到两亲性共聚物，使得在测试/成像部位处可存在的某些条件下，它可以在暴露于反应性部分后被去除。换言之，淬灭部分包括淬灭基团和连接基团两者，其并入了反应性基团，在某些条件下可被切断。合适的淬灭部分(并入了接头)的实例包括但不限于硫醇敏感部分，诸如2，4-二硝基苯磺酰基(DNBS)部分，和
Figure BDA0002358183870000461
活性氧物类敏感部分
Figure BDA0002358183870000462
pH敏感部分，诸如
Figure BDA0002358183870000463
Figure BDA0002358183870000464
肽淬灭剂部分，诸如弗林蛋白酶敏感的Arg-Arg-Val-Arg-淬灭剂、Caspase-3敏感的Asp-Val-Glu-Asp-淬灭剂、成纤维细胞激活蛋白-α(FAPα)敏感的Gly-Pro-淬灭剂、基质金属蛋白酶2(MMP-2)敏感的Gly-Arg-Val-Gly-Leu-Pro-淬灭剂、MMP-7敏感的Gly-Met-Trp-Ser-Leu-Pro-Val-淬灭剂、MMP-13敏感的Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Leu-Pro-淬灭剂、组织蛋白酶B敏感的Lys-lys-淬灭剂、组织蛋白酶D-敏感的Leu-Arg-Phe-Phe-Cys-Ile-Pro-淬灭剂、组织蛋白酶S-敏感的Arg-Leu-淬灭剂、尿激酶敏感的Arg-Gly-淬灭剂和Legumain-敏感的Asn-Ala-Ala-淬灭剂，其中，淬灭剂是暗淬灭剂(例如，如上定义的)。
在其中两亲性共聚物还包括淬灭部分的本发明的特定实施方式中，两亲性共聚物可以选自以下中的一种或多种：
Figure BDA0002358183870000471
(C18PEG12-DNBS)、
Figure BDA0002358183870000472
Figure BDA0002358183870000473
以及
Figure BDA0002358183870000474
例如，包括淬灭部分的两亲性共聚物可以是C18PEG12-DNBS。
因此，在本发明的特定实施方式中，两亲性共聚物选自以下中的一种或多种：聚(乙二醇)-b-聚(丙二醇)-b-聚(乙二醇)(例如(PEG)100-b-(PPG)65-b-(PEG)100)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)和
Figure BDA0002358183870000481
应理解的是，本文定义的式I的聚合物和聚合物复合纳米颗粒能够发射NIR余辉发光。因此，复合材料和/或式I的聚合物可以用于余辉成像技术。考虑到这一点，提供了：
(ia)如上定义的聚合物复合纳米颗粒在制备成像剂中的用途，该成像剂用于使用余辉发光来诊断深部组织和/或器官中的病症或疾病；
(ib)使用如上定义的聚合物复合纳米颗粒在深部组织和/或器官中进行体内成像的方法，该方法包括在将聚合物复合纳米颗粒提供至活生物体(例如将聚合物复合纳米颗粒皮下、皮内或静脉内注射到活生物体中)之前或之后，用NIR激光照射该聚合物复合纳米颗粒，并使用成像系统/装置检测余辉发光；以及
(ic)如上定义的聚合物复合纳米颗粒，用作成像剂用于使用余辉发光来诊断深部组织和/或器官中的病症或疾病。
应理解的是，(ia)和(ic)中提到的成像可以是体外的，或更特别地是体内的。
当在本文中使用时，参考使用模式，术语“聚合物复合纳米颗粒”可以指如以上项目(aa)至(ad)中所描述的纳米颗粒。即，聚合物复合纳米颗粒可以仅包含式I的半导体聚合物，或者另外包含两亲性共聚物和小分子染料中的一种或两种。在本文可提及的特定实施方式中，除了式I的聚合物以外，聚合物复合纳米颗粒还可以包含两亲性共聚物和小分子染料中的至少一种，并且优选地含有这两种组分。在本发明的优选实施方式中，聚合物复合纳米颗粒可以是在其中存在两亲性共聚物并且还包括在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分的那些，这样的淬灭部分已在上文详细描述。
当在本文中使用时，关于组织和/或器官使用的术语“深部”是指组织和/或器官具有的成像深度大于2cm。本文可能提及的器官和/或组织包括但不限于脑、肺、肝、胃、肠、肾和膀胱。
术语“生物体(organism)”、“生物体(organisms)”、“患者(patient)”和“患者(patients)”包括指哺乳动物(例如，人类)患者。如本文所用，术语“受试者”或“患者”在本领域中是众所周知的，并且在本文中可互换地使用，指哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，且最优选地人类。在一些实施方式中，受试者是需要治疗的受试者或患有疾病或病症的受试者。然而，在其他实施方式中，受试者可以是正常受试者。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在覆盖成年和幼年受试者，无论是雄(男)性还是雌(女)性。
当在本文中使用时，术语“近红外”或“NIR”是指波长为700至1,400nm，诸如在700至1400nm之间。当在本文中使用时，“NIR激光”可以指具有的波长为700至1,400nm，诸如750至1,000nm，诸如800至900nm，诸如808nm的激光。
术语“有效量”是指赋予被治疗的患者治疗效果的化合物的量(例如，足以治疗或预防疾病)。效果可以是客观的(即，通过一些测试或标记物可测量的)或主观的(即，受试者给出了指示或感觉到了效果)。
聚合物复合纳米颗粒可以以包括化合物的药物制剂形式以药学上可接受的剂型通过任何合适的途径来给药，但是可以特别地通过以下途径给药：口服、静脉内、肌内、皮肤、皮下、经粘膜(例如，舌下或颊)、直肠、透皮、鼻、肺(例如，气管或支气管)、局部、通过任何其他肠胃外途径。可以提及的特定给药方式包括皮下、皮内或静脉内给药。在替代实施方式中(例如，在手术期间)，给药方式可以是将含有聚合物复合纳米颗粒的组合物喷涂到受试者的感兴趣部位上。
聚合物复合纳米颗粒通常将作为与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的药物制剂来给药，佐剂、稀释剂或载体可以适当考虑预期的给药途径和标准药物实践来选择。这些药学上可接受的载体对活性化合物可以是化学上惰性的，并且在使用条件下可以没有有害的副作用或毒性。合适的药物制剂可以在例如Remington The Science and Practiceof Pharmacy,19th ed.,Mack Printing Company,Easton,Pennsylvania(1995)中找到。对于肠胃外给药，可以使用肠胃外可接受的水溶液，其不含热原并且具有必需的pH、等渗性和稳定性。合适的溶液是技术人员熟知的，文献中描述了许多方法。药物递送方法的简要综述也可以在例如Langer,Science(1990)249,1527中找到，其也可广泛地适用于本发明。
另外，合适制剂的制备可以常规地由技术人员使用常规技术和/或根据标准和/或公认的药物实践来实现。
根据本发明使用的聚合物复合纳米颗粒制剂的量将取决于各种因素，诸如，待成像的组织和/或器官的尺寸，特定的患者以及所采用的纳米颗粒。在任何情况下，制剂中聚合物复合纳米颗粒的量可以由技术人员常规地确定。
例如，固体口服组合物(诸如片剂或胶囊剂)可以含有1至99％(w/w)的聚合物复合纳米颗粒；0至99％(w/w)的稀释剂或填料；0至20％(w/w)的崩解剂；0至5％(w/w)的润滑剂；0至5％(w/w)的助流剂；0至50％(w/w)的造粒剂或粘合剂；0至5％(w/w)的抗氧化剂；以及0至5％(w/w)的色素。
肠胃外制剂(诸如，用于注射的溶液或混悬液或用于输注的溶液)可以含有1至50％(w/w)的聚合物复合纳米颗粒；和50％(w/w)至99％(w/w)的液体或半固体载体或溶媒(例如溶剂，诸如水)；和0-20％(w/w)的一种或多种其他赋形剂，诸如缓冲剂、抗氧化剂、悬浮稳定剂、张力调节剂和防腐剂。
取决于待成像的器官/组织，和待治疗的患者以及给药途径，可以将聚合物复合纳米颗粒以不同剂量向有需要的受试者给药。当在本文中使用时，术语“剂量”旨在指提供给生物体/受试者的聚合物复合纳米颗粒的量以提供所需图像。它并不旨在暗示任何治疗功效。
然而，在本发明的上下文中，向哺乳动物特别是人给药的剂量应该足以在合理的时间范围内实现对哺乳动物中器官和/或组织的成像。本领域技术人员将认识到，除其他以外，确切剂量和组合物以及最合适的递送方案的选择还将受以下的影响：制剂的药理特性、待成像的器官和/或组织的性质以及接受者的身体状况和精神敏锐度、受试者的年龄、病症、体重、性别以及可影响所述器官/组织的疾病的阶段/严重程度。
给药可以是连续的或间歇的(例如，通过团注法)。剂量还可以通过给药的时间和频率来确定。在口服或肠胃外给药的情况下，每个成像循环根据本发明的聚合物复合纳米颗粒的剂量可在约0.01mg至约1000mg之间变化。
在任何情况下，医师或其他技术人员能够常规地确定将最适合个体受试者的实际剂量。上述剂量是平均情况的示例；当然，在个别实例中可以具有更高或更低的剂量范围，并且这也在本发明的范围之内。
根据本发明的纳米颗粒可以以任何合适的制剂通过任何合适的给药途径供应(例如，皮下、皮内或静脉注射到活体受试者(例如，小鼠)中)。如上所述，聚合物复合纳米颗粒的激活可以在给药和递送至作用部位之后或在某些情况下在其之前完成。给药前的激活可以通过用NIR激光(例如，808nm激光)预照射组合物适当的时间段来完成。如果预照射的纳米颗粒在完成成像测试之前失去了余辉照明，则可以在继续采集余辉发光图像之前，通过照射需要成像的部位适当的时间段来重新激活它们(例如，对于小鼠，用808nm激光，持续1分钟)。在以非激活状态供应纳米颗粒的情况下，可以在开始采集余辉发光图像之前，通过预照射需要成像的部位适当的时间段来激活它们(例如，对于小鼠，用808nm激光，持续1分钟)。
应当理解，当聚合物复合纳米颗粒包括淬灭部分作为两亲性共聚物的一部分时，则不需要预激活步骤，因为所提供的激活能会被淬灭剂吸收。在这种情况下，在给药前没有预激活，而是一旦聚合物复合纳米颗粒到达感兴趣部位就在体内进行首次激活。应当注意的是，包括淬灭部分作为两亲性共聚物的一部分的聚合物复合纳米颗粒的相关优点在于，待成像的组织和/或器官可以是仅有的表现出余辉发光的组织和/或器官。更特别地，表现出余辉发光的组织和/或器官可以仅当它们遭受导致淬灭部分中的连接基团(如上所定义)快速断裂的疾病或病症时才表现出余辉发光。这样的疾病和病症可以包括癌症/肿瘤或肝脏的氧化应激。
在一般实例中，当受试者是小鼠时，则可以使用IVIS Spectrum成像系统在不同时间(诸如在注射后t＝0.5、1、2、4、8、12、24、36和48h)采集余辉发光图像，其中根据需要对聚合物复合纳米颗粒进行(重新)激活。应当理解的是，成像的时间和频率可以根据待成像的受试者器官和/或组织而变化。如下面在实施例部分中更详细地讨论的，一旦发生了余辉成像，便通过t-检验分析余辉的强度，并总结出指导性的诊断结果。
上述成像技术的一种特定应用是定位淋巴结和/或可视化肿瘤。本文可以提及的肿瘤包括但不限于乳腺肿瘤、肺部肿瘤和肝脏肿瘤。应当理解的是，这些组织/器官可以表现出增强的代谢活性，从而使得能够快速去除在本发明的某些实施方式(即，在其中两亲性共聚物包括淬灭剂部分的聚合物复合纳米颗粒)中描述的淬灭部分。因此，在本发明的特定实施方式中，当聚合物复合纳米颗粒包括含有淬灭剂的两亲性共聚物时，可以在对受试者进行手术(例如，以去除肿瘤)的同时进行成像技术。在这种情况下，可以将聚合物复合纳米颗粒直接喷涂到感兴趣部位上，或者如上所述递送到作用部位，以确定在所述手术过程期间是否已去除所有的病变器官/组织。
最后，当复合纳米颗粒聚合物复合纳米颗粒包括两亲性共聚物，该两亲性共聚物还包括如上定义的在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分(例如，两亲性共聚物可以为C18-PEG12-DNBS)时，所得材料可以特别适合于确定受试者肝脏中的氧化应激。鉴于此，提供了：
(iia)如上在本发明的第一方面中定义的聚合物复合纳米颗粒(其中，两亲性共聚物还包括如上定义的在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分(例如，两亲性共聚物可以是C18-PEG12-DNBS))在制备用于对受试者肝脏中的氧化应激进行体内成像的方法中的成像剂的用途，该方法包括以下步骤：将聚合物复合纳米颗粒供应到活生物体中，用NIR激光照射聚合物复合纳米颗粒，并且使用成像系统/装置检测肝脏中的余辉发光；
(ib)使用如上在本发明的第一方面中定义的聚合物复合纳米颗粒(其中，两亲性共聚物还包括如上定义的在体外或体内测试部位中可被反应性部分切断的淬灭部分(例如，两亲性共聚物可以是C18-PEG12-DNBS))对受试者肝脏中的氧化应激进行体内成像的方法，该方法包括以下步骤：将聚合物复合纳米颗粒静脉内注射到活生物体中；然后用NIR激光照射聚合物复合纳米颗粒；并然后使用成像系统/装置检测肝脏中的余辉发光。在本发明的各种实施方式中，可以通过使被皮下、皮内或静脉内注射了聚合物复合纳米颗粒的活生物体或活生物体的一部分经受NIR激光照射，从而在体内重新激活所注射的聚合物纳米颗粒的余辉发光；以及
(ic)如上在本发明的第一方面中定义的聚合物复合纳米颗粒，其中，两亲性共聚物还包括如上定义的在体外或体内测试部位中可被反应性部分切断的淬灭部分(例如，两亲性共聚物可以是C18-PEG12-DNBS)，用作成像剂用于使用余辉发光来确定受试者肝脏中的氧化应激。在小鼠中进行的这样的测试的实例在实施例部分提供。
尽管氧化应激可以是受试者的肝脏所遭受的任何氧化应激，但它可以特别适用于确定药物诱导的肝毒性。
本发明和公开的其他方面和实施方式通过以下非限制性实施例提供。
实施例
结合以下实施例将进一步描述本发明，这些实施例仅出于说明的目的而提出。
实验
材料和方法
化学品和其他材料
除非另有说明，否则实验中使用的所有化学品均购自Sigma-Aldrich。聚(2,5-二辛基-1,4-亚苯基亚乙烯基)(POPPV)、聚[(9,9'-二辛基芴基-2,7-二基)-alt(苯并[2,1,3]噻二唑-4,7-(二基)](PFBT)、聚(5-(2-乙基己氧基)-2-甲氧基氰基对苯二亚甲基)(MEHCPV)、二甲苯基封端的聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基](MEHPP)和聚[2,5-双辛氧基]-1,4-亚苯基亚乙烯基](BOPPV)购自Luminescence Technology Corp.。多聚甲醛购自VWR Singapore Pte Ltd.。1,10-二溴癸烷和2-乙基己基溴购自TCI Ltd.。具有3kDa MWCO的透析膜购自Spectrum Labs。
仪器和表征
使用CDCl3或D2O作为溶剂，通过使用Bruker Avance II 300MHz NMR记录质子核磁共振(1H NMR)光谱。光谱以0ppm处的四甲基硅烷信号为内部参考。在生物发光(无激发)模式下，使用IVIS Spectrum成像系统收集并获得余辉信号和图像。通过Nicolet 8700FT-IR光谱仪获得傅立叶变换红外(FT-IR)光谱。GPC结果通过Shimadzu LC-VP系统以聚苯乙烯为标准并且以THF为洗脱液进行测量。动态光散射(DLS)测量在Malvern Nano-ZS粒度仪上进行。透射电子显微镜(TEM)图像以40至120kV的加速电压从JEM 1400TEM捕获。
在Shimadzu UV-2450分光光度计上记录吸收光谱。在Fluorolog3-TCSPC分光荧光计(Horiba Jobin Yvon)上进行荧光测量。通过使用LSM510共聚焦激光扫描显微镜(CarlZeiss，德国)用488nm的激发波长获得细胞的共聚焦荧光图像。
通过IVIS Spectrum成像系统采集荧光和余辉发光图像。使用具有514nm过滤器的绿光激光器(Stellar-Pro ML/150，Modu-Laser，Centerville，UT，美国)获取514nm激光激发。除非另有说明，否则使用购自CNI Co.,Ltd.的808nm高功率NIR激光器(工作模式：CW，光纤后输出功率：2.5W，LED显示：二极管电流，多模光纤，光纤芯直径：400μm，光纤连接器：SMA905，带有可调激光驱动模块：0-100％，激光斑点尺寸：1cm2)照射样品或其他照射部位1min以产生余辉发光。
对于纳米颗粒的体外成像，除非另有说明，否则通过在465±10nm或430±10nm处激发并在580±10或780±10nm处发射来采集荧光图像0.1s。通过对面积进行积分来计算荧光图像的强度。在一些实验中，在520±20nm或720±20nm处发射。对于体内实验，通过在465±10nm或710±10nm处激发并且在780±10nm处发射来进行荧光成像0.1s。对于余辉发光成像，除非另有说明，否则以对于体外实验功率密度为1W/cm2和对于体内实验功率密度为0.3W/cm2，将样品通过514nm或808nm预照射1min。对于体内实验，激光器输出配备有凹透镜，并且配置在距小鼠上方约10cm，使得输出激光可以覆盖小鼠的整个身体。余辉发光图像的体外采集使用开放式过滤器或特定发射过滤器进行0.1s的采集。余辉发光图像的体内采集使用开放式过滤器进行30s。
生物学试验
淋巴结成像
对于SPN-NCBS5：在结果的充分复制与小鼠数量的减少之间进行平衡，试验大小为每个处理3只小鼠。所有的小鼠图像都包括在分析中。随机选择小鼠的笼子进行以下处理。将SPN-NCBS5(0.25mg/mL，0.05mL)的溶液进行照射并在-20℃下储存一天。然后立即将温热的SPN-NCBS5通过皮内注射给药到使用含2％异氟烷的氧气进行麻醉的活体小鼠的前爪。在注射后t＝30min，收集余辉发光和荧光图像。在注射后t＝65min，通过808nm激光以1W/cm2的功率密度照射小鼠1min。然后在注射后70min、100min和130min再次使用无光照射收集余辉发光和荧光图像。在成像过程期间，在连续异氟烷麻醉下用加热垫温热小鼠。
对于SPPVN：通过皮内注射将SPPVN(450μg/mL，0.05mL)给药至使用含2％异氟烷的氧气进行麻醉的活体小鼠的前爪。在注射后t＝60min，通过808nm激光照射小鼠1min，采集余辉发光和荧光图像。用开放式过滤器收集余辉发光图像30s。通过在710±10nm处激发并在780±10nm处发射采集荧光图像0.1s。
肿瘤小鼠模型
所有动物实验均按照由Sing Health动物护理和使用委员会(IACUC)制定的准则进行。
为了在八周龄的BALB/c小鼠中建立肿瘤，将HeLa细胞(每只小鼠3-5×106个细胞)悬浮于DMEM补充培养基(1mL，10％FBS，1％青霉素/链霉素抗生素)中，并且每只小鼠在右肩皮下注射0.1mL。在成像实验之前，允许肿瘤生长至单个方面为6～8mm(大约10-15天)。
为了建立荷瘤小鼠模型，将4T1细胞悬液(200μL，1×106)皮下注射到裸鼠的左肩。在成像实验之前，使肿瘤生长约7天。为了建立用于敏感性肿瘤成像的小尺寸肿瘤荷瘤小鼠模型，将悬浮于50ml的基质胶在补充DMEM(10％FBS，1％pen/strep(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中的50％v/v混合物中的两百万个4T1细胞皮下注射到小鼠的肩膀以在六周龄雌性nu/nu小鼠中建立肿瘤模型。然后将荷瘤小鼠分为两组，每组有三只小鼠。对于一组，在用于体内成像实验之前，使肿瘤生长直至单个方面为约2mm。对于另一组，在使用前使肿瘤生长直至单个方面为约1mm。
肿瘤体积如下计算：
体积＝(1/2)Dd2
在等式中，D代表肿瘤的最大直径，而d代表肿瘤的最小直径。
为了建立腹膜转移性小鼠模型，将4T1细胞悬液(100-200μL，2-4×105)腹腔注射到裸鼠中。在成像实验之前，使肿瘤生长约3-4天。
动物和肿瘤成像
对于SPN-NCBS5：在结果的充分复制与小鼠数量的减少之间进行平衡，试验大小为每个处理3只小鼠。所有的小鼠图像都包括在分析中。随机选择荷瘤小鼠的笼子进行以下处理。通过尾静脉系统地注射SPN-NCBS5(0.25mg/mL，0.2mL)(n＝3)。在注射后t＝0.5、1、2、4、8、12、24、36和48h采集余辉发光和荧光图像。荧光图像以0.1s的采集时间捕获，在710±10nm处激发并在780±10nm处发射。在采集余辉发光图像之前，用功率密度为0.5W/cm2的808nm激光照射小鼠1min(将808nm高功率NIR激光器的输出功率调整为5.5W，并用于以15cm的距离照射小鼠的全身)。用开放式过滤器以180s的采集时间捕获余辉发光图像。
对于SPPVN或PPVP：通过尾静脉将SPPVN或PPVP(450μg/mL，200μL)系统地注射到具有不同肿瘤体积的4T1荷瘤小鼠中。然后在注射后的不同时间点获得余辉发光和荧光图像。通过在710±10nm处激发并在780±10nm处发射采集荧光图像0.1s。在捕获余辉发光图像之前，通过808nm激光照射小鼠1min。然后用开放式过滤器以30s的采集时间采集余辉图像。为了进行体外生物分布研究，将小鼠通过CO2窒息处死，然后收集肿瘤、肝、脾、肠、肾、肺和心脏用于荧光成像，以评估SPPVN或PPVP的组织分布。
药物诱导的肝毒性的体内成像
在结果的充分复制与小鼠数量的减少之间进行平衡，试验组大小为每个处理3只小鼠。在这种样本大小的情况下，药物诱导的肝毒性的大的投影信号差异可以确保足够的功效(使用G*Power分析得出d＝4.2，α＝0.003，功效＝0.90)[例如，参见Liu,F.et al.,SciRep-Uk3(2013)]。所有的小鼠图像都包括在分析中。成像前将小鼠禁食8小时，用于所有药物诱导的肝毒性成像。随机选择小鼠的笼子进行以下处理。将小鼠腹腔注射APAP(300mg/kg)、盐水或N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC，200mg/kg)处理，然后进行APAP(300mg/kg)处理。20min后，使用含2％异氟烷的氧气对APAP、盐水和NAC/APAP处理的裸鼠进行麻醉，并然后通过尾静脉系统地注射SPN-硫醇(0.25mg/mL，0.2mL)。在SPN-硫醇注射之后2h，收集荧光图像和余辉发光图像。在710±10nm处激发并在780±10nm处发射，以0.1s的采集时间捕获荧光图像。在采集余辉发光图像之前，通过808nm激光以1W/cm2的功率密度照射小鼠1min。以180s的采集时间和开放式过滤器捕获余辉发光图像。为了确定SPN-硫醇的生物分布，4h后对小鼠实施安乐死。将心脏、肺、肝、肾和脾切除并放在黑纸上。通过808nm激光(1W/cm2)预照射所有器官1min，并采集余辉发光图像180s。使用Living Image 4.0软件通过ROI分析来分析每个个体器官的余辉发光强度。
细胞培养和细胞毒性试验
HeLa宫颈腺癌上皮细胞购自美国模式培养物保藏所(ATCC)。将HeLa细胞在具有10％FBS(GIBCO)的DMEM(GIBCO)中于含有5％CO2和95％空气的37℃潮湿环境中进行培养。然后将HeLa细胞接种到96孔板(每孔200μL，5000个细胞)中并培养24h，然后将SPPVN(最终浓度：0、5、10、20和40μg/mL)溶液添加到孔中。然后将细胞再温育24h，然后添加MTS(100μL，0.1mg/mL)再保持4h。通过使用酶标仪(microplate reader)在490nm下测量MTS的吸光度。通过用SPPVN温育的细胞的吸光度与仅用细胞培养基温育的细胞的吸光度的比值来计算细胞存活率。
在4T1细胞系中使用[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(MTS)生存力测定来测量体外细胞毒性。将4T1细胞在含有10％FBS的DMEM中于含有5％CO2和95％空气的潮湿环境中在37℃下进行培养。将4T1细胞以3×104个细胞/mL的浓度接种到96孔板(Costar，IL，美国)。温育24h后，用含有不同浓度(0、2.5、5、10、20、30μg/mL)的SPN-PPV-TPP悬浮液的新鲜培养基替换培养基，并然后将细胞温育24h。在指定的时间间隔后，将MTS试剂以1至10的体积比添加到细胞培养基中用于细胞温育。3h后在温育箱中进行UV测量(490nm)，并针对未处理的样品进行归一化以得到细胞存活率。
多细胞肿瘤球体(MCTS)的共聚焦荧光成像
为了产生MCTS，在组织培养瓶(T25)的底部涂覆一层聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)膜。将PHEMA(450mg)溶解于95％乙醇溶液(30mL)中，并将混合物在37℃下缓慢摇动24h。在PHEMA完全溶解后，将4mL溶液添加到组织培养瓶中。然后将烧瓶在37℃下干燥48h。为了进行灭菌，使用前必须将PHEMA涂覆的烧瓶暴露于紫外线1h。用胰蛋白酶消化4T1单层细胞以确保单细胞悬浮液，并使用血细胞计数器对细胞数量进行计数。将5mL新鲜DMEM培养基中的5×105个4T1细胞放入PHEMA涂覆的烧瓶中。将细胞在含有5％CO2的潮湿气氛中于37℃下温育，并且每隔一天更新一次培养基。在大约7天内自发形成了4T1 MCTS(直径约400μm)。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察MCTS对纳米颗粒的摄取。对于每个实验，用巴斯德吸管(Pasteur pipette)手检约20个4T1 MCTS，然后转移到5mL微量离心管(eppendorftube)中。将SPPVN或PPVP(25μg/mL)添加到MCTS悬浮液中，并在37℃下共培养12h。然后除去培养基，并用PBS(pH＝7.4)洗涤MCTS，然后用CLSM进行观察。
PPV-PEGL的体外生物降解性研究
在37℃下在含有NaCl(150mM)的磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.0)中，用H2O2(100μM)和MPO(40μg/mL)对PPV-PEGL溶液(10μg/mL)进行处理。由于酶活性损失，每温育36h后，补充H2O2和MPO三次。将巨噬细胞RAW264.7细胞用于体外生物降解性研究。RAW264.7细胞购自ATCC。将细胞在补充有10％FBS和青霉素/链霉素抗生素(1％)的DMEM中于含有5％CO2和95％空气的37℃潮湿环境中进行培养。在将细胞接种到成像皿中之后，用含有PPV-PEGL(30μg/mL)的培养基培养细胞12h。用含有脂多糖(LPS)(1μg/mL)的培养基刺激细胞0、4和12h。在成像前，将细胞用Hoechst 33342(NucBlue Live ReadyProbes试剂)染色，并用4％多聚甲醛固定。用CLSM获得细胞的共聚焦显微镜图像。
荧光和NIR余辉发光的体内组织穿透
为了进行荧光成像，将SPPVN(50μL，130μg/mL)的溶液置于活体小鼠的腹部下方。通过在710nm处激发并在780nm处发射采集荧光图像0.1s。对于余辉发光成像，用514或808nm激光预照射SPPVN(50μL，130μg/mL)溶液1min，并然后将该溶液置于活体小鼠的腹部下方。用开放式过滤器采集余辉发光图像30s。
用于区分缺氧和常氧环境的体内成像
在注射前，通过N2吹扫SPPVN溶液5min以除去溶液中的氧气。分别通过瘤内注射和皮下注射使用吹扫的SPPVN(130μg/mL，5μL)对4T1荷瘤小鼠进行处理。通过在710±10nm处激发并在780±10nm处发射采集荧光图像0.1s。在捕获余辉发光图像之前，通过808nm激光照射小鼠1min。用开放式过滤器以30s的采集时间采集余辉图像。
麻醉后，对裸鼠(n＝2)左肩中预植入的肿瘤原位注射50μL的SPN2.5(100μg/mL，通过用氮气吹扫溶液除去了氧气)。在这些小鼠的右肩中皮下注射相同的SPN2.5溶液。在500nm处激发后在720nm处采集小鼠的荧光图像。在用白光预照射1min之后，然后用开放式过滤器以30s的采集时间采集余辉图像。
体内腹膜转移性肿瘤成像
对于SPPVN或PPVP：通过尾静脉将SPPVN或PPVP(450μg/mL，200μL)系统地注射到腹膜转移性4T1荷瘤小鼠中。然后在注射后的不同时间点获得余辉发光和荧光图像。在注射后1.5h，切除注射的小鼠的皮肤和腹膜，然后获得小鼠下象限区域中的余辉发光和荧光图像。通过在710±10nm处激发并在780±10nm处发射采集荧光图像0.1s。在捕获余辉发光图像之前，通过808nm激光照射小鼠1min。然后用开放式过滤器以30s的采集时间采集余辉图像。
SPN2.5：将SPN2.5(400μg/mL，200μL)静脉注射到腹膜转移性4T1荷瘤小鼠中。在注射后的不同时间点(0h、20min、40min、1h、2h、4h)，在500nm处激发后在720nm处采集小鼠的荧光图像，而然后在用白光照射1min之后，使用开放式过滤器以30s的采集时间采集余辉发光图像。在注射后4h对小鼠实施安乐死，并采集去除了皮肤和腹膜的器官和肿瘤的荧光和余辉发光图像。
SPPVN的体内清除率
通过尾静脉将SPPVN(450μg/mL，20μL)系统地注射到小鼠中。在注射后t＝0h、1h、2h、4h、6h、1天、2天、4天、6天、10天、13天、16天和20天，捕获小鼠的荧光图像。通过在710±10nm处激发并在780±10nm处发射，以0.1s的采集时间采集荧光图像。
组织学分析
为了确认腹膜转移性肿瘤细胞，对小鼠实施安乐死并摘取肿瘤(组织)然后固定于4％多聚甲醛中。然后将肿瘤(组织)包埋在石蜡S15中，并切成10μm厚的切片用于按照标准方案进行苏木精和伊红(H&E)染色。通过Nikon ECLIPSE 80i显微镜(Nikon Corporation,Towa Optics,New Delhi，印度)捕获染色切片的图像。
数据分析
使用Living Image 4.0软件通过ROI分析对荧光和余辉发光图像进行定量。除非另有说明，否则结果表示为平均值±SD偏差。两组之间的统计比较通过学生t-检验来确定。对于所有测试，p<0.05被认为具有统计学显著性。所有统计计算均使用GraphPad Prismv.6(GraphPad Software Inc.,CA，美国)进行。
组分和/或中间体的制备
制备1：合成炔丙基封端的聚(乙二醇)甲基醚(Mn＝2000)(PEG-炔)
在冰浴下将聚(乙二醇)甲基醚((Mn＝2000g/mol)(1.0g，0.5mmol)溶解在无水THF(20mL)中，然后加入氢化钠(24mg，1mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌1h。随后将甲苯中的炔丙基溴(80wt％，110μL)添加到该混合物中，并在室温下进行反应24h。然后过滤混合物以除去任何沉淀物。将获得的溶液浓缩并沉淀到过量的二乙醚中以获得白色固体。将固体溶解在水中，并用水透析以除去杂质。冻干后获得产物。1H NMR(300MHz，CDCl3,δ)：4.20(d,2H)，3.65(s,165H)，3.38(s,3H)，2.44(t,1H)。
制备2：合成1-(10-溴癸氧基)-4-甲氧基苯(化合物2)
将4-甲氧基苯酚(0.5g，4mmol)和甲醇钠(0.24g，4.4mmol)溶解于乙醇(10mL)中，在环境温度下搅拌10min。向溶液中加入1,10-二溴癸烷(6g，20mmol)，并在回流条件下进行反应2h。在将溶液冷却至室温后，添加水(50mL)以稀释溶液。然后用二乙醚(50mL×3)萃取所得溶液，并将合并的有机相用无水硫酸钠干燥过夜。在去除二乙醚后，使用石油醚/二氯甲烷(DCM)(100:0至100:25)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化粗产物以得到产物(分离产率：92.4％)。1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：6.84(s,4H)，3.91(t,2H)，3.78(s,3H)，3.42(t,2H)，1.86(m,2H)，1.76(m,2H)，1.51-1.39(m,4H)，1.37-1.27(m,8H)。
制备3：合成1-(2-乙基己氧基)-4-甲氧基苯(化合物3)
将4-甲氧基苯酚(0.5g，4mmol)和甲醇钠(0.24g，4.4mmol)溶解于乙醇(10mL)中，在环境温度下搅拌10min。向溶液中加入2-乙基己基溴(0.96g，5mmol)，并在回流条件下进行反应2h。在将溶液冷却至室温后，添加水(50mL)以稀释溶液。用二乙醚(50mL×3)萃取所得溶液，并将合并的有机相用无水硫酸钠干燥过夜。在去除二乙醚后，使用石油醚/DCM(100:0至100:25)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化粗产物以得到产物(分离产率：87.5％)。1HNMR(300MHz,CDCl3,δ)：6.84(s,4H)，3.78(s,5H)，1.71(m,1H)，1.56-1.36(m,4H)，1.36-1.25(m,4H)，0.97-0.84(m,6H)。
制备4：合成1-(10-溴癸氧基)-2,5-双(溴甲基)-4-甲氧基苯(化合物4)
将化合物2(0.5g，1.5mmol)、多聚甲醛(0.21g)和乙酸中的氢溴酸(33wt％，0.7mL)加入到乙酸(2.8mL)中。在70℃于氮气气氛下进行反应4h。然后将DCM(40mL)添加到溶液中，并依次用水(30mL×2)、饱和碳酸氢钠(30mL)和盐水(30mL)洗涤有机相。有机相经无水硫酸钠干燥过夜。在去除DCM后，使用石油醚/DCM(100:0至100:20)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化粗产物以得到产物(分离产率：91.1％)。1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：6.86(s,2H)，4.54(s,4H)，4.00(t,2H)，3.87(s,3H)，3.42(t,2H)，1.86(m,4H)，1.54-1.29(m,12H)。
制备5：合成1-(2-乙基己氧基)-2,5-双(溴甲基)-4-甲氧基苯(化合物5)
将化合物3(0.34g，1.4mmol)、多聚甲醛(0.21g)和乙酸中的氢溴酸(33wt％，0.7mL)加入到乙酸(2.8mL)中。在70℃于氮气气氛下进行反应4h。然后将DCM(40mL)添加到溶液中，并依次用水(30mL×2)、饱和碳酸氢钠(30mL)和盐水(30mL)洗涤有机相。有机相经无水硫酸钠干燥过夜。在去除DCM后，使用石油醚/DCM(100:0至100:20)作为洗脱剂通过柱色谱法纯化粗产物以得到产物(分离产率：93.6％)。1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：6.86(s,2H)，4.53(s,4H)，3.87(s,5H)，3.87(s,3H)，1.71(m,1H)，1.56-1.36(m,4H)，1.41-1.29(m,4H)，0.96-0.79(m,6H)。
制备6：合成C18PEG12-DNBS
Figure BDA0002358183870000641
将十二聚乙二醇十八烷基醚胺(C18-PEG12-NH2，80mg，0.1mmol)和Et3N(27.5μL，0.2mmol)溶解在无水CH2Cl2中。在0℃下将2,4-二硝基苯磺酰氯(53mg，0.2mmol)逐滴加入到上述溶液中，并然后在室温下在氮气下搅拌溶液8h。反应后，将混合物用CH2Cl2稀释并用水洗涤。在减压下去除有机溶剂，并通过柱色谱法(CH3OH/CH2Cl2，1:8)纯化反应混合物以得到纯产物C18PEG12-DNBS(103mg，80％)。C18PEG12-DNBS的质量：C48H90N3O18S的计算值，[(M+H)+]：1028.59，实测值(obsvd.)ESI/MS:1028.18。C18PEG12-DNBS的1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：8.52(dd,J1＝8.4Hz,J2＝2.1Hz,1H)，8.35(d,J＝8.4Hz,1H)，6.66(t,1H)，3.61(m,51H)，3.45–3.55(m,8H)，3.42(t,2H)，3.33(m,2H)，1.54(t,2H)，1.22(m,47H)，0.84(m,3H)。C18PEG12-DNBS的13C NMR(75MHz,CDCl3)δ(ppm)：149.61，147.97，139.80，132.54，126.92，120.54，71.56，70.55，70.42，70.34，70.04，69.12，43.79，31.92，29.69，29.65，29.50，29.35，26.09，22.68和14.11。
制备7：合成PPV-Br1和PPV-BrL
在氮气气氛下将化合物4(对于PPV-Br1为50mg，对于PPV-BrL为5mg)和化合物5(对于PPV-Br1为0mg，对于PPV-BrL为50mg)溶解在无水THF(5mL)中。在40min内将叔丁醇钾于THF中的溶液(1M，0.4mL)逐滴加入到该溶液中。在室温下进行反应8h。过滤溶液以除去任何沉淀物。将获得的溶液沉淀到过量的甲醇中以得到红色固体，将其用甲醇洗涤两次。将收集的固体在真空下干燥以获得PPV-Br1或PPV-BrL。PPV-Br1：1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：7.50，7.18，6.66，4.65，4.09，3.96，3.75，3.40，1.86，1.48-0.93。PPV-BrL：1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：7.53，7.19，6.62，5.13，4.65，4.16-3.66，3.39，2.04，1.83，1.68，1.37，1.25，1.08-0.75。
制备8：合成PPV-N31和PPV-N3L
将PPV-Br1或PPV-BrL(5mg)溶解在THF(2.5mL)和N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合物中。将叠氮化钠(对于PPV-Br1或PPV-BrL的溴化物基团为2当量)加入该溶液中。在40℃下进行反应过夜。然后在减压下去除溶剂，并添加DCM(40mL)以溶解残余物。用水(40mL×3)洗涤获得的溶液，并将收集的有机相用无水硫酸钠干燥过夜。将所得溶液浓缩并沉淀到过量的甲醇中以得到红色固体，将其用甲醇洗涤两次。将收集的固体在真空下干燥以获得PPV-N31或PPV-N3L。PPV-N31：1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：7.52，7.19，5.36，5.12，4.55，4.09，3.96，3.76，3.24，1.86，1.47-0.99。PPV-N3L：1H NMR(300MHz，CDCl3，δ):7.53，7.19，6.63，5.12，5.01，4.64，4.14-3.58，3.23，2.04，1.83，1.68，1.37，1.26，1.09-0.71。
制备9：合成1,4-二溴-2,5-双((2-乙基己基)氧基)苯
将2,5-二溴对苯二酚(500mg，1.87mmol)、碳酸钾(780mg，5.61mmol)和二甲基甲酰胺(DMF)添加到50mL圆底烧瓶中，然后加入3-(溴甲基)庚烷(0.8mL，4.58mmol)。在80℃下进行反应12小时。将产物冷却至室温并用二氯甲烷(DCM)萃取。将有机层用水/盐水洗涤并经无水硫酸钠干燥。在真空下去除溶剂，并通过硅胶/己烷上的柱色谱法纯化粗产物，得到1,4-二溴-2,5-双((2-乙基己基)氧基)苯(697.5mg，76.3％产率)，为淡粘性油。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.08(s,2H)，3.82(d,J＝5.6Hz,4H)，1.73(dd,J＝12.1,6.0Hz,2H)，1.61–1.20(m,16H)，0.93(t,J＝7.5Hz,12H)。
制备10：合成PPV-TPP
将1,4-二溴-2,5-双((2-乙基己基)氧基)苯、7,18-二溴-5,10,15,20-四苯基卟啉、反式-1,2-双(三丁基锡)乙烯、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)和三(对甲苯基)膦添加到50mL Schlenk管中，然后通过注射器(脱气后的)添加氯苯。该管通过冷冻-泵-解冻循环充入氩气三次。在100℃剧烈搅拌下进行反应24h。将混合物冷却至室温，并在真空下去除溶剂。将粗产物倒入甲醇中，并将获得的棕色固体用甲醇洗涤三次。PPV：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.46(s,1H)，7.12(d,J＝21.9Hz,2H)，3.95(t,J＝29.7Hz,4H)，3.40(s,1H)，1.89(s,2H)，1.30(d,J＝26.2Hz,3H)，0.90(s,4H)。PPV-TPP2.5％：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.22(s,1H)，7.77(s,2H)，7.42(d,J＝25.4Hz,4H)，7.12(d,J＝18.6Hz,4H)，4.03(d,J＝30.0Hz,7H)，3.43(d,J＝6.7Hz,8H)，1.90(s,14H)，1.26(s,6H)，0.96–0.69(m,5H)。PPV-TPP5％：1HNMR(300MHz,CDCl3)δ8.21(s,1H)，7.77(s,1H)，7.49(s,2H)，7.23–6.97(m,2H)，3.95(t,J＝31.0Hz,4H)，3.28(s,1H)，1.96(d,J＝47.6Hz,2H)，1.62(d,J＝34.3Hz,6H)，1.27(t,J＝18.3Hz,5H)，1.08–0.67(m,5H)。
实施例1
合成半导体聚合物纳米颗粒(SPN)：SPN-MEHPPV、SPN-PFBT、SPN-MEHPP、SPN-MEHCPV、SPN-POPPV、SPN-BOPPV、SPN-MDMOPPV、SPN-NCBS和SPN-硫醇
使用配备了微尖端的探头式超声波仪(Branson，W-150)以2瓦RMS的输出功率，在连续的超声处理下，通过将混合物快速注入蒸馏去离子水(9mL，Milli-Q水)中持续2min，从而将含有MEHPPV(0.25mg/mL)(Sigma-Aldrich)和PEG-b-PPG-b-PEG(20mg/mL)(Sigma-Aldrich)的混合四氢呋喃(THF)溶液(1mL)用于制备SPN-MEHPPV。对于SPN-NCBS，混合的THF溶液(1mL)含有MEHPPV(0.25mg/mL)(Sigma-Aldrich)、PEG-b-PPG-b-PEG(20mg/mL)(Sigma-Aldrich)和NCBS(根据掺杂量为0至0.025mg/mL)。以类似的方式制备了其他SPN，诸如SPN-PFBT、SPN-MEHPP、SPN-MEHCPV、SPN-POPPV、SPN-BOPPV和SPN-MDMOPPV。
对于四苯基卟啉(TPP)-掺杂的SPN-MEHPPV，混合的THF溶液(1mL)含有MEHPPV(0.25mg/mL)(Sigma-Aldrich)、PEG-b-PPG-b-PEG(20mg/mL)(Sigma-Aldrich)和TPP(根据掺杂量为0至0.025mg/mL)。对于NCBS-或TPP-掺杂的SPN-MDMOPPV，混合的THF溶液(1mL)含有MDMOPPV(0.25mg/mL)(Sigma-Aldrich)、PEG-b-PPG-b-PEG(20mg/mL)(Sigma-Aldrich)和NCBS或TPP(根据掺杂量为0至0.025mg/mL)。
对于SPN-硫醇，混合的THF溶液(1mL)由MEHPPV(0.24mg/mL)、NCBS(12.5μg/mL)(Sigma-Aldrich)、C18PEG12-DNBS(0.5mg/mL)(制备6)和DSPE-PEG(0.125mg/mL)(Sigma-Aldrich)构成。在超声处理后，在氮气气氛下于65℃蒸发THF。
通过聚醚砜(PES)注射器驱动的过滤器(0.22μm)(Millipore)对水溶液进行过滤，并使用50K离心过滤单元(Millipore)以3500rpm在4℃下离心15min洗涤三次。SPN-MEHPPV或SPN-NCBS溶液的浓度根据其吸收系数通过UV-Vis吸收来确定。最后，通过超滤将SPN溶液浓缩至0.1mg/mL(基于MEHPPV的质量)，并在～4℃的黑暗环境中存储。SPN的所有浓度均基于SP的质量。
实施例2
筛选用于余辉的半导体聚合物(SP)
基于实施例1中所述的程序，测试了具有不同分子结构的半导体聚合物(SP)，诸如MEHPP(Luminescence Technology Corp.)、POPPV(Luminescence Technology Corp.)、PFBT(Luminescence Technology Corp.)、MEHCPV(Luminescence Technology Corp.)、BOPPV(Luminescence Technology Corp.)、MDMOPPV(Sigma-Aldrich)和MEHPPV(Sigma-Aldrich)，以鉴定有利于余辉发光的结构(图1a)。在存在两亲性三嵌段共聚物(PEG-b-PPG-b-PEG)(Sigma-Aldrich)的情况下，使用纳米沉淀法将七种SP转化为水溶性纳米颗粒(图1b)。通过DLS测量的SPN的流体动力学直径类似，范围为30至40nm(图1c)。透射电子显微镜(TEM)成像进一步证实了球形形态，其平均直径为33.9±4.3nm(图1d)，这与DLS数据几乎相同。纳米颗粒溶液是半透明的(图1e)，即使在储存两个月后也没有沉淀或尺寸变化(图7)，表明在水溶液中具有出色的稳定性。
分别在荧光(有激发)和生物发光(无激发)模式下收集了SPN的荧光信号和余辉信号。仅基于PPV的SPN(诸如SPN-BOPPV、SPN-MDMOPPV和SPN-MEHPPV)(基于实施例1合成)显示出明显的余辉发光(图1e，h)，尽管它们的发光光谱特征与荧光光谱类似(图1f，g)。然而，所有SPN都具有高度荧光性(图1e，f)。SPN-MEHPP(基于实施例1合成)的荧光无法检测到，因为其吸收波长太短，以至于无法被IVIS Spectrum成像系统激发(图8)。仅在基于PPV的SP中看到了余辉信号，表明亚苯基亚乙烯基在这种实时、无激发的发光的产生中起着至关重要的作用。然而，包括SPN-MEHCPV和SPN-POPPV的一些基于PPV的SP(基于实施例1合成)不会发出可检测的余辉发光，表明PPV主链上的取代基也是重要的。对于分散在THF中的SP，观察到了类似的余辉行为(图9)。这证实了SP的化学结构而不是纳米颗粒结构控制SPN余辉。
实施例3
余辉的机理研究
为了确定控制SPN余辉发光的潜在机理，研究了光照射对SP的化学结构的影响。MEHPPV在493nm处的吸收峰显示出显著的蓝移，并且照射后强度降低，表明共轭长度发生断裂并因此MEHPPV(Sigma-Aldrich)分解(图2a)。质子核磁共振(1H NMR)分析显示光照射后在9.88和10.47ppm处出现两个新峰。这些分别分配为醛基峰和羧基峰。峰加宽和分裂是由不同的化学环境引起的，并且表明形成了不均匀的片段。在傅立叶变换红外光谱(FTIR)中在1728cm-1处也检测到了氧化的MEHPPV片段的特征峰。另外，对应于乙烯-1,2-二基基团的3053cm-1处的峰在光照射后减弱了，进一步证明了亚乙烯基键的氧化。对于BOPPV(Luminescence Technology Corp.)和MDMOPPV(Sigma-Aldrich)(图10)也观察到了类似的光谱变化，但其他SP没有显示出明显变化(图11)。这些数据清楚地表明，光照射会氧化一些PPV中的亚乙烯基键，从而将它们分解为非均匀氧化的片段。
接下来，应用单线态氧传感器绿(SOSG)测试光诱导的氧化期间单线态氧(1O2)的产生。在光照射SPN-MEHPPV(基于实施例1合成)溶液5min之后，在528nm处的SOSG的荧光强度增加了1.69倍(图2c)。这证明在照射期间产生了1O2，并造成了MEHPPV的氧化。根据这些结果，基于PPV的SPN的余辉发光的拟定机理如图2f所示。PPV的光照射产生1O2，其通过π2-π2环加成来氧化亚乙烯基键(C＝C)以形成PPV-二氧杂环丁烷中间体。该中间体不稳定[例如，参见Scurlock,R.D.,et al.,J Am Chem Soc117,10194-10202(1995)]，并且可以自发地降解为PPV-醛并产生光子。PPV-醛的进一步氧化产生PPV-羧基作为光照射反应的最终产物。因此，余辉发光中的关键步骤是1O2诱导的PPV-二氧杂环丁烷的形成，这是由PPV中乙烯基键的氧化敏感性决定的。这解释了为什么并非所有基于PPV的SPN都具有余辉以及取代基的作用。实际上，只有具有供电子取代基(烷氧基基团)的PPV(诸如BOPPV、MDMOPPV和MEHPPV)(根据实施例1合成)才会显示出可检测的余辉发光，而具有弱供电子取代基(对于POPPV为烷基基团)(根据实施例1合成)或强吸电子取代基(对于MEHCPV为氰基基团)(基于实施例1合成)的衍生物不具有可检测的余辉发光。
在生物学相关条件下(37℃下pH＝7.4)，基于PPV的SPN的余辉发光是持久的，具有的半衰期为6.6min(图2c)。余辉条件可以通过改变诸如温度和氧气水平的反应条件以及添加1O2清除剂来控制。通过调控第一预光照射步骤(图2e)，当在O2-和N2-饱和的溶液中测量时，SPN-MEHPPV的余辉(基于实施例1合成)可以分别增加1.25倍或减少2.82倍。此外，添加1O2清除剂(NaN3)可以使余辉强度降低2.06倍。通过调控第二分解步骤(图2e)，在将温度从37℃升高到60℃时，余辉强度可以提高5倍。然而，在0℃时，余辉几乎被完全抑制(图12)。对于SPN-MDMOPPV和SPN-BOPPV(基于实施例1合成)观察到了类似的余辉行为(图12)。综上所述，这些数据不仅进一步验证了拟定的余辉机理，而且还突出了1O2物类在确定SPN的余辉亮度中的重要作用。
尽管控制基于PPV的SPN的余辉发光的机理类似于化学发光[例如，参见Dodeigne,C.,et al.,Talanta51,415-439(2000)]，但是它不需要外源ROS来触发反应。相反，SPN本身可以在光照射下生成1O2，并随后引发余辉发光。这种余辉机理也不同于稀土掺杂的无机纳米颗粒的机理，在稀土掺杂的无机纳米颗粒中，吸收的光子能量存储在固有缺陷晶格中而不是光诱导的化学缺陷中[例如，参见Maldiney,T.,et al.,J Am Chem Soc133,11810-11815(2011)]。
实施例4
余辉的优化
700至2,500nm范围的NIR光比可见光更有效地穿透生物组织，这是因为该区域中组织散射减少且生物自发荧光最小[例如，参见Smith,A.M.,et al.,Nat Nanotechnol4,710-711(2009)]。为了将余辉和红移放大到理想的NIR光学成像窗口中，通过纳米沉淀法将1O2敏化剂、2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷(NCBS)掺杂到SPN-MEHPPV(根据实施例1合成)中(图3a和图37b)。因为NCBS可以在NIR区域中吸收(图13a)，所以它通过在808nm处预照射而引发余辉。因此，根据实施例1中SPN-NCBS的合成，制备了具有不同重量百分比的NCBS(1、2.5、5和10w/w％)的SPN，并分别将其称为SPN-NCBS1、SPN-NCBS2.5、SPN-NCBS5和SPN-NCBS10。掺杂对SPN的尺寸和形态没有明显影响(图14)。580nm处的MEHPPV(基于实施例1合成)荧光随掺杂浓度的增加而逐渐降低，伴随775nm处NCBS发射逐渐增加(图3d，f和图15)。这种光谱变化证实了从MEHPPV到NCBS的有效能量转移。饱和在5％处出现，并且掺杂浓度的进一步增加降低了NCBS的发射(图15)，这是由于纳米颗粒内局部浓度升高时NCBS的自淬灭。
不论预照射激光波长(808或514nm)如何，随着掺杂浓度的增加，590和775nm处的余辉强度都持续增加(图3c，e，f)。图16示出了激光照射条件的优化结果。信号定量表明，当将最佳SPN(SPN-NCBS5)与非掺杂对照SPN(SPN-MEHPPV)(基于实施例1合成)进行比较时，通过在514nm预照射诱发的绝对余辉强度增加了6.8倍(图3f)。此外，在相同功率密度下，相比514nm，以808nm的SPN-NCBS5的余辉可以进一步增强11倍(图3b，c，e，f)。这归因于NCBS相对于MEHPPV具有更强的产生1O2的能力(图17)。对于仅由NCBS5组成的纳米颗粒，未检测到余辉(图15c)。对于四苯基卟啉(TPP)-掺杂的SPN-MEHPPV和NCBS-或TPP-掺杂的SPN-MDMOPPV(如实施例1所述合成)，还观察到了1O2敏化剂放大的余辉(图18和图19)。这些数据表明1O2敏化剂是颗粒内促进剂，可有效放大SPN的余辉并调节其发射波长。
实施例5
SPN-NCBS5的体内和体外评价
接下来，根据生物学试验部分中的方案对SPN-NCBS5进行体内和体外评价。基于SPN-NCBS5(在实施例4中合成)的良好细胞相容性(图20)，放大的余辉纳米颗粒(SPN-NCBS5)适用于生物学应用。
余辉的组织穿透研究
在体外和体内均检查了SPN-NCBS5(在实施例4中合成)的余辉的穿透深度和成像灵敏度。由于SPN-NCBS5具有NIR区域中的吸收和发射(图13和图15)，因此在710nm处激发后，在780nm处采集荧光信号(图13b)；余辉是通过在808nm处预照射引起的。
接下来，将厚度增加的鸡组织放在样品的顶部。余辉和荧光两者的信号均随穿透深度的增加而降低(图4a，b)。然而，由于与荧光(2.53×107±1.76×106p/s/cm2/sr)相比余辉(824±109p/s/cm2/sr)的背景噪声很低，因此当厚度为1.5cm时，余辉的SBR(291±18)是荧光(4.33±0.96)的67倍高。此外，当厚度为4cm时，NIR荧光接近背景噪声，而余辉的SBR仍为17.7±0.27。类似地，活体小鼠的余辉发光成像的背景低至867±80p/s/cm2/sr，因为在不存在实时激发的情况下消除了组织自发荧光。因此，当通过活体小鼠检测NIR-诱发的来自深度为1.7cm的SPN-NCBS5的余辉信号时(图4c–e)，SBR达到237±22，分别是可见光诱发的余辉(50.7±4.5)和NIR荧光(1.98±0.09)的4.7倍高和120倍高。重要的是，余辉可以通过在808nm处原位照射透过鸡组织或活体小鼠而重复加载(图21和22)，这证实了长期体内成像的可行性。
在活体小鼠中皮下植入的SPN-NCBS5(在实施例4中合成)的余辉信号与其浓度呈线性相关(图23c)。由于余辉的SBR较高，活体小鼠中SPN-NCBS5的检出限(LOD)为1.35ng/mL(图23c)，这比NIR荧光的检测限低80倍(图23d)。此外，在预照射后，SPN-NCBS5的余辉可以在-20℃下保存，并且在储存一天后强度仅下降了3.8％(图24)。这表明了在无需任何光学预处理的情况下，使用直接来自存储中的预照射的余辉SPN进行体内成像的可行性。
淋巴结和肿瘤的余辉成像
放大的SPN(SPN-NCBS5)(在实施例4中合成)的可存储和NIR-可再生的余辉用于实时定位活体小鼠的淋巴结(图5a)，并按照生物学试验部分中的方案。淋巴结定位在指导肿瘤组织的手术切除中具有重要的临床意义[例如，参见Kim,S.,et al.,Nat Biotechnol22,93-97(2004)]，但是先前尚未使用余辉成像来完成。将预照射的SPN-NCBS5在-20℃下储存一天，温热至室温，并然后直接注射到活体小鼠的前爪中进行连续成像，而无需重新照射。在注射后t＝30min，采集余辉和荧光图像。用余辉和荧光成像两者清楚地描绘了腋窝淋巴结(图25)，表明了前哨淋巴结中SPN-NCBS5的有效积聚和保留。尽管在活体小鼠中37℃下30min后余辉有所衰减(图26a)，但余辉图像的SBR仍为7.8±1.2，是荧光图像(3.9±0.3)的两倍高(图5c)。在注射后t＝65min，通过在808nm处照射1min从而原位余辉再生后，余辉图像的SBR基本上增加到419±32：荧光的127倍高(图5b，c)。因此，SPN-NCBS5的NIR余辉可以定位具有高对比度的淋巴结，并且在成像期间无需实时激发。
还在活体小鼠中肿瘤的被动靶向成像方面对SPN-NCBS5的余辉发光进行了测试，并与NIR荧光进行比较。尾静脉注射SPN-NCBS5之后，实时采集余辉信号和NIR荧光信号。两种信号均随时间逐渐增加，但是在所有时间点余辉图像的SBR均高于NIR荧光(图5d，e，f)。由于余辉的背景较低，因此对于余辉成像，肿瘤在注射后t＝1h可见，并且在注射后t＝2h清晰可见(图5e)。相比之下，对于NIR荧光成像，肿瘤只能在注射后t＝8h才可见。在t＝2h时，余辉图像的SBR为149.7±9.0，是NIR荧光图像(6.4±0.9)的23.3倍高(图5f)。在注射后t＝36h，余辉信号和荧光信号均达到平稳状态，表明SPN-NCBS5在肿瘤中有效积聚。离体数据进一步表明，SPN-NCBS5在肝脏中的摄取最高，其次是肿瘤、肺和其他主要器官(图27)。因此，与NIR荧光成像相比，SPN-NCBS5的余辉允许在活体小鼠中对肿瘤进行更快、更高对比度的成像。此外，SPN-NCBS5的超灵敏NIR余辉允许在2h内更快地描绘肿瘤，这对于NIR荧光成像是不可能的。SPN-NCBS5具有780nm的发射且半衰期为396s。具有如此强的NIR余辉，使得在12.5μg/mL的浓度下，活体小鼠中皮下植入的SPN-NCBS5的SBR可以达到3387±39。由于这样的高SBR，余辉SPN允许在以比其他现有余辉剂(每只小鼠200至1000μg)低得多的剂量(每只小鼠50μg)系统性给药之后进行体内肿瘤成像，同时仍然提供较高的SBR(图5)。
可激活余辉探针用于药物诱导的肝毒性的成像
药物诱导的肝毒性是现代医学长期关注的问题[例如，参见Nasr,A.,et al.,Adv.Ther.28,842-856(2011)]，并且是食品与药品监督管理局(FDA)拒绝批准药物的最常见原因之一[例如，参见Kola,I.&Landis,J.Nat Rev Drug Discov3,711-715(2004)]。在监管批准之前评价潜在的肝毒性是具有挑战性的，因为当前的安全检测仅适用于体外研究，并且具有较低的预测能力[例如，参见Willmann,J.K.,et al.,Nat Rev Drug Discov7,591-607(2008)]。肝脏中的氧化应激和抗氧化剂的消耗是肝毒性中的并发早期事件[例如，参见Pessayre,D.,et al.,Handb.Exp.Pharmacol.,311-365(2010)]。在活生物体中的抗氧化剂之中，包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的生物硫醇构成了抵抗氧化应激的全身抗氧化剂的主要部分。因此，生物硫醇水平的实时原位成像可能是评价药物诱导的肝毒性的可行方法。
为了开发用于生物硫醇成像的可激活余辉探针，根据实施例1，合成了与吸电子淬灭剂(C18PEG12-DNBS)(制备6)缀合的两亲性低聚物，并与NCBS和MEHPPV共沉淀(图6a)。所得的可激活纳米探针(SPN-硫醇)具有与其他SPN类似的尺寸和形态(图28)。由于从核到淬灭剂的有效电子转移，SPN-硫醇的余辉在其初始“余辉关闭”状态下基本被淬灭(图6a)。然而，在存在生物硫醇(包括GSH、Cys和Hcy)的情况下，SPN-硫醇表面上的磺酰胺键可被断裂，从而从纳米颗粒表面释放DNBS。因此，电子转移被消除，导致余辉激活(“余辉开启”状态)。在通过Cys激活后，在780nm处SPN-硫醇的余辉增加了8.3倍(图6b)。这分别是GSH和Hcy的1.75倍高和1.41倍高。相反，对于其他氨基酸，依然几乎无法检测到信号(图6c，d)。这表明SPN-硫醇对生物硫醇特别是Cys具有高选择性。对于SPN-硫醇的荧光观察到类似的激活(图29)。另外，观察到余辉强度与Cys浓度之间存在线性关系，其检出限(LOD)为0.60μM(图6e)，这对于生物硫醇的体内生物浓度(～0.1至10mM)是足够有余的。
SPN-硫醇(基于实施例1合成)用于药物诱导的肝毒性的体内成像(图6f)，并按照生物学试验部分中的方案。对乙酰氨基酚(APAP)是一种解热镇痛药物，并且由于APAP诱导的肝毒性的机理已得到很好的确立而被用作模型药物。过量的APAP会引起氧化应激和亚硝化应激，并且进而耗尽生物硫醇，从而引发信号级联，导致坏死性细胞死亡。首先用毒性剂量水平的APAP或生理盐水处理小鼠，并然后在APAP处理后t＝20min通过静脉注射系统性给药SPN-硫醇。余辉和荧光信号是实时采集的，并且它们随着时间逐渐增加(图6h)。在SPN-硫醇注射后t＝2h，由于肝脏中生物硫醇的水平降低，因而APAP处理的小鼠的余辉比生理盐水处理的对照小鼠低1.99倍(图6g)。相比之下，当在APAP处理之前用N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC，FDA批准的抗氧化药物)对小鼠进行保护时，余辉信号与盐水处理的对照小鼠的余辉信号相当。这是由于NAC具有有效清除ROS的能力，维持了肝脏中抗氧化剂的水平。组织学研究进一步显示，在APAP处理3h之后，肝脏出现大量肝坏死，而在盐水处理的对照小鼠或NAC保护的小鼠中未发现肝损伤(图32)。APAP处理后余辉强度减弱以及NAC修复后余辉强度增加证实了SPN-硫醇可用于体内肝毒性的纵向成像。另外，在所有时间间隔，余辉的SBR比值都是NIR荧光的～25倍高(图6h)，表明对于药物诱导的肝毒性，余辉成像具有更高的敏感性。
SPN的结构多变性还促进了用于活体小鼠中药物诱导的肝毒性的智能可激活余辉探针(SPN-硫醇)的开发(图6)。这是余辉体系响应于体内感兴趣分子而改变信号强度的首次证明。现有的余辉纳米颗粒仅用于被动或主动肿瘤靶向。生物硫醇可激活探针(SPN-硫醇)在780nm处的NIR余辉可以被诸如Cys、Hcy和GSH的生物硫醇充分激活。由于这些生物硫醇是抗氧化应激的重要抗氧化剂，因此SPN-硫醇可以检测活体小鼠肝脏中的抗氧化剂水平，并因此能够对药物诱导的肝毒性和修复进行实时余辉发光成像，其SBR水平是NIR荧光成像的25倍高。更重要的是，SPN-硫醇可以在药物攻击的20min内检测到肝毒性，这比观察肝脏中的组织学变化(～3h)要短得多[例如，参见Shuhendler,A.J.,et al.,NatBiotechnol32,373-380(2014)]。
实施例6
SPN的生物降解性和生物相容性
余辉SPN可通过酶降解。如图33所示，SPN-NCBS5(在实施例4中合成)的降解可以由活体动物中的免疫细胞(诸如中性粒细胞)产生的H2O2和MPO催化。在与H2O2和MPO一起温育后，MEHPPV的亚乙烯基键(基于实施例1合成)被切断，导致PPV-醛片段的形成。通过纳米颗粒的吸光度、荧光和余辉强度的降低以及分子量的显著降低确认了降解。
图31中的离体生物分布数据显示，肝脏中余辉SPN的积聚更高，因为它们的尺寸(～33nm)大于5nm。因此，余辉SPN主要经过肝脏清除。如图34所示，SPN-NCBS5(基于实施例4合成)在肝脏中的酶促降解历时超过18天，最终导致几乎完全清除。
通过组织学分析评价余辉SPN的毒性。如图35所示，与对照相比，对于来自SPN-NCBS5(在实施例4中合成)处理的小鼠的器官，未观察到组织病理学改变。
实施例7
两亲性PPV衍生物的合成和表征
为了使PPV具有良好的水溶性，PPV被设计成具有PEG作为接枝链(图36)。首先，将4-甲氧基苯酚分别与1,10-二溴癸烷(Sigma-Aldrich)和2-乙基己基溴(Sigma-Aldrich)反应，以得到化合物2(制备2)和化合物3(制备2)。然后将化合物2和3用多聚甲醛和HBr处理，以分别得到化合物4(制备4)和化合物5(制备5)。然后在叔丁醇钾的存在下使化合物4聚合，以得到在侧链上具有溴化物基团的PPV聚合物(PPV-Br1)(制备7)。为了合成具有较低PEG接枝密度的PPV，将化合物4和5共聚，并且化合物4与5的摩尔比为8至1，以产生PPV-BrL(制备7)。然后，使这些溴化物PPV与叠氮化钠反应，以用叠氮化物取代溴化物，得到PPV-N31和PPV-N3L(制备8)。通过质子核磁共振(1H NMR)光谱(数据未示出)确认溴化物向叠氮化物的转化，其表明对于PPV-N31和PPV-N3L两者，-CH2Br的共振峰(对于PPV-Br1为3.40ppm，对于PPV-BrL为3.39ppm)转变为-CH2N3的共振峰(对于PPV-N31为3.24ppm，对于PPV-N3L为3.23ppm)。
通过使用铜(I)-催化的炔-叠氮化物环加成(CuAAC)反应制备了PPV-PEG1和PPV-PEGL。将PPV-N31或PPV-N3L(2mg)(制备8)溶解于THF(3mL)中，然后添加溴化铜(I)(对于PPV-N31或PPV-N3L的叠氮基团为2当量)、PEG-炔(对于PPV-N31或PPV-N3L的叠氮基团为2当量)(制备1)和N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)(对于PPV-N31或PPV-N3L的叠氮基团为8当量)(Sigma-Aldrich)。在室温下于氮气气氛下进行反应48h。将水加入混合物中，并将所得溶液用纯水透析以去除任何杂质和过量的PEG-炔。冻干之后获得PPV-PEG1或PPV-PEGL。PPV-PEG1：1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：7.50，7.12，4.56，4.18，3.86，3.62，3.54，3.38，3.36，1.42-1.07，0.92-0.69。PPV-PEGL：1H NMR(300MHz,CDCl3,δ)：7.54，7.19，5.34，4.67，4.14-3.79，3.65，3.57，3.38，1.68，1.45-1.11，1.09-0.66。
凝胶渗透色谱(GPC)显示，PPV-PEG1和PPV-PEGL两者具有的分子量均高于它们对应的前体(PPV-Br1和PPV-BrL)，从而证实了PEG接枝到了PPV骨架上(表1)。
表1.PPV聚合物的GPC
样品名称 Mn(g/mol) Mw(g/mol) PDI
PPV-Br1 32773 61613 1.88
PPV-BrL 16469 43478 2.64
PPV-PEG1 59781 120160 2.01
PPV-PEGL 26565 78367 2.95
由于其两亲性性质，PPV-PEG1可以直接溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中并自组装成小的纳米颗粒。研究了PPV的光学性质和余辉机理(图42和图43)。PPV-PEG1表现出强烈的余辉发光，并且其光谱与最大发射位于580nm的荧光光谱几乎相同(图42c)。余辉发光的潜在机理(图42f)与先前报道的纳米颗粒相同：光照射后从PPV中产生的单线态氧(1O2)可以与亚乙烯基键反应以形成在降解时会产生光子的二氧杂环丁烷单元(如实施例3中讨论的)。为了将余辉发光放大并红移到NIR区域，将1O2敏化剂、2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷(NCBS)掺杂到PPV-PEG1中(图44)。然而，荧光光谱和DLS结果表明从PPV片段到NCBS的荧光共振能量转移(FRET)较差，并且包封效率低，这应该归因于PEG对PPV-PEG1的高接枝密度。
为了更好地包封NCBS，使用相对于PPV-PEG1具有较低PEG接枝密度的PPV-PEGL制备NCBS掺杂的纳米颗粒(图37a)。根据实施例1中SPN-NCBS的合成，在两亲性三嵌段共聚物(PEG-b-PPG-b-PEG)存在的情况下，通过MEHPPV(Sigma-Aldrich)和NCBS(相对于MEHPPV为2w/w％)的纳米沉淀法制备PPVP(图3a)。通过纳米沉淀法制备SPPVN和SPPVT。简要地，将PPV-PEGL(20mg)、NCBS或TPP(相对于PPV片段为2w/w％)溶解于THF(1mL)中。在用超声仪在110W下剧烈超声处理1min的条件下，将溶液快速注射到THF(1mL)和水(9mL)的混合物中。在温和的氮气流下去除所得溶液中的THF，并通过0.22μm PVDF注射器驱动的过滤器进行过滤来纯化所得溶液。通过超滤对制备的SPPVN(2w/w％NCBS)或SPPVT(2w/w％TPP)溶液进行浓缩，并在4℃下储存供后续使用。
DLS结果、UV和荧光光谱显示成功地包封了NCBS，以及从PPV片段到NCBS的有效FRET(图45a，45b和45c)。NCBS掺杂的纳米颗粒的余辉光谱图与荧光光谱图类似(图45d)。特别地，在所有测试的纳米颗粒中，SPPVN具有最高的余辉发光强度(图45e)。在室温下，在1×PBS缓冲液中SPPVN的余辉发光持久，半衰期为4.8min(图45f)。此外，通过在808nm预照射所诱发的SPPVN的余辉强度是通过514nm预照射所诱发的余辉强度的8倍，因为在808nm照射后从NCBS中可以产生更多的1O2(2.6倍)(图46)。当使用另一种光敏剂TPP时，检测到类似的放大的余辉现象(图47)。与SPPVT相比，SPPVN具有更长的发射波长(780与660nm)和更高的能量传递效率(51％与37％)，以及更高的相比未掺杂纳米颗粒的余辉强度增强(20与1.8倍)。选择具有2w/w％NCBS的SPPVN用于进一步研究。
实施例8
比较SPPVN与PPVP的性质
将SPPVN(在实施例7中合成)与PPVP(基于实施例1以及图3a和图37b中的示意图合成)的性质进行比较。SPPVN具有的流体动力学尺寸远小于PPVP(24与34nm)(图37c)。SPPVN和PPVP具有类似的UV吸收光谱，在～500和775nm处有两个最大峰，分别对应于PPV和NCBS的吸收(图37d)。SPPVN和PPVP两者在775nm处的NCBS荧光均比在590nm处的PPV片段的荧光更强。然而，SPPVN在780nm处的发射强度与在590nm处的发射强度的比值是PPVP的2.1倍高，表明SPPVN的FRET效率比PPVP更高(51与24％)(图37e)。在相同的质量浓度下，SPPVN和PPVP的余辉发光光谱与它们的荧光光谱类似，但是SPPVN的余辉强度是PPVP的余辉强度的1.3倍高(图37f)。这种FRET改善和余辉增强可以归因于SPPVN中PPV片段与NCBS之间的接触比PPVP中的更紧密。结果还表明，SPPVN具有出色的生理学稳定性(图48a)和细胞相容性(图48b)。
实施例9
SPPVN、PPVP和PPV-PEGL的体内评价
接下来，根据生物学试验部分中的方案，通过体内成像实验评价了SPPVN(在实施例7中合成)、PPVP(在实施例1中合成)和PPV-PEGL(在实施例7中合成)。
组织穿透研究
通过在活体小鼠中以1.6cm的深度检测SPPVN溶液，比较了余辉成像和NIR荧光成像的组织穿透能力(图38a)。在710nm处激发下，在780nm处采集荧光信号，而在514或808nm处预照射1min之后，在生物发光模式下采集余辉发光信号，由于强烈的组织自发荧光(2.06×107±1.90×106p/s/cm2/sr)，SPPVN溶液的荧光信号与背景信号几乎没有区别(图38a)。相反，由于消除了实时光激发，余辉成像的背景信号非常低(2900±420p/s/cm2/sr)。因此，余辉信号在514和808nm两者处的预照射下均可清晰检测。在808nm处预照射诱发的余辉成像的SBR为404±63(图38b)，这分别是由514nm处预照射诱发的余辉成像(80.4±12.5)和NIR荧光成像(1.3±0.2)的～5.0倍和～304倍。这些结果表明，相对于NIR荧光成像，余辉成像具有显著更高的穿透深度和成像灵敏度。
由于活体小鼠中环境温度较高，因此SPPVN的余辉发光在体内的衰减快于体外(图49a与45f)。尽管如此，通过在808nm处预照射可以在活体小鼠中重复诱发SPPVN的余辉至少6次，而余辉强度没有明显降低(图49b)。这证明其可用于长期体内成像。SPPVN具有780nm的长NIR发射和288s的半衰期。此外，皮下注射的SPPVN的体内余辉强度(1.36×105(p/s/cm2/sr)/(μg/mL))是无机持久性纳米颗粒(诸如ZnGa2O4:Cr3+纳米颗粒)的27.2倍高(图49c)。以130μg/mL(4170±179)皮下注射的SPPVN的SBR可以是甚至在更高浓度(2mg/mL)下测试的ZnGa2O4:Cr3+纳米颗粒(275)的15.2倍高。[例如，参见Li,Z.J.,et al.,J Am Chem Soc137,5304-5307(2015)]。
淋巴结成像研究
在活体小鼠的前爪中注射后，测试SPPVN用于淋巴结成像的效用(图38c)。在注射后t＝60min时，采集NIR荧光图像和余辉发光图像。用余辉成像和荧光成像两者均描绘了腋窝淋巴结。仅余辉成像示出了淋巴结的低背景图像(图38h)。成像定量显示，余辉成像的SBR(622±104)是荧光成像的SBR(15±3)的41倍高(图38i)。这些结果表明，与NIR荧光成像相比，使用SPPVN的余辉成像允许以高得多的对比度定位淋巴结。
用于区分缺氧和常氧环境的体内成像
大多数肿瘤细胞处于缺氧环境，这是由于血管生长和细胞增殖所需的快速氧消耗所致[例如，参见Carmeliet P.and Jain R.K.Nature.473,298-307(2011)]。肿瘤缺氧还与浸润和转移风险的增加有关。因此，对肿瘤缺氧的成像可有助于癌症的诊断和治疗。由于余辉对氧敏感，因而体内测试了SPPVN区分缺氧和常氧的能力(图42e)。首先用N2吹扫SPPVN溶液以去除残留的氧，并然后将其局部注射到肿瘤中或皮肤下(图38e)。局部注射的肿瘤和皮肤的荧光强度几乎相同(图38e)。相反，局部注射的皮肤的余辉强度是肿瘤的余辉强度的2.4倍高(图38e和38f)。余辉强度的这种差异是由于肿瘤的缺氧环境引起的，该环境具有的低氧水平降低了SPPVN的余辉强度。因此，这些结果表明，SPPVN的氧敏感性余辉可用于监测缺氧和常氧。
将SPPVN的余辉发光应用于体内肿瘤成像与PPVP进行比较。注射前，SPPVN和PPVP两者均暴露在空气中。为了测试早期检测的能力，对携带尺寸仅为～5mm3的异种移植肿瘤的活体小鼠进行成像实验。在通过尾静脉注射系统性给药纳米颗粒之后，纵向地采集荧光信号和余辉信号。对于SPPVN和PPVP两者，余辉信号和荧光信号逐渐增加并在注射后24h达到饱和，但是在每个时间点余辉成像图像均具有比荧光图像更高的SBR(图39a，39b和39c)。在24h，注射SPPVN的小鼠的余辉成像中的SBR为306±20，是NIR荧光成像中的SBR(28±1)的11倍高(图39c)。由于如此高的SBR，最早至SPPVN注射后40min即可通过余辉成像检测到肿瘤；相比之下，只能在注射后4h才可检测到荧光(图39a)。对于PPVP注射的小鼠，对于余辉成像和荧光成像只能分别在注射后t＝4和8h可视化肿瘤(图39b)。在纳米颗粒注射后t＝40min，SPPVN注射的小鼠的余辉成像的SBR为40±3，是NIR荧光成像的SBR(1.8±0.2)的～22倍高，并且是PPVP的余辉成像(15.7±1.5)的～2.5倍高(图39c)。由于SPPVN的高灵敏度，其余辉允许在注射后4h以63±10的SBR对尺寸小至约～1mm3的肿瘤进行检测。这对于NIR荧光成像，只能在注射后24h才有可能进行(图50)。应注意，对于不同的肿瘤尺寸(5和1mm3)，在每个时间点，来自SPPVN注射的荷瘤小鼠的肝脏的实时荧光和余辉发光信号几乎相同(图51)。这证实了肿瘤尺寸不影响纳米颗粒的生物分布。此外，SPPVN检测的肿瘤尺寸(1mm3)比其他已报道的NIR荧光成像探针(50至500mm3)小得多[例如，参见Li Y.,et al.,Nat.Commun.5,4712(2014；Yang K.,et al.,Adv.Mater.24,1868-1872(2012)]。
体内腹膜转移性肿瘤成像
为了确定SPPVN相对于PPVP更快地描绘肿瘤的原因，研究了离体生物分布和体外多细胞肿瘤球体(MCTS)摄取。与PPVP在肝脏中摄取最高不同，SPPVN在肿瘤中具有最高摄取，是肝脏中的1.4倍高(图39d和3e，图52)，这可以归因于与PPVP的二元胶束结构相比，SPPVN具有更稳定的不可分离纳米结构。计算出SPPVN的纳米颗粒的PEG密度是PPVP的～1.7倍高(0.30与0.18/nm2)，根据文献报道，这应该是SPPVN具有更好的生物分布的另一原因[例如，参见Du X.,et al.,Biomaterials69,1-11(2015)]。此外，MCTS摄取研究表明，在相同的温育时间后，SPPVN具有比PPVP更高的摄取(1.8-倍)和更深的穿透(图53)，这可能是由于它的尺寸相对于PPVP较小(24与34nm)。这些数据表明，除了SPPVN相对于PPVP具有更高的余辉之外，SPPVN相对于PPVP具有更好的生物分布和更深的穿透能力也应是系统给药之后更快地检测活体小鼠中的肿瘤的原因。
为了测试在检测转移性肿瘤组织中SPPVN优于PPVP的效用，对携带腹膜转移性4T1肿瘤的小鼠进行成像实验。将4T1癌细胞(2×105)腹腔注射到小鼠中，以建立转移性肿瘤模型。将小鼠随机分成两组，并在注射4T1细胞后仅3天通过尾静脉用SPPVN或PPVP进行处理(图40a)。在通过尾静脉注射系统性给药SPPVN或PPVP之后采集荧光和余辉图像。对于SPPVN注射的小鼠，下象限区域(肝脏除外)中的余辉信号逐渐增加，但在PPVP注射的小鼠中没有，表明肿瘤组织中SPPVN的积聚明显更强(图40b)。在注射后t＝1.5h，切除小鼠的皮肤和腹膜，并对小鼠的下象限区域进行成像。对于SPPVN和PPVP注射的小鼠两者，只能在下部象限区域中检测到自发荧光。相反，对于SPPVN注射的小鼠，在肠道上可以检测到强的余辉斑点，而对于PPVP注射的小鼠则不能(图40c)。余辉信号的定量表明，对于SPPVN注射的小鼠，肿瘤区域的余辉强度是背景信号的6.1倍高；而对于PPVP注射的小鼠，其信号与背景信号没有统计学显著差异(图40d)。通过组织学检查证实了肉眼看不见的在肠道表面上微小转移瘤的形成(图40e和图54)。这些结果表明，相对于PPVP，SPPVN对微小腹膜转移性肿瘤组织的检测更快。
生物降解性研究
在体内模拟条件下研究了溶液和细胞中PPV-PEGL的生物降解性(图41a)。可以在免疫细胞中产生的髓过氧化物酶(MPO)和H2O2[例如，参见Klebanoff S.J.,J.Leukoc.Biol.77,598-625(2005)]用于模拟生理条件，且MPO的使用浓度(40μg/mL)在根据以往文献计算的生理浓度范围(35.4–82.6μg/mL)内[例如，参见Christensen R.D.andRothstein G.,Pediatr.Res.19,1278-1282(1985)]。PPV-PEGL与MPO和H2O2一起温育导致吸收逐渐减少和蓝移(图41b)。这证实了双键的酶促氧化和PPV-PEGL降解成小片段。然后，将PPV-PEGL与脂多糖(LPS)激活的巨噬细胞RAW264.7细胞一起温育不同的时间，以研究细胞内的生物降解性。随着温育时间的增加，细胞中PPV-PEGL的荧光逐渐减小(图41c)。在12h时，荧光是没有刺激的细胞的荧光的2.3倍低。这些数据表明，PPV-PEGL在生物相关条件下是可降解的。
为了研究SPPVN的体内清除，将SPPVN通过尾静脉系统性给药至活体小鼠中，并记录不同时间点处的荧光图像。在静脉注射后，SPPVN逐渐积聚到肝脏中，并在注射后1天在肝脏中达到最高积聚(图41d和图55)。然后，肝脏中的荧光信号逐渐降低，并且在注射后20天，几乎无法检测到信号。这些结果表明，在活体小鼠中，SPPVN可以在肝脏中降解并通过肝胆排泄而在20天内被清除。
实施例10
SPN-PPV-TPP的合成与表征。
将1,4-二溴-2,5-双((2-乙基己基)氧基)苯(制备8)与反式-1,2-双(三丁基锡)乙烯和不同摩尔比的7,18-二溴-5,10,15,20-四苯基卟啉(TPP-Br)通过Pd催化的Stille偶联反应进行共聚，以生成PPV、PPV-TPP2.5％和PPV-TPP5％(图56a)(制备10)。通过GPC进一步表征了PPV-TPP的分子量和多分散性(PDI)，并且PPV聚合物的分子量在8900至13000的范围内(表2)。
将PPV-TPP(1mg)溶解于1mL的THF中。然后在存在0.75mL两亲性三嵌段共聚物((PEG-b-PPG-b-PEG)(20mg)的THF溶液的情况下，使用纳米沉淀法将PPV、PPV-TPP2.5％和PPV-TPP5％(0.25mL)转化为水溶性纳米颗粒(SPN0、SPN2.5和SPN5)(图56b)。在连续超声处理下，将获得的溶液快速注射到DI水(9mL)和THF(1mL)的混合物中。通过温和的氮气流去除THF。通过0.22μm聚偏二氟乙烯注射器驱动的过滤器(Millipore)过滤来纯化所得溶液。将获得的纳米颗粒溶液通过超滤进行浓缩，并然后用1×PBS(pH＝7.4)稀释以制备不同浓度的溶液。
表2.PPV聚合物的GPC数据
样品名称 M<sub>n</sub>(g/mol) M<sub>w</sub>(g/mol) PDI
PPV 8947 12613 1.4
PPV-TPP<sub>2.5％</sub> 11469 14478 1.26
PPV-TPP<sub>5％</sub> 12781 17016 1.33
DLS显示SPN0、SPN2.5和SPN5的平均流体动力学直径类似，范围为25至30nm(图56c和图60)。以SPN2.5为例，TEM成像显示出均匀的球形形态，其平均直径为～25nm，与DLS数据一致(图56d)。对于SPN2.5，在PBS(pH＝7.4)或FBS中储存20天后，没有观察到沉淀或明显的尺寸变化(图61)。MTS分析(如生物学试验部分描述的)表明SPN2.5对4T1细胞无细胞毒性(图56e)。这些结果表明，这些SPN-PPV-TPP对于生物学应用具有理想的水稳定性和细胞相容性。
在PBS(pH＝7.4)溶液中测试了SPN-PPV-TPP的光学性质。UV-Vis光谱显示，所有SPN-PPV-TPP具有在430至450nm范围内的相似最大吸收，对应于PPV片段(图57a)。随着TPP量的增加，在600至700nm范围内出现了新的吸收带，该吸收带被分配给含有TPP的片段。这种吸收变化证实了TPP被掺入PPV-TPP骨架。不含TPP的纳米颗粒(SPN0)的荧光具有最大在580nm处的明显发射。随着TPP量的增加，PPV片段在580nm处的荧光降低，同时650nm至750nm范围内的NIR发射增加(图57b)，并且在TPP量为2.5％(SPN2.5)时出现饱和。这证实了从PPV片段到TPP的FRET的发生。与SPN2.5相比，SPN5示出了650nm至750nm的发射降低，这可能是由于较高量的TPP引起了局部荧光淬灭。通过IVIS捕获的720nm处SPN-PPV-TPP的荧光图像也证实了这一现象，表明这些纳米颗粒中SPN2.5的荧光强度最高(图57d)。SPN-PPV-TPP的余辉光谱和图像是在生物发光模式下(无实时激发)光照射之后收集的(图57c和57e)，显示出余辉光谱类似于它们的荧光光谱。
实施例11
SPN-PPV-TPP的余辉机理研究
与实施例3类似，使用1O2传感器绿(SOSG)测试光照射期间1O2的生成。在光照射4min之后，在存在SPN0、SPN2.5和SPN5(基于实施例10合成)的情况下，在528nm处SOSG的荧光强度相对于光照射之前分别增加了6.44、7.78和9.96倍(图62)。该数据证明，TPP的量越高，在光照射期间产生的1O2越多。此外，当在O2饱和条件下测量时，SPN2.5的余辉强度可以提高1.90倍，而当在N2饱和条件下测量时可以降低4.06倍(图63)。加入1O2清除剂(NaN3)可以使余辉强度降低1.58倍。因此，在光照射下产生的单线态氧(1O2)氧化了PPV的亚乙烯基键，形成了不稳定的PPV-二氧杂环丁烷中间体，该中间体在降解时会产生光子。定量数据进一步表明，SPN2.5的余辉强度分别是SPN0和SPN5的余辉强度的～6.12和～2.14倍，这与它们在720nm处的荧光强度一致(图57e)。另外，在室温下SPN2.5的余辉发光半衰期为5min(图57f)，对于成像采集足够长。这些数据表明，将TPP掺入PPV的骨架中可以放大并红移其余辉信号。选择SPN2.5用于体内成像实验，因为它在SPN-PPV-TPP中具有最亮的余辉强度。
实施例12
SPN-PPV-TPP的体内评价
接下来，根据生物学试验部分中的方案进行SPN-PPV-TPP(基于实施例10合成)的体内评价。
用于区分缺氧和常氧环境的体内成像
将脱氧的SPN2.5溶液局部注射到肿瘤中或皮肤下(图58a)。在500nm处激发后，在720nm处采集小鼠的荧光图像，而余辉发光图像是在用白光预照射1min后，使用开放式过滤器以30s的采集时间获得的(图58a)。信号定量清楚地表明，局部注射的皮肤的余辉强度是肿瘤的余辉强度的3.56倍高，而皮肤与肿瘤之间的荧光强度几乎相同(图58b)。这种现象归因于肿瘤的缺氧环境，该缺氧环境具有的低氧水平降低了1O2的产生，并且进而减少了SPN2.5的余辉强度。这些数据表明，SPN2.5的余辉发光可以用于区分活体小鼠中的缺氧与常氧环境。
体内腹膜转移性肿瘤成像
为了测试SPN2.5在转移性肿瘤组织成像中的能力，通过将4T1细胞悬液(200μL，4×105)腹腔注射到裸鼠中来建立腹膜转移性肿瘤小鼠模型。在注射癌细胞后4天，通过尾静脉用SPN2.5对小鼠进行处理。在通过尾静脉注射SPN2.5的注射后采集荧光和余辉图像。在注射后t＝20min，可以观察到来自小鼠肝脏的明显的余辉信号(用黑圈表示)，而肝脏的荧光信号只能在1h后才能检测到(图59a)。这种现象归因于余辉成像的组织穿透性比荧光成像的更高。随着时间的流逝，由于肿瘤部位SPN2.5的积聚，小鼠下象限区域的余辉强度(由白色框表示)逐渐增加(图59a和59c)。在注射后t＝4h，在小鼠下象限区域可检测到明显的余辉信号，而未检测到明显的荧光信号(图59a)。在注射后t＝4h，去除小鼠的皮肤和腹膜，并通过余辉和荧光两者对小鼠的下象限区域进行成像。由于余辉的高灵敏度，可以在肠道上检测到强烈的余辉斑点，而在腹腔中只能检测到自发荧光(图59b)。组织学检查进一步证实了肠道表面上存在肉眼看不见的非常小的转移性肿瘤(图59d)。这些结果表明，SPN2.5可以用作潜在的余辉成像剂用于转移性肿瘤的体内检测。
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Claims (31)

1.一种发射近红外余辉发光的聚合物复合纳米颗粒，所述纳米颗粒包括：
(a)式I的半导体聚合物：
Figure FDA0002358183860000011
(b)任选地，两亲性共聚物；以及
(c)任选地，具有近红外发射的小分子染料，其中：
当存在时，所述两亲性共聚物包封所述式I的半导体聚合物和当存在时的所述小分子染料；以及
在所述式I的聚合物中：
R1至R3和R5独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中1≤q≤50，
R4代表式Ia或式Ib的部分：
Figure FDA0002358183860000012
其中，1≤s≤50且10≤t≤500；
Figure FDA0002358183860000013
其中，1≤u≤50且10≤v≤500；
R6代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中q、s、t、u和v如上所定义；
R7代表单线态氧敏化部分；
n、m和o中的每个均大于或等于0，并且p为0或1，其中n、m、o和p中的至少一个大于0；
A代表式Ic或Id的部分：
Figure FDA0002358183860000021
其中，R8和R11独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中：1≤q≤50；
R9和R12独立地代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中q、s、t、u和v如上所定义；
R10和R13独立地代表单线态氧敏化部分；
当p为1时，则w、x、y和z如果存在，则独立地大于或等于0；以及
当o和p为0时存在所述小分子染料，并且当为以下情况时任选地存在所述小分子染料：
o大于或等于20；
p为1且x或z大于或等于20；
o和x的总和大于或等于20；
o和z的总和大于或等于20；
(o+x)/(n+m+o+w+x)>0.05；或者
(o+z)/(n+m+o+y+z)>0.05；
当m、o和p为0时存在所述两亲性共聚物，并且当为以下情况时任选地存在所述两亲性共聚物：
(m+o+w)/(n+m+o+w+x)>0.1；或者
(m+o+y)/(n+m+o+y+z)>0.1；以及
前提为当n大于0时，m、o和p中的一个或多个也大于0。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中，n为0。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的复合物，其中，p为0。
4.根据权利要求3所述的复合颜料，其中，当为以下情况时，任选地存在所述两亲性共聚物：
m大于或等于20，并且m/(n+m+o)大于0.1且R6为CqH2q+1，其中1≤q≤50；
m大于或等于20，并且(m+o)/(x+y+z)大于0.1，且R6为式Ia的部分或式Ib的部分；或者
o大于或等于20，并且(m+o)/(x+y+z)大于0.1，且R6为式Ia的部分或式Ib的部分。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的复合物，其中，存在所述两亲性共聚物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，当存在时，n、m、o、w、x、y和z中的每个独立地具有5至1000的值。
7.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，所述式I的聚合物的数均分子量为1,000至300,000道尔顿，诸如1,000至100,000道尔顿。
8.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，当存在时，所述单线态氧敏化部分R7、R10和R13独立地选自由以下组成的组中的一种或多种：金属卟啉、金属酞菁、萘酞菁、金属-萘酞菁、二氢卟吩、若丹明、花青、类胡萝卜素、花青素、孟加拉玫瑰红、亚甲基蓝、2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)和基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，所述式I的聚合物选自以下列出的聚合物：
(i)
Figure FDA0002358183860000051
其中，n和m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中n和m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为25,000至200,000道尔顿，诸如45,000至150,000道尔顿，诸如50,000至100,000道尔顿，诸如约59,781道尔顿，和/或聚合物中n个重复单元的摩尔比为约88％且聚合物中m个重复单元的摩尔比为约11％(例如，聚合物中n个重复单元的摩尔比为88.0至89.0％，且聚合物中m个重复单元的摩尔比为11.0至12.0％)；
(ii)
Figure FDA0002358183860000052
其中，m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为15,000至100,000道尔顿，诸如20,000至75,000道尔顿，诸如20,000至50,000道尔顿，诸如约26,565道尔顿；以及
(iii)
Figure FDA0002358183860000061
其中，p为1，并且y和z个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为5,000至20,000道尔顿，诸如7,000至18,000道尔顿，诸如8,900至15,000道尔顿，诸如约13,000道尔顿，和/或聚合物中y个重复单元的摩尔比为85至99％且聚合物中z个重复单元的摩尔比为1至15％(例如，聚合物中y个重复单元的摩尔比为90.0至95.0％，且聚合物中z个重复单元的摩尔比为5.0至10.0％)。
10.根据权利要求1至3和5至9中任一项所述的复合物，其中，所述两亲性共聚物与所述式I的聚合物的重量与重量比为1:1至200:1，诸如1.5:1至100:1，诸如2:1至80:1。
11.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，当存在时，所述具有近红外发射的小分子染料是选自由以下组成的组中的一种或多种的单线态氧敏化化合物：金属卟啉、金属酞菁、萘酞菁、金属-萘酞菁、二氢卟吩、若丹明、花青、类胡萝卜素、花青素、孟加拉玫瑰红、亚甲基蓝、2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)和基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂。
12.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，当存在时，所述两亲性共聚物选自由以下组成的组中的一种或多种：烷基取代的壳聚糖，以及更特别地，聚(烷基)-b-聚(乙二醇)、聚(乙二醇)-b-聚(丙二醇)-b-聚(乙二醇)、聚(乙二醇)甲醚-嵌段-聚(丙交酯-co-乙交酯)(PEG-PLGA)、聚(苯乙烯)-嵌段-聚(丙烯酸)(PS-PAA)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(PSMA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)，任选地，其中所述两亲性共聚物具有的数均分子量为1,000至50,000道尔顿。
13.根据前述权利要求中任一项所述的复合物，其中，所述两亲性共聚物还包括在体外或体内测试部位可被反应性部分切断的淬灭部分。
14.根据权利要求13所述的复合物，其中，所述淬灭部分能够选自由以下组成的组中的一种或多种：
硫醇敏感部分，诸如2,4-二硝基苯基磺酰基(DNBS)部分和
Figure FDA0002358183860000071
活性氧物类敏感部分
Figure FDA0002358183860000081
pH敏感部分，诸如
Figure FDA0002358183860000082
Figure FDA0002358183860000083
肽淬灭剂部分，诸如弗林蛋白酶敏感的Arg-Arg-Val-Arg-淬灭剂、Caspase-3敏感的Asp-Val-Glu-Asp-淬灭剂、成纤维细胞激活蛋白-α(FAPα)敏感的Gly-Pro-淬灭剂、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)敏感的Gly-Arg-Val-Gly-Leu-Pro-淬灭剂、MMP-7敏感的Gly-Met-Trp-Ser-Leu-Pro-Val-淬灭剂、MMP-13敏感的Leu-Gly-Arg-Met-Gly-Leu-Pro-淬灭剂、组织蛋白酶B敏感的Lys-lys-淬灭剂、组织蛋白酶D敏感的Leu-Arg-Phe-Phe-Cys-Ile-Pro-淬灭剂、组织蛋白酶S敏感的Arg-Leu-淬灭剂、尿激酶敏感的Arg-Gly-淬灭剂和Legumain敏感的Asn-Ala-Ala-淬灭剂，
其中，所述淬灭剂是暗淬灭剂。
15.根据权利要求14所述的复合物，其中，所述暗淬灭剂选自黑洞淬灭剂(BHQ)-1、BHQ-2、BHQ-3和QSY-7。
16.根据权利要求13或14所述的复合物，其中，包含淬灭部分的所述两亲性共聚物选自以下中的一种或多种：
Figure FDA0002358183860000091
Figure FDA0002358183860000092
例如，包含淬灭部分的所述两亲性共聚物可以是C18PEG12-DNBS。
17.根据权利要求1至3和5至16中任一项所述的复合物，其中，所述两亲性共聚物选自聚(乙二醇)-b-聚(丙二醇)-b-聚(乙二醇)中的一种或多种(例如，(PEG)100-b-(PPG)65-b-(PEG)100)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)，以及
Figure FDA0002358183860000093
18.式I的半导体聚合物：
Figure FDA0002358183860000101
在所述式I的聚合物中：
R1至R3和R5独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中1≤q≤50，
R4代表式Ia或式Ib的部分：
Figure FDA0002358183860000102
其中，1≤s≤50且10≤t≤500；
Figure FDA0002358183860000103
其中，1≤u≤50且10≤v≤500；
R6代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中q、s、t、u和v如上所定义；
R7代表单线态氧敏化部分；
n、m和o中的每个均大于或等于0；
p为0或1；
A代表式Ic或Id的部分：
Figure FDA0002358183860000111
其中，R8和R11独立地代表式CqH2q+1的烷基链，其中：1≤q≤50；
R9和R12独立地代表式CqH2q+1的烷基链、式Ia的部分或式Ib的部分，其中q、s、t、u和v如上所定义；
R10和R11独立地代表单线态氧敏化部分；
当p为1时，则w、x、y和z如果存在，则独立地大于或等于0；
前提为：
当n大于0时，m、o和p中的一个或多个也大于0；以及
n、m、o和p中的至少一个大于0。
19.根据权利要求18所述的聚合物，其中，n为0。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的聚合物，其中，p为0。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的聚合物，其中，所述式I的聚合物的数均分子量为1,000至100,000道尔顿，诸如1,000至100,000道尔顿。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的聚合物，其中，当存在时，n、m、o、w、x、y和z中的每个独立地具有5至1000的值。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的聚合物，其中，当存在时，所述单线态氧敏化部分R7、R10和R13独立地选自由以下组成的组中的一种或多种：金属卟啉、金属酞菁、萘酞菁、金属-萘酞菁、二氢卟吩、若丹明、花青、类胡萝卜素、花青素、孟加拉玫瑰红、亚甲基蓝、2,3-萘酞菁双(三己基硅氧基)硅烷、卟啉(八乙基卟吩、四苯基卟啉)、酞菁、四吡咯、过渡金属配合物(Ir(III)配合物、Ru(II)配合物、Pt(II)配合物和Os(II)配合物)和基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的光敏剂。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的聚合物，其中，所述式I的聚合物选自以下列出的聚合物：
(i)
Figure FDA0002358183860000121
其中，n和m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中n和m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为25,000道尔顿至200,000道尔顿，诸如45,000道尔顿至150,000道尔顿，诸如50,000道尔顿至100,000道尔顿，诸如约59,781道尔顿，和/或聚合物中n个重复单元的摩尔比为约88％且聚合物中m个重复单元的摩尔比为约12％(例如，聚合物中n个重复单元的摩尔比为88.0至89.0％且聚合物中m个重复单元的摩尔比为11.0至12.0％)；
(ii)
Figure FDA0002358183860000131
其中，m如前述权利要求中任一项所定义，任选地，其中m个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为15,000道尔顿至100,000道尔顿，诸如20,000道尔顿至75,000道尔顿，诸如20,000道尔顿至50,000道尔顿，诸如约26,565道尔顿；
(iii)
Figure FDA0002358183860000141
其中，p为1，并且y和z个重复单元的数目提供的聚合物具有的数均分子量为5,000至20,000道尔顿，诸如7,000道尔顿至18,000道尔顿，诸如8,900道尔顿至15,000道尔顿，诸如约13,000道尔顿，和/或聚合物中y个重复单元的摩尔比为85至99％且聚合物中z个重复单元的摩尔比为1至15％(例如，聚合物中y个重复单元的摩尔比为90.0至95.0％且聚合物中z个重复单元的摩尔比为5.0至10.0％)。
25.根据权利要求1至17中任一项所述的聚合物复合纳米颗粒在制备成像剂中的用途，所述成像剂用于使用余辉发光来诊断深部组织和/或器官中的病症或疾病。
26.根据权利要求25所述的用途，其中，所述用途是体内或体外的。
27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述体内成像用于定位淋巴结和/或可视化肿瘤的目的。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的用途，其中，所述成像剂的制剂用于体内成像以用于图像引导的手术。
29.根据权利要求28所述的用途，其中，所述聚合物复合纳米颗粒为权利要求13至17中任一项所定义的。
30.权利要求13至17中任一项所定义的聚合物复合纳米颗粒在制备用于对受试者肝脏中的氧化应激进行体内成像的方法中的成像剂的用途，所述方法包括以下步骤：将预照射的聚合物纳米颗粒供应到活生物体中，用NIR激光照射可激活的聚合物纳米颗粒，并使用成像系统/装置检测肝脏中的余辉发光。
31.根据权利要求30所述的用途，其中，将所述肝脏中的氧化应激用于确定药物诱导的肝毒性。
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